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문제 정의
- 구기자 에탄올 추출물 투여가 혈당강하 작용이 있음을 보고한 바21) 본 실험에서는 여러 용매로 게통 분획하여 결과를 얻었기에 보고하고자 한다.
제안 방법
- 4)을 가하여 균질화 시킨 후 1차 원심분리(600×g, 15분)하여 상등액을 얻고, 이 상등액을 2차 원심분리(10,000×g, 20분)하고 그 상등액을 105,000×g로 1시간 초원심분리하여 cytosol 분획을 얻어 glutathione peroxidase(GSH-Px), glutathione-S-transferase(GST),superoxidedismutase(SOD), catalase(CAT) 활성의 효소원으로 사용하였고, 간 조직중의 지질과산화물과 glutathione(GSH) 함량은 각각 Uchiyama 등의 방법24)과 Ellman의 방법25)에 따라, glutathione peroxidase 활성도는 Flohe 등의 방법,26) glutathione-Stransferase 활성도는 Habig 등의 방법,27) superoxide dismutase 활성도는 Cropo 등의 방법,28) catalase 활성도는 Aebi의 방법29)에 따라서 분석하였다. Glycogen 함량과 당대 사를 위한 효소원 전처리는 간 2g을 0.1 M ice-cold citrate buffer(pH 4.2) 6 ml를 넣어 균질화시킨 후 3,000 rpm, 10분 간 원심분리하여 상층액에서 glycogen 함량, glucose-6-phosphatase(G-6-Pase)과 glucose-6-phosphate dehydrogenase(G-6-PDH) 활성을 측정하였다. Glucokinase 측정은 간 2g을 1 mM EDTA가 혼합된 buffer 6 ml에 넣어 균질화한 다음, 12,000×g에서 1시간 동안 원심분리하여 상층액을 취하여 Glycogen 함량은 Murat의 방법,30) Glucose-6-phosphatase(G-6-Pase)활성도는 Baginski등의방법,31) Glucose-6-phosphate dehydrogenase(G-6-PDH) 활성도는 Demoss의 방법,32) Glucokinase 활성도는 Hara 등의 방법33)에 따라 측정하였으며, 단백질의 함량은 Lowry 등의 방법34)에 따라 측정하였다.
- 의 용량으로 미정맥 주사를 하였다. Streptozotocin 주사 48시간 후에 안와 정맥으로부터 혈액을 채취하여 3000 rpm, 20분 원심분리하여 혈당수준이 300 mg/dl 이상인 것을 당뇨 유발로 간주하여, 당뇨 유발 대조군(STZ-control), 당뇨 유발 실험군(STZ-sample)으로 그룹당 6마리씩 나누어 정상군과 당뇨 유발 대조군에는 0.5% carboxyl methyl cellulose(CMC) 용액만을, 실험군은 CH3(CH2)4CH3, CHCl3, EtOAc, BuOH and H2O 등의 용매로 얻어진 분획물을 수율에 따라 각각 130.2 mg/kg, 564.3 mg/kg, 100.8 mg/kg, 850.8 mg/kg 및 1,561.2 mg/kg b.w의 용량으로 0.5% CMC 액에 현탁시켜 흰쥐의 체중 kg 당 10 ml씩 1일 1회 7일간 경구 투여하였다.
- 당뇨유발 및 검액의 조제 − 체중 200±10 g 내외의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 1주일간 적응시킨 후 평균 체중 225±15 g인 것을 6군으로 나누어 하룻밤 동안 절식시킨 후 STZ을 45 mg/kg, b.w 용량으로 0.01 M citric acid buffer(pH 4.5)에 녹여 2 ml/kg, b.w.의 용량으로 미정맥 주사를 하였다.
- 효소원 조제 및 분석 − 최종 투여 24시간 후 흰쥐를 ether로 마취하여 복부를 절개하여 심장에서 직접 채혈하고 간을 적출하였다.
대상 데이터
- 시약 및 기기 − 시약은 streptozotocin (STZ), sodium azide, glutathione, glutathione reductase, NADPH, cumene hydroperoxide, 1-chloro2,4-dinitrobenzen(CDNB), 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid(DTNB), xanthine, xanthine oxidase, cytochrome C, sodium deoxylcholate, 1,1,3,3,-tetraethoxypropane, thiobarbituricacid, amyloglucosidase, glucose-6- phosphate, glucose-6-phosphate dehydrogenase, cacodylate, ascorbic acid, glycylglycine, tris-HCl, NAD, ATP, bovine serum albumin 등은 Sigma Co.(U.S.A)를 사용하였으며, glucose, Total cholesterol, HDL-cholesterol, triglyceride(TG) kit는 영동제약(Korea)의 것을 사용하였고, 나머지 기타 시약은 특급시약을 구입하여 사용하였다.
- 기기는 rotary vaccum evaporator(Eyela Co., Japan), deep freezer(Hannil Co., Korea), centrifuge(Hannil Co., Korea), UV spectrometer(Kontron 927, Italy), homogenizer (Omni, U.S.A.), ultracentrifuge(Sorval, U.S.A.)등을 사용하였다.
- 본 실험에서는 CH3(CH2)4CH3 분획물을 투여한 군에서 0.33±0.10 moles/mg/protein/min로 유의적인증가(p<0.05)를 나타내었다.
- 실험 재료 − 본 실험에 사용한 구기자는 2007년 4월 서울 경동시장에서 구입(충남 청양산)하여 사용하였으며, 표품은 대진대 생명과학과 표본실(표본 번호 : K-0017402)에 보관중이다.
데이터처리
- 통계처리 − 모든 실험 결과는 평균치와 표준± 표준 오차로 계산하였고, 각 군간의 차이는 Student, s t-test를 실시하여 p값이 5% 미만일 때 유의성이 있다고 판정하였다.
이론/모형
- Glucokinase 측정은 간 2g을 1 mM EDTA가 혼합된 buffer 6 ml에 넣어 균질화한 다음, 12,000×g에서 1시간 동안 원심분리하여 상층액을 취하여 Glycogen 함량은 Murat의 방법,30) Glucose-6-phosphatase(G-6-Pase)활성도는 Baginski등의방법,31) Glucose-6-phosphate dehydrogenase(G-6-PDH) 활성도는 Demoss의 방법,32) Glucokinase 활성도는 Hara 등의 방법33)에 따라 측정하였으며, 단백질의 함량은 Lowry 등의 방법34)에 따라 측정하였다.
- 한편, 적출한 간은 1g에 4배의 0.1 M 인산용액(pH 7.4)을 가하여 균질화 시킨 후 1차 원심분리(600×g, 15분)하여 상등액을 얻고, 이 상등액을 2차 원심분리(10,000×g, 20분)하고 그 상등액을 105,000×g로 1시간 초원심분리하여 cytosol 분획을 얻어 glutathione peroxidase(GSH-Px), glutathione-S-transferase(GST),superoxidedismutase(SOD), catalase(CAT) 활성의 효소원으로 사용하였고, 간 조직중의 지질과산화물과 glutathione(GSH) 함량은 각각 Uchiyama 등의 방법24)과 Ellman의 방법25)에 따라, glutathione peroxidase 활성도는 Flohe 등의 방법,26) glutathione-Stransferase 활성도는 Habig 등의 방법,27) superoxide dismutase 활성도는 Cropo 등의 방법,28) catalase 활성도는 Aebi의 방법29)에 따라서 분석하였다.
- 채취한 혈액은 3,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청중의 glucose 함량은 Rabbo의 방법,22) total cholesterol과 HDL-cholesterol, triglycerides(TG)의 함량은 Belcher 등의 방법23)에 따라 측정하였다. 한편, 적출한 간은 1g에 4배의 0.
성능/효과
- p>당뇨병은 환경적, 유전적 및 대사적 요인에 의해 췌장에 있는 β-세포에서의 인슐린 분비장애와 말초조직에 대한 인슐린 저항에 의해 나타나고 고혈당을 특징으로 한다.1) 이에 대한 치료가 적절히 이루어지지 않으면 혈중 포도당이 체내로 이동하지 못하고 장기 내 글리코겐이 분해 되어 당질, 단백질 및 지방의 에너지 대사에 이상이 초래되어 당뇨성 망막증, 뇌졸증, 심근경색증, 만성신부전증, 말초 신경증 및 고지혈증 등이 대표적으로 나타나며 발생시기, 부위, 병변정도는 매우 다양하나 아직 그 기전은 명확하지 않다.2) 특히 동맥경화증이나 고지혈증과 같은 혈관성 장애는 고혈당과 지질대사의 이상으로 인한 혈중 지질 증가와 지질과산화에 따른 조직의 손상으로 인하여 발병되며 지질대사에 대한 인슐린의 역할은 중성지방의 저장을 촉진시켜 지방세포에서 지방분해를 저해하는 작용을 하지만 인슐린의 분비가 저하 되면 중성지방이 가수분해 되어 glycerol과 유리지방산으로 분해 된다.
- 1. STZ 투여로 증가된 혈당치가 CHCl3 분획물 투여에 의해 유의적인 감소(p<0.05)를 나타내었다.
- 1) 이에 대한 치료가 적절히 이루어지지 않으면 혈중 포도당이 체내로 이동하지 못하고 장기 내 글리코겐이 분해 되어 당질, 단백질 및 지방의 에너지 대사에 이상이 초래되어 당뇨성 망막증, 뇌졸증, 심근경색증, 만성신부전증, 말초 신경증 및 고지혈증 등이 대표적으로 나타나며 발생시기, 부위, 병변정도는 매우 다양하나 아직 그 기전은 명확하지 않다.2) 특히 동맥경화증이나 고지혈증과 같은 혈관성 장애는 고혈당과 지질대사의 이상으로 인한 혈중 지질 증가와 지질과산화에 따른 조직의 손상으로 인하여 발병되며 지질대사에 대한 인슐린의 역할은 중성지방의 저장을 촉진시켜 지방세포에서 지방분해를 저해하는 작용을 하지만 인슐린의 분비가 저하 되면 중성지방이 가수분해 되어 glycerol과 유리지방산으로 분해 된다.3,4) 또한 당뇨병의 경우 산화적 스트레스에 대한 감수성이 높아3-5) 생체의 reactive oxygen species (H2O2, O2- , HO-) 생성계가 정상인에 비해 더욱 촉진되고 지질과산화물이 다량 생성되어 단백질 파괴, 염색체 이상 및 적혈구 파괴 등의 세포 기능저하와 괴사를 일으킨다.
- 2. STZ 투여로 증가된 TG, Total cholesterol 수치는 TG에서 CHCl3 과 EtOAc 분획물을 투여한 군에서 유의적인 감소(p<0.05)를, Total cholesterol은 EtOAc 분획물을 제외한 나머지군에서 감소를 나타내었 으나 유의성은 없었다.
- 3)The various fractions of Lycii fructus were administrated orally once a day in experimental rats for 7 days.
- 3. STZ 투여로 과산화지질과 glutathione 함량은 각각 유의적인 증가와 감 소를 나타내었으나 과산화지질은 EtOAc, BuOH과 H2O, 분획물 투 여에 의해 각각 유의적인 감소(p<0.05)와 증가를 나타내었다.
- 4. STZ 투여로 감소된 GST는 butanol 분획물 투여에 의해 유의적인 증가 (p<0.05)를 나타내었으며, Catalase와 GSH-Px는 EtOAc, BuOH과 H2O, 분획물을 투여한 군에서 각 각 유의적인 감소(p<0.05)를 나타내었 다.
- 5. STZ 투여로 감소된 Glycogen, Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Glucokinase등의 활성은 CHCl3 분획물 투여에 의해 유의적인 증가 (p<0.05)를 나타내었으나, Glucose-6-phosphatase는 CHCl3 , BuOH 분획물을 투여한 군에서 유의적인 감소(p<0.05)를 나타내었다.
- GSH-Px는 H2O2를 제거하면서 환원형 glutathione(GSH)을 산화형 glutathione(GSSG)으로 전환시키는 효소47)로써, 본 실험 결과 정상군과 비교하여 당뇨대조군에서 유의적인 증가(p<0.05)를 나타내었으나 CHCl3을 제외한 나머지 분획물을 투여한 군에서는 모두 유의성 있는 감소를 나타내었다.
- TG 함량은 CHCl3과 EtOAc 분획물을 투여한 군에서 각각 97.1±10.68 mg/dl, 113.12±16.56 mg/dl로 유의성 있는 감소 (p<0.05)를 나타내었으나 Total cholesterol 함량은 EtOAc 분획물을 제외한 다른 분획물 투여에 의해 감소를 나타내었으나 유의성은 없었다.
- 따라서 본실험에서도 당뇨대조군에서 유의적인 증가(p<0.05)를 나타내었으나, CHCl3과 BuOH 분획물 투여군에서 각각 2.55±0.10 nmoles/mg/protein/min, 2.66±0.20 nmoles/ mg/protein/min로 유의성 있는 감소(p<0.05)를 나타내었다.
- 정상군과 비교하여 당뇨대조군에서 유의적인 증가 (p<0.05)를 나타내었다.
- 정상군이 167.01±8.63 mg/dl에 비해 당뇨대 조군은 698.01±40.66 mg/dl으로 유의적인 증가(p<0.05)를 나타내었으나, 분획물을 투여한 결과 CHCl3 분획물을 투여한 군에서는 493.90±3.28 mg/dk로 유의적인 감소(p<0.05)를 나타내었다.
후속연구
- HDL-cholesterol은 당뇨유발군에서 유의적인 증 가(p<0.05)를 나타내었으나, BuOH과 H2O 분획물을 투여한 군에서 유 의적인 감소(p<0.05)를나타내어 앞으로 이와 관련된 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
- 이와 같이, 구기자 EtOH추출물을 CH3(CH2)4CH3, CHCl3, EtOAc, BuOH 과 H2O로 계통분획하여 그 분획물을 STZ 당뇨 유발쥐에게 투여 후 혈당 저하, 지질 대사의 개선 효과, 항산화 작용 및 당 대사 활성을 검토한 결과 지질대사와 항산화대사와 관련된 물질은 BuOH 분획물에서, 당대사와 관련된 물질은 CHCl3 분획물에 유효 성분이 함유된 것으로 사료되며, 앞으로 이들 분획물에 대한 세부 분획과 효능검사를 위한 연구를 계획하고자 한다.
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