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문제 정의
- 본 연구에서는 우선 아미노산의 일종인 proline의 합성에 관여 하는 세 유전자의 발현이 RpoS 전자조절 인자에 의해 조절됨을 발견하였고, 따라서 이들 세 유전자의 발현을 rpoS 돌연변이에 의해 탈 억제시킨 결과 이 돌연변이 세균에서 해당 최종 산물인 proline의 합성이 증가함으로 보여주고자 하였다. 아울러 이 돌연 변이 균주가 다른 종류의 아미노산 합성에 어떤 효과를 미치는 지를 조사하였다.
- 아미노산 중 proline 생합성을 증진시키기 위해 다양한 대사길 항물질(analog)을 사용하거나 되먹임억제(feedback inhibition)를 조절하는 등의 기법이 알려져 있다(4, 6, 7). 본 연구에서는 이러한 고전적인 방법 외에 대장균에서 global 조절자(global regulator)로 사용되고 있는 RpoS를 암호화하는 rpoS에 돌연변이를 유발시킴으로써, proline의 생합성을 증진시키고자 하였다.
- 본 연구에서는 우선 아미노산의 일종인 proline의 합성에 관여 하는 세 유전자의 발현이 RpoS 전자조절 인자에 의해 조절됨을 발견하였고, 따라서 이들 세 유전자의 발현을 rpoS 돌연변이에 의해 탈 억제시킨 결과 이 돌연변이 세균에서 해당 최종 산물인 proline의 합성이 증가함으로 보여주고자 하였다. 아울러 이 돌연 변이 균주가 다른 종류의 아미노산 합성에 어떤 효과를 미치는 지를 조사하였다.
제안 방법
- 4 mM의 dNTP, 4 mM의 MgCl2, 대장균 cDNA, 그리고 10 U의 Taq DNA polymerase를 첨가하였다. PCR은 DNA thermal cycler (Perkin-Elmer Cetus)에서 수행하였다.
- proB-F (aaccgtgcccatatcgttgaac), proB-R (aaatgcctt ccatcacatcacc), proA-F (ccgatgaactggaagcacaaag), proA-R (tccgcca tttgtttgcttaatg), proC-F (aatatgggaaaagccattctcg), proC-R (ccgg tgagcagaccatatcttt). 각 PCR tube에는 PCR 버퍼와(500 mM KCl, 200 mM Tris-Cl; pH 7.4) 50 pmol의 올리고 뉴클레오타이드 프라이머, 0.4 mM의 dNTP, 4 mM의 MgCl2, 대장균 cDNA, 그리고 10 U의 Taq DNA polymerase를 첨가하였다. PCR은 DNA thermal cycler (Perkin-Elmer Cetus)에서 수행하였다.
- 아미노산 분석을 위한 세포시료를 우선 5% TCA에 희석한 후 15분간 원심분리하였다. 그 후 0.02 N HCl에 희석한 후 필터링 하여 아미노산 분석 시료를 제작하였다.
- 앞선 결과에서 rpoS 돌연변이 세포주에서는 세포정지기에서 proBA와 proC 유전자의 음성적 조절이 일어나지 않음을 보았다. 따라서 이러한 계속적인 proBA와 proC 유전자의 전사발현 결과 궁극적으로 세포정지기에서도 proline의 합성이 유도되는지를 조사하기 위해 아미노산 분석을 수행하였다. 이를 위해 야생형과 rpoS 돌연변이 세포주를 LB 배지에서 배양하면서 세포정지기에서 각각 시료를 취득하여 proline 분석을 실시하였다.
- 특정 배양시간에서 수득된 대장균 세포 배양액은 QIAGEN RNA Isolation kit를 이용하여 RNA를 수득하였다. 수득된 RNA 로부터 cDNA 합성키트((주) Intron, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하여 차후의 실험에 이용하였다.
- 이들 세 유전자 proBA와 proC의 전사발현 양상을 조사하기 위해 야생형 QC2461과 그의 rpoS 돌연변이 균주를 LB 배지에서 배양한 후 각각 세포지수기와 세포정지기에서 RNA를 분리하여 cDNA를 합성한 후, 이렇게 합성된 cDNA를 주형으로 하여 proBA와 proC 유전자의 전사발현을 PCR 기법으로 분석하여 보았다. 그 결과 야생형 대장균에서는 proBA와 proC 유전자 모두지수기에서는 크게 발현되지만, 세포정지기에서는 그의 발현이 극적으로 억제되고 있는 것을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 따라서 이러한 계속적인 proBA와 proC 유전자의 전사발현 결과 궁극적으로 세포정지기에서도 proline의 합성이 유도되는지를 조사하기 위해 아미노산 분석을 수행하였다. 이를 위해 야생형과 rpoS 돌연변이 세포주를 LB 배지에서 배양하면서 세포정지기에서 각각 시료를 취득하여 proline 분석을 실시하였다. 그 결과 rpoS 돌연변이 균주에서는 야생형에 비해 약 2.
- 특정 배양시간에서 수득된 대장균 세포 배양액은 QIAGEN RNA Isolation kit를 이용하여 RNA를 수득하였다. 수득된 RNA 로부터 cDNA 합성키트((주) Intron, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하여 차후의 실험에 이용하였다.
- 한편, proline 외에도 다른 아미노산들이 야생형과 rpoS 돌연변이 세포주에서 생합성되는 정도를 비교하여 보았다. Fig.
대상 데이터
- 기기로는 HITACHI L8900 Amino Acid Analyzer를 사용하였으며 main column으로는 HITACHI HPLC Packed Column #2622PF Column (4.6×60 mm) ion exchange column을 사용하였다.
- 본 연구에서 사용한 대장균 균주 K-12는 야생형 균주로서 QC2461 (9)을 사용하였다. 상기의 야생형 균주로부터 개발된 rpoS 돌연변이 균주는 P1 형질전환(P1 transduction) 방법을 이용하여 개발된 QC2461, rpoS::Tn10 (13) 균주를 사용하였다.
- 시료분석을 위해 각 시험관에 ninhydrin 반응액 1 ml과 완충액(PH-1) 1 ml을 각각 추가한 후 같은 조건에서 3분간 100o C에서 가열 반응시켰다. 사용 용액으로는 Wako L-8500 buffer solution PF-1, 2,3,4, RG ninhydrin coloring solution set을 사용하였으며, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 검출기는 VIS1: 570 nm, VIS2: 440 nm, UV detector와 EZ chrom Elite ver.
- 본 연구에서 사용한 대장균 균주 K-12는 야생형 균주로서 QC2461 (9)을 사용하였다. 상기의 야생형 균주로부터 개발된 rpoS 돌연변이 균주는 P1 형질전환(P1 transduction) 방법을 이용하여 개발된 QC2461, rpoS::Tn10 (13) 균주를 사용하였다.
데이터처리
- 사용 용액으로는 Wako L-8500 buffer solution PF-1, 2,3,4, RG ninhydrin coloring solution set을 사용하였으며, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 검출기는 VIS1: 570 nm, VIS2: 440 nm, UV detector와 EZ chrom Elite ver. 3.1.5b 분석프로그램을 사용 하였다.
- 비교 기준으로 사용한 유리아미노산 표준시료로 Wako PF standard (Type B, 016-08641)를 사용하였으며 표준시료와의 흡 광도 값을 비교하여 희석률을 결정하였다.
이론/모형
- 아미노산은 충남대학교 공동실험관의 도움을 받아 ninhydrin을 이용한 post-reaction법으로 분석하였다. 기기로는 HITACHI L8900 Amino Acid Analyzer를 사용하였으며 main column으로는 HITACHI HPLC Packed Column #2622PF Column (4.
- 연쇄중합사슬반응(polymerization chain reaction, PCR)은 기존의 방법대로 수행하였으며(21), 사용된 올리고뉴클레오타이드는 다음과 같다. proB-F (aaccgtgcccatatcgttgaac), proB-R (aaatgcctt ccatcacatcacc), proA-F (ccgatgaactggaagcacaaag), proA-R (tccgcca tttgtttgcttaatg), proC-F (aatatgggaaaagccattctcg), proC-R (ccgg tgagcagaccatatcttt).
성능/효과
- Fig. 1에서 보듯이 proline 합성에 주되게 관여하는 proBA와 proC 세 유전자의 발현이 RpoS에 의해 강하게 조절됨을 보았고, 그 결과 rpoS 돌연변이 세포주에서 proline 합성이 야생형에 비해 2배 이상이 증가함을 알 수 있었다. 이러한 방법은 기존의 관련 생합성 경로에 국한되는 대사공학적 접근방법(예, 되먹임 저해 등)과는 차별화된 것으로서 미생물 전체 유전발현을 조절하는 조절자의 발현을 조절함으로써 아미노산 합성을 증진시키고자 하는 방법이다.
- 한편, proline 외에도 다른 아미노산들이 야생형과 rpoS 돌연변이 세포주에서 생합성되는 정도를 비교하여 보았다. Fig. 3에서 보듯이 threonine, methionine, lysine, arginine 등이 야생형 대비 2배 이상 생합성이 증가되는 것을 알 수 있었다.
- 이를 위해 야생형과 rpoS 돌연변이 세포주를 LB 배지에서 배양하면서 세포정지기에서 각각 시료를 취득하여 proline 분석을 실시하였다. 그 결과 rpoS 돌연변이 균주에서는 야생형에 비해 약 2.5배 정도의 proline이 더 합성되고 있음을 보았다(Fig. 2). 이상의 결과는 결국 rpoS 돌연변이 균주에서 보이는 높은 수준의 proBA와 proC 전사발현으로 인해 해당 proline 생합성 경로가 활성화되고 그결과 proline 생합성이 효율이 높음을 의미한다.
- 이들 세 유전자 proBA와 proC의 전사발현 양상을 조사하기 위해 야생형 QC2461과 그의 rpoS 돌연변이 균주를 LB 배지에서 배양한 후 각각 세포지수기와 세포정지기에서 RNA를 분리하여 cDNA를 합성한 후, 이렇게 합성된 cDNA를 주형으로 하여 proBA와 proC 유전자의 전사발현을 PCR 기법으로 분석하여 보았다. 그 결과 야생형 대장균에서는 proBA와 proC 유전자 모두지수기에서는 크게 발현되지만, 세포정지기에서는 그의 발현이 극적으로 억제되고 있는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 1C). 이에 비해, rpoS 돌연변이주는 지수기에서는 야생형과 동일한 수준으로 proBA와 proC 유전자의 전사발현이 유도되었으나, 세포정지기에서는 야생형과는 달리 proBA와 proC 유전자의 발현이 억제 되지 않고, 지수기에서와 비슷한 정도로 발현이 유지되고 있었다 (Fig.
- RpoS 인자는 세포가 세포정지기에 들어갈 때 지수기에서 활발히 합성되던 다양한 산물의 생산을 억제시키는 기능을 가지고 있는 global 조절자로서 작용한다. 따라서 세포정지기에 더 이상합성의 증진이 불필요한 아미노산이 RpoS에 의해 조절 받음을 보여준 본 연구 결과는 기존의 세포생리학적 기능연구에 부합하는 결과라고 할 수 있다. 즉, 이러한 기능을 갖는 RpoS를 유전적으로 돌연변이시킴으로써 결국 세포는 세포정지기에서도 아미노산을 꾸준히 만들어 낼 수 있는 환경에 놓여 있게 되는 것이라고 결론 내릴 수 있다.
- 이상의 결과는 결국 rpoS 돌연변이 균주에서 보이는 높은 수준의 proBA와 proC 전사발현으로 인해 해당 proline 생합성 경로가 활성화되고 그결과 proline 생합성이 효율이 높음을 의미한다. 따라서 이 rpoS 균주를 이용하여 proBA와 proC 유전자의 음성적 조절 기작을 제거함으로써 결국 proline 생합성을 증진시킬 수 있게 됨을 알수 있었다.
- 앞선 결과에서 rpoS 돌연변이 세포주에서는 세포정지기에서 proBA와 proC 유전자의 음성적 조절이 일어나지 않음을 보았다. 따라서 이러한 계속적인 proBA와 proC 유전자의 전사발현 결과 궁극적으로 세포정지기에서도 proline의 합성이 유도되는지를 조사하기 위해 아미노산 분석을 수행하였다.
- 2). 이상의 결과는 결국 rpoS 돌연변이 균주에서 보이는 높은 수준의 proBA와 proC 전사발현으로 인해 해당 proline 생합성 경로가 활성화되고 그결과 proline 생합성이 효율이 높음을 의미한다. 따라서 이 rpoS 균주를 이용하여 proBA와 proC 유전자의 음성적 조절 기작을 제거함으로써 결국 proline 생합성을 증진시킬 수 있게 됨을 알수 있었다.
- 즉, 본 연구팀에서는 세포지수기에서 합성이 증진되고 세포정지기에서 억제되어야 할 TCA 회로 중의한 유전자인 이소시트릭산 탈소수화효소(isocitrate dehydrogenase) 의 활성을 조사해 본 결과 rpoS 돌연변이주에서는 기대대로 세포 정지기에서도 그의 발현이 감소하지 않았다(14). 이상의 결과는 결국 세포정지기에서 작동하는 RpoS의 기능을 차단함으로써 이때 발현이 억제되어야 할 유전자의 발현, 즉 TCA cycle 유전자및 아미노산 합성 관련 유전자의 발현 억제에 실패하게 함으로써 해당 유전자의 활성을 증진시키게 할 수 있는 새로운 방법이다.
- 1C). 이상의 결과는 세포정지기에서 발현이 유도되어 해당 시기에서 다양한 유전자의 전사발현을 관장하는 유전자인 rpoS 를 돌연변이 시킨 결과 세포정지기에서 발현이 억제되어야 할 proline 합성 관련 유전자의 억제가 일어나지 않았음을 의미한다. 이것은 결국 RpoS 인자가 proBA와 proC 전사발현의 음성적 조절인자임을 의미하는 것으로 세포가 정지기에 들어서도 proBA와 proC 유전자가 고발현되고 있음을 나타낸다.
- 1C). 이에 비해, rpoS 돌연변이주는 지수기에서는 야생형과 동일한 수준으로 proBA와 proC 유전자의 전사발현이 유도되었으나, 세포정지기에서는 야생형과는 달리 proBA와 proC 유전자의 발현이 억제 되지 않고, 지수기에서와 비슷한 정도로 발현이 유지되고 있었다 (Fig. 1C). 이상의 결과는 세포정지기에서 발현이 유도되어 해당 시기에서 다양한 유전자의 전사발현을 관장하는 유전자인 rpoS 를 돌연변이 시킨 결과 세포정지기에서 발현이 억제되어야 할 proline 합성 관련 유전자의 억제가 일어나지 않았음을 의미한다.
- 따라서 세포정지기에 더 이상합성의 증진이 불필요한 아미노산이 RpoS에 의해 조절 받음을 보여준 본 연구 결과는 기존의 세포생리학적 기능연구에 부합하는 결과라고 할 수 있다. 즉, 이러한 기능을 갖는 RpoS를 유전적으로 돌연변이시킴으로써 결국 세포는 세포정지기에서도 아미노산을 꾸준히 만들어 낼 수 있는 환경에 놓여 있게 되는 것이라고 결론 내릴 수 있다. 이러한 결과는 본 연구팀에서 수행한다른 결과와도 일치한다.
후속연구
- 한편, 세포는 세포 정지기에 들어갈 때 세포의 효율적 측면에서 볼 때 관련 아미노산의 합성 및 RNA의 합성을 감소시켜야 할 필요가 있는데 이러한 이유로 세포 정지기에 들어가게 되면, 세포에서 아미노산 합성이 크게 감소하게 된다. 따라서 RpoS 인자의 억제를 통해 아미노산의 대량생산이 가능할 것으로 기대되었다.
- 한편, 유용산물의 대량생산을 위한 전통적인 숙주균주의 개발을 위해 해당 생합성 경로에 관여하는 유전자의 과발현 및 해당 유전자의 돌연변이를 통한 저발현을 유도하려는 시도가 있어오고 있는데(5, 20, 23), 성공적인 대량생산을 위해서는 이러한 시도 외에도 과발현 및 저발현에서 나타날 수 있는 대체경로의 이해 및 유전체 전체적인 측면에서의 글로벌 네트워크(global network)적 측면에서의 이해는 아직 요원한 실정이다. 따라서 상기에 서술한 다양한 방법 외에도 해당 경로에 상위 단계에서 직간접적으로 관여하는 유전적 요인들을 찾아내어 적절히 이용한다면 좀 더 높은 효율의 숙주 균주를 개발할 수 있을 것으로 사료된다.
- 비록 RpoS가 해당 아미노산 합성에 관여하는 유전자들의 발현에 미치는 효과를 규명하지는 못했지만, 이러한 결과는 아미 노산 생합성이 단지 RpoS의 음성효과 억제라는 측면 외에도 전술한 바와 같이 되먹임억제 등 다른 생리학적 기작에 의해서도 일어남을 의미한다. 따라서 앞으로는 다른 아미노산에 대한 RpoS의 효과를 유전자 차원에서 발현조사 연구가 뒤따라야 할것이며 관련된 global 조절자에 대한 효과 역시 살펴보아야 할것으로 판단된다.
- 비록 기존의 잘 알려진 아미노산 합성 숙주 균주인 Corynebacterium에서 이와 유사한 전사조절인자가 존재하는지 여부는 밝혀지지 않았으나, RpoS 단백질의 일차적 기능이 RNA 중합효소(RNA polymerase)이기 때문에 Corynebacterium에서도 이와 유사한 단백질이 존재할 가능성이 크다고 할 수 있다. 따라서 향후 Corynebacterium에서 대장균에서와 유사한 RpoS 단백질이 존재하는지 여부를 조사할 필요가 있다고 판단된다. 아울러 대장균에서도 향후 적절한 대사공학적 기법을 이용하여 이미 숙주균주로 개발되어 이용되고 있는 균주에 본 연구에서 개발된 rpoS 돌연변이 주를 함께 이용한다면좀 더 높은 효율의 아미노산을 생산할 수 있으리라 기대된다.
- 따라서 향후 Corynebacterium에서 대장균에서와 유사한 RpoS 단백질이 존재하는지 여부를 조사할 필요가 있다고 판단된다. 아울러 대장균에서도 향후 적절한 대사공학적 기법을 이용하여 이미 숙주균주로 개발되어 이용되고 있는 균주에 본 연구에서 개발된 rpoS 돌연변이 주를 함께 이용한다면좀 더 높은 효율의 아미노산을 생산할 수 있으리라 기대된다.
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