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문제 정의
- 二妙散과 그 구성약물인 蒼朮, 黃栢이 iNOS의 발현에 의한 NO의 생성에 미치는 영향과, rheumatoid arthritis유발 원인으로 알려진 다양한 cytokine(IL-1β, IL-6, TNF-α) 그리고 prostaglandin E2(PGE2)의 생성에 미치는 영향 및 관절염의 동물모델 실험을 통하여 ankylosis를 관찰한 결과를 보고하고자 합니다.
- 특히 二妙散은 筋肉과 骨格의 교원, 결합조직에서 생기는 病症을 治療하는 淸熱瀉濕湯, 三妙丸, 疎風活血湯, 淸燥湯, 二炒蒼栢散, 蒼朮復煎散, 滋血養筋湯, 養血壯筋健步丸 等의 重要 한 基本方이다. 따라서 二妙散과 構成藥物이 rheumatoid arthritis와 깊은 관련성이 있음을 착안하여 본 연구를 시도하였으며, 그 내용을 살펴보면 다음과 같다.
- Rheumatoid arthritis의 유발 및 진행과정에는 osteoblasts, chondrocytes, fibroblasts 그리고 Th1/Th2 cells이 관여하고 있다. 따라서 본 연구에서는 rat osteoblast sarcoma cells인 ROS17/2.8에서 NO의 생성에 미치는 二妙散 및 구성약물인 蒼朮과 黃栢의 효과를 조사하였다.
- Rheumatoid arthritis의 유발 및 진행과정에는 osteoblasts, chondrocytes, fibroblasts 그리고 Th1/Th2 cells이 관여하고 있다. 따라서 본 연구에서는 rat osteoblast sarcoma cells인 ROS17/2.8에서 NO의 생성에 미치는 二妙散 및 구성약물인 蒼朮과 黃栢의 효과를 조사하였다.
- 는 염증의 유발 물질이며, 관절염의 유발 원인이기도 하다. 따라서 본 연구에서는 二妙散과 구성약물인 蒼朮과 黃栢이 PGE2의 생성 억제효과와 이를 생성하는 유도성 효소인 COX-2의 발현 억제효과를 조사하였다.
- 는 염증의 유발 물질이며, 관절염의 유발 원인이기도 하다. 따라서 본 연구에서는 二妙散과 구성약물인 蒼朮과 黃栢이 PGE2의 생성 억제효과와 이를 생성하는 유도성 효소인 cyclooxygenase-2 (COX-2)의 발현 억제효과를 조사하였다.
- 본 연구에서는 二妙散과 그 구성약물인 黃栢(Pellodendri cortex)과 蒼朮(Atractylodis rhizoma)의 anti-rheumatoid arthritis 효과를 쥐의 대식세포와 연골세포 및 동물 실험을 통하여 연구하였다.
- 특히, 二妙散은 筋肉과 骨格의 교원, 결합조직에서 생기는 病症을 치료하는 淸熱瀉濕湯, 三妙丸, 疏風活血湯, 淸燥湯, 二炒蒼栢散, 蒼朮復煎散, 滋血養筋湯, 養血壯筋健步丸 等의 중요한 基本方26)으로 活用되고 있음을 착안하여 二妙散과 構成藥物 이 rheumatoid arthritis에 미치는 영향을 실험적으로 연구하였다.
제안 방법
- 관절염 유발 : 동물 실험은 DBA/1J 생쥐를 이용한 collagen-induced arthritis(CIA) 모델을 이용 하였다. 4 oC에서 bovine type II collagen(CII)를 10 mM 초산액에서 하룻밤 교반하여 2 ㎍/㎖의 CII용액을 만들었다. CII용액을 동량의 complete Freund's adjuvant(CFA)와 혼합하여 CII/CFA를 조제하였다.
- Arthritis Index : CIA모델에서 paw에 나타나는 부종과 종창정도를 관찰하여 관절염의 발생 빈도와 위중도(severity)를 paw에서 측정하고, 평균값을 산출하였다36).
- CIA 모델에서 二妙散의 관절염 예방 효과를 연구하기 위해서 CII/CFA를 injection후 15일부터 42일까지 二妙散 20 ㎎/㎏을 DBA/1J mice의 복강에 하루에 1회 투여하고, 관절염의 평가는 첫 주사 후 16일부터 50일 까지 일주에 3회씩 incidence of arthritis를 측정 하였다. CII/CFA를 주사 한 후 30일부터 증상이 나타나기 시작해서 35일경이 되면 100%발병하는 것을 관찰되었고(data not shown), 二妙散을 투여한 group의 mice paw에 나타나는 부종과 종창정도의 위중도(arthritis index)는 collagen만 처리한 대조군에 비하여 약 50%정도가 감소되었다(Fig.
- CII용액을 동량의 complete Freund's adjuvant(CFA)와 혼합하여 CII/CFA를 조제하였다.
- Incidence of arthritis : CIA모델에서 약물을 처리한 group과 처리하지 않은 group간의 paw에 arthritis가 발생되는 생쥐의 숫자를 백분율로 표시하였다.
- Membrane을 horseradish peroxidase으로 conjugated된 anti-mouse IgG로 다시 1시간 동안 상온에서 hybridization 한다. Membrane을 PBS-Tween으로 4회 세척한 후 chemiluminescense 시약(ECL)으로 반응시킨 후 X-ray film으로 감광시켜 특정 유전자의 단백질 band를 가시화 하였다.
- nitrite+nitrate(NOx)는 nitrite reductase를 이용한 assay kit를 이용하였다. cytokine과 PGE2의 양은 상업적으로 구입한 분석 kit를 이용하여 측정하였다.
- 1차 주사후 20일이 경과되면 CII/CFA를 생쥐 꼬리의 피하에 2차 주사 하였다. 二妙散은 1차 주사 후 15일부터 40일까지 투여하였다. 1차 주사후 28일이 경과되면, 40 ㎍의 LPS(Sigma)를 복강에 주사하여 arthritis의 유발을 가속시켰다37).
- 실험에 사용한 처방은 蒼朮(Atractylodis rhizoma)과 黃栢(Pellodendri cortex)이 같은 분량으로 배합된 二妙散과 蒼朮, 黃栢을 사용하였다. 蒼朮과黃栢 각 100 g씩에 물을 각각 600 ㎖씩을 부어서 100℃온도로 대웅약탕기(DWP-1800T)를 이용하여 2시간 30분 동안 煎湯하였다.
- 1차 주사후 28일이 경과되면, 40 ㎍의 LPS(Sigma)를 복강에 주사하여 arthritis의 유발을 가속시켰다37). 관절염 억제효과는 15일부터 50일 까지 매주에 3회씩 서로 다른 두 명의 관찰자가 시행하였다.
- 그러므로 二妙散 처리시 ankylosis의 발생빈도(incidence)를 대조군과 비교하여 백분율로 표시하였다.
- 8은 10% fetal bovine serum(FBS)을 함유한 DMEM 배지에서 배양하였다. 그리고 한약제의 처리는 5%의 FBS을 함유한 DMEM 배지를 이용하였다.
- 대식세포는 10 ㎍/㎖의 lipopolysaccharide(LPS)로 활성화시키고, ROS17/2.8는 cytokine mixture(CM:100 U/㎖ IL-1β, 200 U/㎖ IFN-γ 그리고 500 U/㎖ TNF-α)로 활성화시킴과 동시에 실험 약제를 첨가하였다.
- 따라서 二妙散과 그 구성약물이 활성화된 대식세포에서 cytokine의 생성 억제효과를 조사하기 위하여, RAW264.7 세포(2x106 cells/2 ㎖/well of 6 well-plate)를 LPS(10 ㎍/㎖)와 실험 약제를 동시에 처리하고, 18시간이 경과한 후 생성된 IL-1β, IL-6 그리고 TNF-α의 양을 kit를 이용하여 측정하였다.
- 본 연구에서는 대식세포 RAW264.7세포를 LPS(10 ㎍/㎖)로 활성화시킴과 동시에 二妙散과 蒼朮과 黃栢을 처리하고, 18시간이 경과한 후 생성된 NO의 양을 측정하였다. LPS로 활성화된 RAW264.
- 세포를 20 mM Tris-HCl 완충용액(0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 5 ㎍/㎖ pepstain A, 1 ㎍/㎖ chymostatin)에 현탁시키고세 번의 freezing-thawing cycle로 파쇄하였다.
- 이러한 관점에서 천연물을 이용한 rheumatoid arthritis치료제 개발을 韓醫學的 개념을 도입한 방제학 에서의 君臣佐使 理論에 관련된 二妙散을 이용하여 in vitro 와 in vivo 실험을 시행하였다.
- 한편 濕熱에 의한 각종 질병을 치료하는 基本方劑인 二妙散이 사용된 내용을 살펴보면 다음과 같다. 즉 濕熱痿病에는 加味四物湯 ,淸燥湯, 三妙丸, 四製香附丸을 사용하였고 濕熱脚氣에는 二炒蒼栢散, 淸熱瀉濕湯, 加味蒼栢散을, 歷節風에는 疎風活血湯, 蒼朮復煎散을 사용하였으며, 濕熱痔漏에는 秦艽蒼朮湯을, 濕熱腰痛에는 七味蒼柏散을, 濕熱帶下에는 蒼栢樗皮丸, 濕熱肢節痛에는 蒼朮復煎湯, 蒼朮復煎散2)을 사용하였고 熱厥, 痰厥, 厥逆頭痛에는 淸上瀉火湯, 半夏白朮天麻湯, 羌活附子湯을, 皮膚瘡에 消疳敗毒散, 剪草散, 酒歸飮을 사용 하였다. 그러므로 二妙散은 濕熱과 깊은 연관성이 있으며 濕熱은 皮膚, 粘膜, 筋骨格系, 神經系 등의炎症性 病變을 유발케하는 원인을 통칭하는 용어로 볼 수 있다.
대상 데이터
- CII용액을 동량의 complete Freund's adjuvant(CFA)와 혼합하여 CII/CFA를 조제하였다. DBA/1J 생쥐 (Daehan Biolink, 6-8 week-old male)의 꼬리에 CII/CFA 혼합액 100㎕(CII 100 ㎍ + CFA 100 ㎍)을 26G needle을 사용하여 피하주사 하였다38).
- 8를 이용하였다. RAW264.7와 ROS17/2.8은 10% fetal bovine serum(FBS)을 함유한 DMEM 배지에서 배양하였다. 그리고 한약제의 처리는 5%의 FBS을 함유한 DMEM 배지를 이용하였다.
- 대식세포는 murine macrophage cell line RAW264.7과 rat osteoblast sarcoma cell line인 ROS17/2.8를 이용하였다. RAW264.
- 실험에 사용한 처방은 蒼朮(Atractylodis rhizoma)과 黃栢(Pellodendri cortex)이 같은 분량으로 배합된 二妙散과 蒼朮, 黃栢을 사용하였다. 蒼朮과黃栢 각 100 g씩에 물을 각각 600 ㎖씩을 부어서 100℃온도로 대웅약탕기(DWP-1800T)를 이용하여 2시간 30분 동안 煎湯하였다.
- 二妙散은 蒼朮 50 g, 黃栢 50 g에 물 600 ㎖를 부어서 같은 방법으로 煎湯하였 다. 이와같이 煎湯한 蒼朮 추출액 125 ㎖, 黃栢 추출액 150 ㎖, 二妙散은 200 ㎖를 동결 건조하여 蒼朮 15.5 g, 黃栢7.3 g, 二妙散 12.7 g을 얻어서 실험에 사용 하였다.
이론/모형
- 관절염 유발 : 동물 실험은 DBA/1J 생쥐를 이용한 collagen-induced arthritis(CIA) 모델을 이용 하였다. 4 oC에서 bovine type II collagen(CII)를 10 mM 초산액에서 하룻밤 교반하여 2 ㎍/㎖의 CII용액을 만들었다.
- 대식세포에서 NO의 생성은 iNOS 단백질의 발현에 의하여 일어나므로, 상기와 동일 실험 조건에서 iNOS의 발현 변화를 Western blot으로 확인하였다.
- 대식세포에서 NO의 생성은 iNOS 단백질의 발현에 의하여 일어나므로, 상기와 동일 실험 조건에서 iNOS의 발현 변화를 Western blot으로 확인하였다.
성능/효과
- 1. 二妙散및 蒼朮과 黃栢은 세포 배양 조건에서 대식세포와 osteoblasts에서 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하여 NO, cytokine(IL-1β, IL-6 그리고 TNF-α) 및 PGE2의 생성을 효과적으로 억제함을 보였다.
- 2. 二妙散은 蒼朮, 黃栢 각각보다 염증매개 인자의 생성을 강하게 억제할 수 있는 상승효과를 보였다.
- 3. 二妙散이 collagen-induced arthritis 동물 모델에서 ankylosis의 발생은 70%, 부종 및 종창의 정도를 50%정도 감소시킴을 확인 되었다.
- CIA 모델에서 二妙散의 관절염 예방 효과를 연구하기 위해서 CII/CFA를 injection후 15일부터 42일까지 二妙散 20 ㎎/㎏을 DBA/1J mice의 복강에 하루에 1회 투여하고, 관절염의 평가는 첫 주사 후 16일부터 50일 까지 일주에 3회씩 incidence of arthritis를 측정 하였다. CII/CFA를 주사 한 후 30일부터 증상이 나타나기 시작해서 35일경이 되면 100%발병하는 것을 관찰되었고(data not shown), 二妙散을 투여한 group의 mice paw에 나타나는 부종과 종창정도의 위중도(arthritis index)는 collagen만 처리한 대조군에 비하여 약 50%정도가 감소되었다(Fig. 6A).
- CIA 모델에서 二妙散의 관절염 예방 효과를 연구하기 위해서 CII/CFA를 injection후 15일부터 42일까지 二妙散 20 ㎎/㎏을 DBA/1J mice의 복강에 하루에 1회 투여하고, 관절염의 평가는 첫 주사 후 16일부터 50일 까지 일주에 3회씩 incidence of arthritis를 측정 하였다. CII/CFA를 주사 한 후 30일부터 증상이 나타나기 시작해서 35일경이 되면 100%발병하는 것을 관찰되었고, 二妙散을 투여한 group의 paw에 나타나는 부종과 종창정도의 위중도(arthritis index)는 collagen만 처리한 대조군에 비하여 약 50%정도가 감되었다(Fig. 6A).
- LPS로 활성화된 RAW264.7 세포는 40 μM 정도의 NO를 생성하였으며, 蒼朮과 黃栢을 처리하였을 때 NO의 생성이 처리된 한약의 농도에 비례하여 억제됨을 관찰하였다.
- LPS로 활성화한 대식세포는 IL-1β, IL-6 그리고 TNF-α를 다량 생성하였고, 蒼朮과 黃栢을 각각 처리 하였을 때 이들 cytokine의 생성은 억제되었으며, 二妙散도 이들 cytokine들의 생성을 강하게 억제하는 상승효과를 보여주었다(Fig. 3).
- 4A). PGE2을 생성하는 유도성 효소인 COX-2의 발현은 LPS에 의하여 증가하였고 이러한 발현 증가는 蒼朮과 黃栢에 의하여 감소하고 있음을 확인되었다. 더 나아가서 이 효소의 발현은 二妙散의 처리에 의하여 강하게 억제됨을 확인하였다(Fig.
- ROS 17/2.8 세포를 CM(100 U/㎖ IL-1β, 200 U/㎖ IFN-γ 그리고 500 U/㎖ TNF-α)으로 활성화 시키면 NO의 생성이 증가하였는데, 蒼朮과 黃栢을 처리하면 NO의 생성이 억제되었다.
- ROS17/2.8 세포를 CM(100 U/㎖ IL-1β, 200 U/㎖ IFN-γ 그리고 500 U/㎖ TNF-α)으로 활성화 시키면 NO의 생성이 증가하였고, 蒼朮과 黃栢을 처리하면 NO의 생성이 억제되었다.
- iNOS의 발현은 蒼朮, 黃栢, 二妙散의 처리 농도에 따라 점차적으로 감소함을 보여주고 있으며(Fig. 2A), 二妙散은 蒼朮, 黃栢을 단독으로 각각 처리하였을 때 보다 iNOS발현이 현저하게 감소함을 보여주고 있다(Fig. 2 A와 B).
- 二妙散을 처리시에도 NO의 생성이 농도에 의존적으로 억제되었으며, NO 생성에 대한 蒼朮과 黃栢의 IC50은 0.2와 0.4 ㎍/㎖ 정도로 각각 나타나 蒼朮이 黃栢보다는 NO생성의 억제효과가 높은 것으로 밝혀졌다(Fig. 1).
- 二妙散의 IC50은 0.5 ㎍/㎖로 나타나 蒼朮과 黃栢을 각각 사용한 효과보다 매우 강한 상승효과를 보였다. 이러한 결과는 蒼朮이 黃栢보다 항염 효과가 더 좋다는 것이 의미하며, 또한 二妙散이 抗炎症效果가 더욱 상승하고 있음을 보여 주고 있다(Fig.
- 더 나아가서 二妙散을 처리하면 ROS17/2.8 세포로부터 생성되는 NO는 현저하게 감소됨을 확인 하였다(Fig. 5A). 또한, CM에 의한 iNOS의 발현이 蒼朮과 黃栢에 의하여 억제되었고, 二妙散은 매우 효과적으로 iNOS의 발현억제를 보여 주었다(Fig.
- 한편 PGE2 생성을 유도하는 COX-2의 발현은 LPS에 의하여 증가되는데 이와 같이 증가된 COX-2의 발현은 蒼朮과 黃栢의 처리에 의하여 감소하고 있음을 확인되었다. 더 나아가서 이 효소의 발현은 二妙散의 처리에 의하여 강하게 억제됨을 확인하였다(Fig. 4B). 이러한 결과는 二妙散과 구성약물인 蒼朮과黃栢이 COX-2의 발현을 억제함으로 PGE2의 생성을 억제할 수 있으며, 蒼朮과 黃栢을 혼합한 二妙散을 사용하면, 더욱 더 강한 염증 억제 효과를 나타낼 수 있음을 시사하고 있다.
- 따라서 二妙散과 그 구성약물인 蒼朮과 黃栢이 활성화된 대식세포에서 cytokine의 생성 억제효과를 조사하기 위하여, RAW264.7 대식세포에 LPS 를 처리한 결과 IL-1β, IL-6 그리고 TNF-α를 다량 생성하였고, 蒼朮과 黃栢을 각각 처리 하였을 때 이들 cytokine의 생성은 억제되었으며, 二妙散도 이들 cytokine들의 생성을 강하게 억제하는 상승효과를 보여주었다(Fig. 3).
- 대식세포를 LPS로 처리 하였을 때에 NO의 생성은 전사 수준에서 발현이 조절되는 iNOS mRNA 정도에 비례하는 것으로 알려져 있다. 따라서 대식세포 RAW264.7세포를 LPS로 활성화시킴과 동시에 二妙散과 蒼朮과 黃栢을 처리하고 NO의 양을 측정하여 보면, 二妙散과 그 구성인 蒼朮, 黃栢이 모두 NO생성을 억제하였으며, 蒼朮이 黃栢보다 강한 억제 효과를 나타내었다. 또한 二妙散이 蒼朮과 黃栢을 각각 사용한 것보다 매우 강한 NO생성 억제에 대한 상승효과를 보였다.
- 8 세포를 CM(100 U/㎖ IL-1β, 200 U/㎖ IFN-γ 그리고 500 U/㎖ TNF-α)으로 활성화 시키면 NO의 생성이 증가하였는데, 蒼朮과 黃栢을 처리하면 NO의 생성이 억제되었다. 또한 二妙散을 처리하면 ROS 17/2.8 세포로부터 생성되는 NO는 현저하게 감소됨을 확인하였다(Fig. 5A). 한편 CM에 의한 iNOS의 발현이 蒼朮과 黃栢에 의하여 억제되었고, 二妙散은 매우 효과적으로 iNOS의 발현억제를 보여 주었다(Fig.
- 7세포를 LPS로 활성화시킴과 동시에 二妙散과 蒼朮과 黃栢을 처리하고 NO의 양을 측정하여 보면, 二妙散과 그 구성인 蒼朮, 黃栢이 모두 NO생성을 억제하였으며, 蒼朮이 黃栢보다 강한 억제 효과를 나타내었다. 또한 二妙散이 蒼朮과 黃栢을 각각 사용한 것보다 매우 강한 NO생성 억제에 대한 상승효과를 보였다. 이러한 결과는 蒼朮이 黃栢보다 항염 효과가 더 좋다는 것이 의미하며, 二妙散이 抗炎症效果가 더욱 상승하고 있음을 보여 주고 있다(Fig.
- 5A). 또한, CM에 의한 iNOS의 발현이 蒼朮과 黃栢에 의하여 억제되었고, 二妙散은 매우 효과적으로 iNOS의 발현억제를 보여 주었다(Fig. 5B).
- 7 세포를 LPS로 활성화시키면 PGE2의 생성이 증가하는데, 여기에는 蒼朮 과 黃栢을 처리하면 증가된 PGE2는 감소하였다. 또한, 二妙散을 처리하면 PGE2의 생성 억제효과가 더욱 강하게 나타났다(Fig. 4A). 한편 PGE2 생성을 유도하는 COX-2의 발현은 LPS에 의하여 증가되는데 이와 같이 증가된 COX-2의 발현은 蒼朮과 黃栢의 처리에 의하여 감소하고 있음을 확인되었다.
- 4B). 이러한 결과는 二妙散과 구성약물인 蒼朮과黃栢이 COX-2의 발현을 억제함으로 PGE2의 생성을 억제할 수 있으며, 蒼朮과 黃栢을 혼합한 二妙散을 사용하면, 더욱 더 강한 염증 억제 효과를 나타낼 수 있음을 시사하고 있다.
- 이러한 결과는 蒼朮과 黃栢이 염증매개 인자인 cytokine의 생성을 억제하므로써 관절염의 유발이나 진행을 억제할 수 있음을 그대로 보여주고 있으며, 이들 약제의 혼합인 二妙散은 이와 같은 작용에 대한 상승효과를 주고 있는 것으로 보아 관절염과 같은 염증질환을 효과적으로 예방하거나 치료할 수 있음을 시사하고 있다.
- 이러한 결과는 蒼朮과 黃栢이 염증매개 인자인 cytokine의 생성을 억제하여 관절염의 유발이나 진행을 억제할 수 있음을 보여주고, 이들 약제의 혼합인 二妙散은 이와 같은 작용에 대한 상승효과를 보여주고 있는 것으로 보아 관절염과 같은 염증질환을 효과적으로 예방하거나 치료할 수 있음을 시사하고 있다.
- 이러한 실험 결과는 蒼朮, 黃栢, 二妙散에 의한 NO 생성 억제 효과는 iNOS 발현을 전사단계에서 억제함으로 기인되고 二妙散이 蒼朮, 黃栢보다 강한 항염 효과를 나타내고 있음을 보여주고 있다.
- 5A). 한편 CM에 의한 iNOS의 발현이 蒼朮과 黃栢에 의하여 억제되었고, 二妙散은 매우 효과적으로 iNOS의 발현억제를 보여 주었다(Fig. 5B).
- 4A). 한편 PGE2 생성을 유도하는 COX-2의 발현은 LPS에 의하여 증가되는데 이와 같이 증가된 COX-2의 발현은 蒼朮과 黃栢의 처리에 의하여 감소하고 있음을 확인되었다. 더 나아가서 이 효소의 발현은 二妙散의 처리에 의하여 강하게 억제됨을 확인하였다(Fig.
후속연구
- 앞으로 이러한 효과에 대한 기전연구나 기존 치료제와의 비교실험 등 좀 더 깊은 연구가 필요하다고 본다.
- 지금까지의 실험결과를 종합해 보면, rheumatoid arthritis를 유발할 수 있는 여러 가지 염증성 매개인자들에 대한 대식세포 및 조골세포의 실험을 통하여 二妙散이 그 構成藥物인 蒼朮, 黃栢보다 상승된 抗염증효과를 나타내었고 또한 CIA 모델동물 에서도 二妙散의 anti-rheumatoid arthritis효과가 입증되고 있는 바 方劑 構成 理論인 君臣佐使法을 활용한다면 보다 효과적이고 부작용이 없으면서, 실용성이 높은 치료제 개발에 대한 많은 가능성을 제시하는 것으로 시사하는 바가 크다고 생각된다.
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