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문제 정의
- PCR로 증폭된 분리균의 16S rRNA 유전자는 GenBank database에 있는 세균들과의 계통발생학적 관계를 조사하기 위해 사용되었다. 분리균의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 결정하여 최종적으로 얻은 1453 개의 염기의 서열에 대한 정보는 GenBank database에 등록하였다(accession number, AY646154).
- 생물학적 복원을 위한 전략을 세우기 위해서는 그 지역에 존재하는 석유계 탄화수소 분해 생물의 존재와 더불어 그 들의 분해능을 확인할 필요가 있다. 따라서 본 연구에서는 생물학적 복원전략을 위한 기초 정보를 얻기 위해 경유로 오염된 지역에 존재하는 토착 미생물 중에서 우점 개체군으로 분리된 균주의 계통발생학적 위치를 조사하고 석유계 탄화수소를 분해하는 특성을 조사하였다.
- 본 연구에서는 국내의 한 경유 오염지역의 생물학적 복원전략을 위한 기초 정보를 얻기 위해 경유로 오염된 지역에 존재 하는 토착 미생물 중에서 우점 개체군으로 분리된 균주의 계통발생학적 위치를 조사하고 석유계 탄화수소를 분해하는 특성을 조사하였다.
제안 방법
- Sphingomonas sp. 3Y는 phenanthrene을 유일 탄소원으로 사용하는 MSM배지에서 phenanthrene을 분해하며 성장하는 것을 OD의 증가로서 측정하였다(Fig. 2). Sphingomonas sp.
- Aromatic ring dioxygenase는 indole로부터 indigo를 형성할 수 있는 것으로 보고되었으므로 indole을 사용하여 문헌[1]에 기술된 것과 같이 분리균의 aromatic ring dioxygenase 활성을 조사하였다. 한편 benzene 환을 깨는 효소인 meta-cleavage dioxygenase의 활성은 0.
- GenBank에 등록되어 있는 유연 미생물들, Sphingomonas 속 type strains, 그리고 지금까지 보고된 대표적인 Sphingomonas속에 해당하는 석유계 탄화수소 분해균들의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 수집한 후 재료 및 방법에 기술한 것과 같이 계통수를 작성하였다(Fig. 1). 16S rRNA 유전자를 바탕으로 한 계통수에 의하면 다양한 석유계 탄화수소를 분해하는 것으로 보고된[7] Sphingomonas sp.
- 본 연구에 사용된 토양시료에 존재하는 토착세균 중에서 phenanthrene spray plate 법에 의해 양성을 나타낸 세균들은 대부분 노란색의 집락을 형성하였다[1]. Phenanthrene spray plate 법에 의해 양성을 나타낸 균주 중에서 비교적 성장을 잘하고 phenanthrene spray plate 법을 실시하였을 때 투명환이 큰 균주를 순수 분리하여 3Y라고 명명하고 석유계 탄화수소분해특징을 조사하였다.
- 본 연구에 사용된 방향족 탄화수소는 benzene, toluene, ethyl benzene, o-xylene, m-xylene, p-xylene, phenol, biphenyl, naphthalene, 그리고 phenanthrene이었다. Phenanthrene을제외한 방향족 화합물의 분해능은 지방족 화합물의 분해능 조사방법과 같이 특정 방향족 화합물을 유일 탄소원으로 사용한 성장여부로서 판단하였다. 이 때 각 방향족 화합물은 증기 상태로 공급해주었다.
- 본 연구에 사용된 지방족 탄화수소는 hexane, hexadecane, 그리고 chloroform이었다. 각 지방족 탄화수소의 분해능은 그 화합물을 유일 탄소원으로 공급하여 평판배지에서 14일 배양 후 집락 형성 유무에 따라 판단하였다. MSM agar 배지에 균주를 접종하고, Petri dish 뚜껑에 각 화합물을 두어 증기상태로 균주에 공급하였으며 각 Petri dish는 비닐봉지로 봉하여 탄소원의 증기가 밖으로 세지 않게 하였다.
- 지방족 화합물로서는 hexane과 hexadecane을 이용하여 성장하였고, 한편 방향족 화합물로서는 BTEX는 물론이고 phenol, biphenyl, 또는 phenanthrene을 유일 탄소원으로 이용하여 성장하였다. 본 균주는 indole과 catechol을 이용한 실험결과 방향족 탄화수소의 생분해 과정에서 맨 첫 단계 반응에 관여하는 효소인 aromatic ring dioxygenase 활성과 benzene 환을 깨는 효소인 meta-cleavage dioxygenase 활성을 나타내었다. Sphingomonas sp.
- 분리균으로부터 total DNA를 추출하여 PCR로 16S rRNA 유전자를 증폭하는데 사용하였다. Primers로는 27f와 1492r를 사용하여 total DNA로부터 약 1.
- Phenanthrene이 남겨진 플라스크에 멸균된 MSM 배지 40 ml을 넣어 150 rpm에서 12시간 진탕 하여 phenanthrene이 포화된 MSM 배지를 만들었다. 여기에 phenanthrene을 포함하는 MSM배지에서 전배양된 균주를 취하여 접종하였다. 전배양은 YEPG 평판배지에서 colony를 한 백금이 취하여 phenanthrene과 20 ml MSM이 포함된 125 ml 플라스크에 접종하여 150 rpm에서 배양한 후 대수 증식기 때 취하여 접종균으로 사용하였다.
- Primer 27f와 1492r의 염기서열(5’에서 3’)은 각각 CGATCCCCTGCTTTTCTCC와 AGAGTTTGATCMTG GCTCAG이었다. 이 PCR 산물은 솔젠트㈜(대전, 대한민국)에 의뢰하여 Applied Biosystems 3730XL capillary DNA Sequencer (Foster City, CA, USA)를 사용하여 부분적으로 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 BLASTN (version 2.
- 3Y는 지방족 화합물은 물론이고 방향족 화합물을 이용해서 성장할 수 있었다. 지방족 화합물로서는 hexane과 hexadecane을 이용하여 성장하였고, 한편 방향족 화합물로서는 BTEX는 물론이고 phenol, biphenyl, 또는 phenanthrene을 유일 탄소원으로 이용하여 성장하였다. 본 균주는 indole과 catechol을 이용한 실험결과 방향족 탄화수소의 생분해 과정에서 맨 첫 단계 반응에 관여하는 효소인 aromatic ring dioxygenase 활성과 benzene 환을 깨는 효소인 meta-cleavage dioxygenase 활성을 나타내었다.
- 달리 언급하지 않는 미생물 배양은 25℃에서 실시하였다. 특정 석유계 탄화수소에서의 성장은 동일 실험을 2번 이상 실시하여 그 성장여부를 결정하였다.
- 한편 휘발성이 없는 phenanthrene의 경우는 phenanthrene spray plate assay로 먼저 분해능을 조사하고 또한 phenan-threne을 유일 탄소원으로 포함하는 MSM배지에서의 성장은 600 nm에서 OD증가로 측정하였다. Phenanthrene 10 mg을 0.
대상 데이터
- 1%(w/v) pyrophosphate buffer에서 vortex 처리한 후 연속 희속하여 YEPG agar 배지에 도말한 후 25℃에서 4일 배양하였다[1]. Colony가 형성된 agar 배지에 phenanthrene spray plate assay를 실시하여 colony 주위에 투명환을 형성하는 균주는 phennathrene 분해능이 있을 가능성이 큰 것으로 간주하고 순수 분리하여 본 연구에 사용하였다[1].
- 경유의 경우 지방족 탄화수소가 부피의 최고 90%를 차지하며 C14-C20 alkanes이 주를 이룬다[7]. 그래서 이 성분들에 대한 모델 화합물로서 hexadecane (C16)을 본 연구에서 사용하였다. Hexadecane은 경유의 alkanes (경유 범위 유기화합물에 해당하는 C10-C24) 중에서 가장 높은 비율(22.
- 본 연구에 사용된 균주 3Y는 지하 3.5 m 오염층에서 채취한 토양시료에서 분리하였다. 채취한 토양은 0.
- 본 연구에 사용된 균주가 분리된 곳은 경유로 15년간 오염된 국내의 한 군부대내 지역으로서 이곳은 지하 3.5 m부터 오염층이 존재하였다. 오염토양은 pH 6.
- 본 연구에 사용된 방향족 탄화수소는 benzene, toluene, ethyl benzene, o-xylene, m-xylene, p-xylene, phenol, biphenyl, naphthalene, 그리고 phenanthrene이었다. Phenanthrene을제외한 방향족 화합물의 분해능은 지방족 화합물의 분해능 조사방법과 같이 특정 방향족 화합물을 유일 탄소원으로 사용한 성장여부로서 판단하였다.
- 본 연구에 사용된 지방족 탄화수소는 hexane, hexadecane, 그리고 chloroform이었다. 각 지방족 탄화수소의 분해능은 그 화합물을 유일 탄소원으로 공급하여 평판배지에서 14일 배양 후 집락 형성 유무에 따라 판단하였다.
- Phenanthrene과 hexadecane은 석유계 방향족과 지방족 탄화수소를 대표하는 화합물로 사용되었다. 본 연구에 사용된 토양시료에 존재하는 토착세균 중에서 phenanthrene spray plate 법에 의해 양성을 나타낸 세균들은 대부분 노란색의 집락을 형성하였다[1]. Phenanthrene spray plate 법에 의해 양성을 나타낸 균주 중에서 비교적 성장을 잘하고 phenanthrene spray plate 법을 실시하였을 때 투명환이 큰 균주를 순수 분리하여 3Y라고 명명하고 석유계 탄화수소분해특징을 조사하였다.
- 2. 본 연구에 사용된 화합물은 Aldrich Chemical Company, Inc. (Milwaukee, WI, USAS)로부터 구입하였으며 가장 순도가 높은 것이었다.
데이터처리
- 검색 결과를 토대로 하여 유연 미생물들의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 수집한 후, CLUSTAL X 프로그램을 사용하여 multiple alignment를 수행하였다[9]. Multiple alignment의 결과를 TreeVeiw 프로그램상에서 neighbor-joining법으로 계통수를 작성하였으며 Boot strap은 1,000번을 수행하였다.
이론/모형
- 검색 결과를 토대로 하여 유연 미생물들의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 수집한 후, CLUSTAL X 프로그램을 사용하여 multiple alignment를 수행하였다[9]. Multiple alignment의 결과를 TreeVeiw 프로그램상에서 neighbor-joining법으로 계통수를 작성하였으며 Boot strap은 1,000번을 수행하였다.
- 이 PCR 산물은 솔젠트㈜(대전, 대한민국)에 의뢰하여 Applied Biosystems 3730XL capillary DNA Sequencer (Foster City, CA, USA)를 사용하여 부분적으로 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 BLASTN (version 2.2.10)을 이용하여 GenBank database에서 가장 비슷한 염기서열을 찾는데 사용하였다[5].
성능/효과
- JS5와 Sphingomonas sp. MBIC3990의 16S rRNA 유전자의 염기서열과 가장 비슷한 것(98%)으로 나타났다.
후속연구
- 다양한 석유계 탄화수소 성분을 이용하여 성장하는 Sphingomonas sp. 3Y는 유류로 오염된 토양의 복원에 유용하게 사용될 것으로 여겨지며 이 균주의 최적 분해 조건을 조사 한다면 그 결과는 이 균주가 분리된 오염지역의 생물학적 분해를 최적화하는데 기여할 것이다.
- 3Y는 방향족 탄화수소와 지방족 탄화수소를 포함하는 다양한 석유계 탄화수소를 유일 탄소원으로 성장하는 것으로 나타나 유류성분의 분해에 유용할 것으로 여겨진다. 이 균주가 분리된 경유 오염지역에 이미 적응된 토착미생물인 이 균주의 최적 분해 조건을 향후 조사한다면 그 결과는 그 오염지역의 생물학적 분해를 최적화하는데 기여할 것이다.
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