RT-PCR법을 이용한 백합 바이러스 LSV, LMoV, CMV의 검출 Detection of Lily symptomless virus, Lily mottle virus, and Cucumber mosaic virus from Lilium Grown in Korea by RT-PCR원문보기
2008~2009년에 강원, 충남, 제주 지역의 백합 재배 농가에서 바이러스 감염 증상을 보이는 백합의 잎과 구근을 채취하였으며 RT-PCR 방법으로 Lily mottle virus (LMoV), Lily symptomless virus (LSV), Cucumber mosaic virus (CMV) 등 3 종류의 바이러스를 검출 하였다. LSV 12주, LMoV 20주, CMV 1주가 검출 되었으며 LSV에 감염된 12개의 식물체 중 7개에서는 LMoV도 검출되어 복합 감염된 것을 확인하였다. LMoV와 LSV에 의한 복합 감염은 엽맥투명화, 잎말림, 반점, 모자이크, 황화 줄무늬 등 단독 감염보다 심각한 병징을 나타내었으며 좋지 않은 환경에서 저장된 구근에서도 복합 감염이 관찰되었다. 채집된 식물체는 LMoV 감염이 가장 많았으며 Lily virus X(LVX)에 의한 감염은 검출되지 않았다. 7개 분리주의(LMoV 4주, LSV 2주, CMV 1주) 외피 단백질 유전자를 증폭한 후 염기서열을 분석하여 국내에서 발표된 백합 바이러스 염기서열(LSV:AJ516059, CMV: AJ296154)과 비교 하였으며 LMoV는 국내에서 처음으로 염기서열을 결정하여 기존에 보고된 염기서열(AJ564636)과 비교하였다. 분리주는 기존에 보고된 바이러스와 95~99%의 뉴클레오티드 염기서열 유사성을 보였으며, 이들 분리주의 분자 생물학적 특성을 밝히고 신속하고 정확한 바이러스 진단을 위해서는 전체 염기 서열 분석이 필요한 것으로 판단되었다.
2008~2009년에 강원, 충남, 제주 지역의 백합 재배 농가에서 바이러스 감염 증상을 보이는 백합의 잎과 구근을 채취하였으며 RT-PCR 방법으로 Lily mottle virus (LMoV), Lily symptomless virus (LSV), Cucumber mosaic virus (CMV) 등 3 종류의 바이러스를 검출 하였다. LSV 12주, LMoV 20주, CMV 1주가 검출 되었으며 LSV에 감염된 12개의 식물체 중 7개에서는 LMoV도 검출되어 복합 감염된 것을 확인하였다. LMoV와 LSV에 의한 복합 감염은 엽맥투명화, 잎말림, 반점, 모자이크, 황화 줄무늬 등 단독 감염보다 심각한 병징을 나타내었으며 좋지 않은 환경에서 저장된 구근에서도 복합 감염이 관찰되었다. 채집된 식물체는 LMoV 감염이 가장 많았으며 Lily virus X(LVX)에 의한 감염은 검출되지 않았다. 7개 분리주의(LMoV 4주, LSV 2주, CMV 1주) 외피 단백질 유전자를 증폭한 후 염기서열을 분석하여 국내에서 발표된 백합 바이러스 염기서열(LSV:AJ516059, CMV: AJ296154)과 비교 하였으며 LMoV는 국내에서 처음으로 염기서열을 결정하여 기존에 보고된 염기서열(AJ564636)과 비교하였다. 분리주는 기존에 보고된 바이러스와 95~99%의 뉴클레오티드 염기서열 유사성을 보였으며, 이들 분리주의 분자 생물학적 특성을 밝히고 신속하고 정확한 바이러스 진단을 위해서는 전체 염기 서열 분석이 필요한 것으로 판단되었다.
Leaf samples and bulbs showing characteristic symptoms of virus infection were collected from Gang-won, Chung-nam, and Jeju Province of Korea in 2008-2009. Three viruses, Lily symptomless virus (LSV), Lily mottle virus (LMoV), and Cucumber mosaic virus (CMV) were detected by RT-PCR. Virus-infected p...
Leaf samples and bulbs showing characteristic symptoms of virus infection were collected from Gang-won, Chung-nam, and Jeju Province of Korea in 2008-2009. Three viruses, Lily symptomless virus (LSV), Lily mottle virus (LMoV), and Cucumber mosaic virus (CMV) were detected by RT-PCR. Virus-infected plant samples were identified; 12 plants with LSV, 20 plants with LMoV, and 1 plant with CMV. Of the twelve LSV infected samples, seven samples were found to be mix-infected with LMoV and LSV. Symptoms of LMoV and LSV mixed infection were fairly severe, like as vein clearing, leaf curling, leaf mottling, leaf mosaic, and yellow streaking. Mixed infection with LMoV and LSV was also found in lily bulbs which have been stored under unfavorable environmental conditions. LMoV predominated in our tests, whereas spread of Lilyvirus X (LVX) was not found. The nucleotide sequences of coat protein (CP) region of seven isolates (4 LMoV, 2 LSV, and 1 CMV) were compared with the corresponding regions of LMoV (AJ564636), LSV (AJ516059) and CMV(AJ296154). The nucleotide sequence homologies between reference viruses and seven isolates were 95-99%. Complete sequencing of seven isolates is necessary to obtain more information on the molecular characteristics of these viruses as well as to increase sensitivity and rapidity of viral detection.
Leaf samples and bulbs showing characteristic symptoms of virus infection were collected from Gang-won, Chung-nam, and Jeju Province of Korea in 2008-2009. Three viruses, Lily symptomless virus (LSV), Lily mottle virus (LMoV), and Cucumber mosaic virus (CMV) were detected by RT-PCR. Virus-infected plant samples were identified; 12 plants with LSV, 20 plants with LMoV, and 1 plant with CMV. Of the twelve LSV infected samples, seven samples were found to be mix-infected with LMoV and LSV. Symptoms of LMoV and LSV mixed infection were fairly severe, like as vein clearing, leaf curling, leaf mottling, leaf mosaic, and yellow streaking. Mixed infection with LMoV and LSV was also found in lily bulbs which have been stored under unfavorable environmental conditions. LMoV predominated in our tests, whereas spread of Lilyvirus X (LVX) was not found. The nucleotide sequences of coat protein (CP) region of seven isolates (4 LMoV, 2 LSV, and 1 CMV) were compared with the corresponding regions of LMoV (AJ564636), LSV (AJ516059) and CMV(AJ296154). The nucleotide sequence homologies between reference viruses and seven isolates were 95-99%. Complete sequencing of seven isolates is necessary to obtain more information on the molecular characteristics of these viruses as well as to increase sensitivity and rapidity of viral detection.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
따라서 본 연구에서는 극소량의 바이러스 RNA도 검출 가능한 RT-PCR을 이용하여 현재 우리나라에서 재배되고 있는 백합에 어떤 종류의 바이러스가 존재하는지 알아보고자 하였으며 염기 서열 분석을 통해 향후 좀 더 민감하고 신속한 백합 바이러스 검출 기술 개발을 위한 기초 자료로 활용하고자 하였다.
따라서 본 연구에서는 백합 바이러스 검출을 신속 정확하게 할 내에 존재하는 바이러스들의 염기서열을 분석하고자 하였다.
2008년 9월부터 2009년 4월까지 충남 태안, 강원도 강릉, 제주도 지역을 중심으로 재배되고 있는 백합 생산 단지에서 육안 관찰에 의해 바이러스 병징(엽맥의 투명화, 잎의 모자이크 증상, 엽맥 사이의 황색 줄무늬 등)을 나타내는 백합을 유묘기, 생육중기, 개화기 등 전 생육기간을 통하여 바이러스 존재 유무를 조사하였다. 또한 육안 관찰에 의해 바이러스에 감염된 것으로 의심되는 구근에서도 어떤 종류의 바이러스가 존재하는지 조사하였다.
국내에서 심각한 경제적 피해를 입히는 백합 바이러스는 LMoV, LSV, CMV 등이나 이들 바이러스에 대한 염기서열이나 분자 생물학적 특성에 대한 연구가 제한적으로만 이루어지고 있는 실정이다(1, 3, 6, 7, 10, 11, 13). 본 연구에서는 백합재배 농가의 시료를 대상으로 국내에 유입된 이들 바이러스의 염기서열을 규명함으로써 유전적 변화 정도와 차이점을 외국에서 이미 염기서열 분석이 보고된 strain과 비교하고자 하였으며, 최근 칠레에서 수입한 구근을 재배한 식물체에서 바이러스 감염 여부를 조사 하고자 하였다.
제안 방법
2008년 9월부터 2009년 4월까지 충남 태안, 강원도 강릉, 제주도 지역을 중심으로 재배되고 있는 백합 생산 단지에서 육안 관찰에 의해 바이러스 병징(엽맥의 투명화, 잎의 모자이크 증상, 엽맥 사이의 황색 줄무늬 등)을 나타내는 백합을 유묘기, 생육중기, 개화기 등 전 생육기간을 통하여 바이러스 존재 유무를 조사하였다. 또한 육안 관찰에 의해 바이러스에 감염된 것으로 의심되는 구근에서도 어떤 종류의 바이러스가 존재하는지 조사하였다.
Maxime RT-PCR PreMix에 total RNA 1 µl와 forward primer, reverse primer (10 pmol/µl)를 각각 1 µl를 첨가하여 total reaction양을 20 µl로 맞추었다. RT-PCR 반응조건은 42oC에서 45분간 반응시킨 RT 반응액을 95oC 4분간 1 cycle, 95oC 30초, 50oC 1분, 72oC 30초간 30 cycle, 72oC 7분간 1 cycle의 조건으로 수행하였다. 이렇게 하여 얻은 RT-PCR 산물을 agarose gel 전기영동으로 확인하였다.
바이러스를 검출하기 위해 Maxime RT-PCR PreMix kit (Intron Biotechnology, Korea)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. Maxime RT-PCR PreMix에 total RNA 1 µl와 forward primer, reverse primer (10 pmol/µl)를 각각 1 µl를 첨가하여 total reaction양을 20 µl로 맞추었다.
바이러스의 감염이 의심되는 백합으로부터 total RNA를 추출하였다. 백합 잎과 구근을 마쇄한 분말(50~100 mg)에 trizol reagent를 1 ml 넣고 200 µl chloroform을 처리하였다.
백합으로부터 LSV, LMoV, CMV 및 LVX를 검정하기 위하여 기존에 보고된 이들 각 바이러스의 외피 단백질 유전자의 염기서열 안에서 IDT SciTools PrimerQuest Program (Integrated DNA Technologies, USA)을 이용해 RT-PCR용 primer를 제작하였다(Table 1). 외피 단백질에 변이가 많이 일어나기 때문에 이들 유전자를 primer 제작의 표적으로 삼았다.
RT-PCR 반응조건은 42oC에서 45분간 반응시킨 RT 반응액을 95oC 4분간 1 cycle, 95oC 30초, 50oC 1분, 72oC 30초간 30 cycle, 72oC 7분간 1 cycle의 조건으로 수행하였다. 이렇게 하여 얻은 RT-PCR 산물을 agarose gel 전기영동으로 확인하였다.
따라서 본 연구에서는 백합 바이러스 검출을 신속 정확하게 할 내에 존재하는 바이러스들의 염기서열을 분석하고자 하였다. 이를 위해 Table 2에 나타낸 바와 같이 충남 지역에서 검출된 LMoV 3종과, LSV 1종, 제주 지역의 LMoV, LSV, CMV 각 1종의 coat protein 유전자 염기서열을 결정하여 reference 바이러스 유전자와 비교하였다(Fig. 3, 4, and 5). 충남과 제주에서 분리된 LSV와 CMV는 기존에 국내에 보고된 LSV (AJ 516059), CMV (AJ 296154)의 염기서열과 98~99%의 뉴클레오티드 유사성을 나타내어 바이러스의 변이가 크게 늘어난 것 같지 않았으나 제주에서 분리된 CMV에서는 2개의 뉴클레오티드가 결실되어 있었다.
태안, 아산, 제주에서 채취한 백합에서 검출된 LSV, LMoV 및 CMV의 외피단백질유전자의 염기서열을 분석하기 위해 각 PCR 산물을 TA cloning vector (RBC)에 cloning한 후 염기서열 분석을 의뢰하였다(Macrogen, Korea).
대상 데이터
2008년 9월부터 2009년 4월까지 충남 태안, 강원도 강릉, 제주도 지역의 백합 생산 단지에서 바이러스 병징(엽맥의 투명화, 잎의 모자이크 증상, 엽맥사이의 황색의 줄무늬 등)을 보이는 백합의 잎에서 각각 LSV 4주(4/18), LMoV 11주(11/18), CMV 1주(1/18)가 검출되었다. 또한 저장된 구근 중에서도 육안으로 바이러스에 감염된 것으로 의심되는 구근에서 LSV 8주(8/33), LMoV 9주(9/33)가 검출 되었다(Table 2).
성능/효과
또한 저장된 구근 중에서도 육안으로 바이러스에 감염된 것으로 의심되는 구근에서 LSV 8주(8/33), LMoV 9주(9/33)가 검출 되었다(Table 2). Fig. 1은 제주도 신촌 백합 재배단지에서 재배한 Le Reve (A, B)와 Siberia (C, D) 품종에서 보이는 전형적인 바이러스 병징이며, 이들 시료를 대상으로 RT-PCR 방법으로 바이러스를 검출한 결과 Fig. 2에서 보는 것 같이 칠레에서 수입한 Le Reve 품종에서 LMoV가 검출 되었고(Fig. 2B: lane 3 and 4) Siberia 품종에는 LSV, LMoV, CMV 등 세 종류의 바이러스가 복합 감염되어있는 것을 확인하였다( Fig. 2A and B: lane 10, C: lane 11). Le Reve B에서는 바이러스 병징을 보였으나(Fig.
바이러스가 잎과 구근의 어느 쪽에 더 많이 분포하는지 밝히기 위하여 감염된 백합 채집 시 백합을 뿌리째 뽑아 잎과 구근에서 각각 total RNA를 얻어 RT-PCR로 분석하여 확인한 결과, Fig. 2B의 lane 3과 4(lane 3: 구근, lane 4: 잎), lane 7과 8(lane 7: 구근, lane 8: 잎), lane 9 와 10(lane 9: 구근, lane 10: 잎)에서 보는 바와 같이 잎에 바이러스가 더 많이 분포하고 있어 바이러스 감염 여부를 검정할 때 잎에서 RNA를 얻는 것이 효율적임을 알 수 있었다. 정확한 바이러스 농도 확인을 위해서는 최근에 식물 바이러스 검정에 많이 사용되는 Real-time RTPCR (TaqMan)을 백합 바이러스 검출에 이용하는 것이 필요하다.
이상의 연구 결과로 국내에서 재배되는 백합에 LSV, LMoV, CMV가 품종에 관계없이 단독 혹은 복합 감염되어 있음을 알았으며, 특히 최근에 칠레에서 수입된 구근을 재배한 백합에서 기존의 증상과 다른 새로운 바이러스 증상이 발견 되었으며 LMoV 단독 혹은 LMoV와 LSV에 의한 복합 감염이 관찰되었다. 바이러스로 인한 백합 농가의 피해를 방지하기 위해서는 수입하는 구근에 대한 적절한 기준에 따른 검역이 필요하다.
3, 4, and 5). 충남과 제주에서 분리된 LSV와 CMV는 기존에 국내에 보고된 LSV (AJ 516059), CMV (AJ 296154)의 염기서열과 98~99%의 뉴클레오티드 유사성을 나타내어 바이러스의 변이가 크게 늘어난 것 같지 않았으나 제주에서 분리된 CMV에서는 2개의 뉴클레오티드가 결실되어 있었다. 최근에 재조합 LSV가 보고 되었으나(15), 국내에서 분리한 LSV의 염기서열 분석 결과 국내에는 아직 재조합 LSV가 유행하지는 않는 것으로 판단 된다.
후속연구
따라서 바이러스병이 없는 우량 백합 종구의 획득이 백합 재배농가의 현안 문제다. 신속하고 정확하게 바이러스 감염 여부를 진단할 수 있는 기술의 개발이 우량 구근의 국내 생산을 확대하고 백합의 수출 증대에 기여할 것이다.
충남에서 분리된 LMoV는 네덜란드에서 수입한 구근을 재배한 백합에서 얻은 LMoV 전체 염기서열(AJ 564636)의 coat protein 유전자 염기 서열과 98% 이상 상동성을 나타내었으나 제주에서 분리된 LMoV (LMoV-JJ)는 95%의 상동성을 나타내어 충남 지역의 바이러스와 유전적으로 차이가 있는 것으로 판단되나 확인을 하기 위해서는 다른 유전자 부위의 조사가 필요하다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
국내에서 경제적으로 심각한 피해를 일으키는 백합 바이러스는 무엇이 있는가?
그 외에도 황화현상, 백색괴사 반점, 꽃잎의 위축, 잎의 기형, 식물체의 왜화, 퇴록반점 황화줄무늬 등의 증상이 나타난다. 국내에서 경제적으로 심각한 피해를 일으키는 백합 바이러스는 CMV, LSV, LMoV등이다(3, 13). CMV는 Bromoviridae 과, Cucumovirus 속이며 3개의 single stranded plus-sense RNA로 구성되어 있다.
백합 재배에서 Lily symptomless virus, Cucumber mosaic virus, Lily mottle virus, Lily virus X 등 바이러스의 단독 또는 복합감염으로 생기는 병징은 무엇이 있는가?
백합 재배에서 가장 문제가 되는 병해는 바이러스이며 전 세계적으로 약 20여 종이 알려져 있으며 특히 Lily symptomless virus (LSV), Cucumber mosaic virus (CMV), Lily mottle virus (LMoV), Lily virus X (LVX) 등이 흔히 발견된다(2, 4, 6, 9). 이들 바이러스들이 단독 또는 복합 감염되어 큰 피해를 주고 있으며 병징은 주로 모자이크 증상이 잎에 나타난다. 그 외에도 황화현상, 백색괴사 반점, 꽃잎의 위축, 잎의 기형, 식물체의 왜화, 퇴록반점 황화줄무늬 등의 증상이 나타난다. 국내에서 경제적으로 심각한 피해를 일으키는 백합 바이러스는 CMV, LSV, LMoV등이다(3, 13).
백합 재배에서 가장 문제가 되는 병해는 무엇인가?
백합 재배에서 가장 문제가 되는 병해는 바이러스이며 전 세계적으로 약 20여 종이 알려져 있으며 특히 Lily symptomless virus (LSV), Cucumber mosaic virus (CMV), Lily mottle virus (LMoV), Lily virus X (LVX) 등이 흔히 발견된다(2, 4, 6, 9). 이들 바이러스들이 단독 또는 복합 감염되어 큰 피해를 주고 있으며 병징은 주로 모자이크 증상이 잎에 나타난다.
참고문헌 (18)
Ahn, H.I., J.H. Ryu, J.K. Kim, S.Y. Lee, J.K. Choi, W.M. Park, and K.H. Ryu. 1999. Nucleotide sequence analysis of the 3'-terminal region of two Korean isolates of lily symptomless Carlavirus and expression of the coat protein in E. coli. Mol. Cells 9, 338-343
Chang, M.U. and K.W. Kim. 1996. Virus diseases of ornamental flowering bulbs. J. Kor. Flower Res. Soc. 5, 21-31
Chen, J., Y.H. Shi, M.J. Adams, and J.P. Chen. 2005. The complete sequence of the genomic RNA of an isolate of Lily virus X (genus Potexvirus). Arch. Virol. 150, 825-832
Chen, Y.K., A.F. Derks, S. Langeveld, R. Goldbach, and M. Prins. 2001. High sequence conservation among cucumber mosaic virus isolates from lily. Arch. Virol. 146, 1631-1636
Choi, S.A. and K.H. Ryu. 2003. The complete nucleotide sequence of the genome RNA of Lily symptomless virus and its comparison with that of other carlaviruses. Arch. Virol. 148, 1943-1955
Choi, S.K., J.K. Choi, and K.H. Ryu. 2003. Involvement of RNA2 for systemic infection of Cucumber mosaic virus isolated from lily on zucchini squash. Virus Res. 97, 1-6
Ha, C., S. Coombs, P.A. Revill, R.M. Harding, M. Vu, and J.L. Dale. 2008. Design and application of two novel degenerate primer pairs for the detection and complete genomic characterization of potyviruses. Arch. Virol. 153, 25-36
Huang, C.H. and Y.C. Chang. 2005. Identification and molecular characterization of Zantedeschia mild mosaic virus, a new calla lily-infecting potyvirus. Arch. Virol. 150, 1221-1230
Kim, J.Y., S.T. Choi, and H.T. Hsu. 1995. Comparision of detection efficiency of lily symptomless virus in lily bulbs by ELISA, DBIA and tissue blotting method. J. Kor. Soc. Hort. Sci. 36, 560-566
Kwon, S.B., J.H. Ha, J.Y. Yoon, and K.H. Ryu. 2002. Zantedeschia mosaic virus causing leaf mosaic symptom in calla lily is a new potyvirus. Arch. Virol. 147, 2281-2289
Niimi, Y., T. Gondaira, Y. Kutsuwada, and H. Tsuji. 1999. Detection by ELISA and DIBa tests of lily symptomless virus (LSV), tulip breaking virus-lily (TBV-L) and cucumber mosaic virus (CMV) in Lilium spp. grown in the field. J. Japan Soc. Hort. Sci. 68, 176-183
Park, K.I., J.D. Choi, I.S. Park, S.J. Eum, and K.W. Kim. 2003. Virus-infected status in imported bulbs of Lilium oriental hybrids. Kor. J. Hort. Sci. Technol. 21, 57-61
Schneider, W.L., D.J. Sherman, A.L. Stone, V.D. Damsteegt, and R.D. Frederick. 2004. Specific detection and quantification of Plum pox virus by real-time fluorescent reverse transcription-PCR. J. Virol. Methods 120, 97-105
Singh, A.K., B.K. Mahinghara, V. Hallan, R. Ram, and A.A. Zaidi. 2008. Recombination and phylogeographical analysis of Lily symptomless virus. Virus Gen. 36, 421-427
Sugiyama, S., C. Masuta, H. Sekiguchi, T. Uehara, H. Shimura, and Y. Maruta. 2008. A simple, sensitive, specific detection of mixed infection of multiple plant viruses using macroarray and microtube hybridization. J. Virol. Methods 153, 241-244
Wu, J.X., C.K. Liu, J. Hong, W.H. Liu, and M.Q. Ye. 2005. Production of monoclonal antibodies to Lily symptomless virus and application in lily virus detection. Wei Sheng Wu Xue Bao 45, 580-583
Zheng, H.Y., J. Chen, M.F. Zhao, L. Lin, J.P. Chen, J.F. Antoniw, and M.J. Adams. 2003. Occurrence and sequences of Lily mottle virus and Lily symptomless virus in plants grown from imported bulbs in Zhejiang province, China. Arch. Virol. 148, 2419-2428
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.