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문제 정의
- 본 연구에서는 택란 메탄올 추출물이 보이는 항암효과를 조사하기 위해 인간 유방암 세포인 MCF-7 세포를 대상으로 세포의 성장 및 사멸에 택란 추출물이 미치는 효과를 조사하였다. 그 결과 택란 메탄올 추출물의 적용은 MCF-7의 세포사멸 및 세포성장억제를 유도하였다 (Fig.
가설 설정
- p-actin was used as an internal control. (B) The Bax/Bcl-2 ratio was repre-senUd. Data are presented as means and S.
제안 방법
- 세포 배양액에 택란 메탄올 추출액 50/ml을 처리하고 24시간 동안 추가 배양하였다. 4% Paraformaldehyde로 세포를 고정시키고, PBS로 수세한 후 10/ml의 Hoechst 33258을 20분간 반응시켜 형광현미경 (BX-50, Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 세포의 핵을 관찰하였다.
- 1). 또한 택란 메탄올 추출물의 처리에 의해 세포핵의 응축 및 세포고사 관련 단백질의 발현이 변화하였으며 (Fig. 2와 3), 세포주기 조절 단백질들의 발현변화를 유도하였다 (Fig. 4). 이러한 결과는 택란 메탄올 추출물에 존재하는 성분이 유방암세포의 항암효과를 유도할 수 있음을 강력히 시사한다.
- , 2006). 본 연구에서 택란 메탄올 추출물을 인간 유방암 세포인 MCF-7 세포에 처리하여 세포고사를 시사하는 단백질인 Bax, Bcl-2, caspase-7, PARP 단백질들의 발현을 확인하였다. Bax 단백질의 발현량의 변화는 보이지 않았으나, Bcl-2 단백질의 발현이 감소하는 것을 확인하였다.
- 본 연구에서는 인간 유방암 세포인 MCF-7을 이용하여 택란의 메탄올 추출물 적용시 암세포의 성장 및 생존에 미치는 영향을 조사하였고, 그 결과 암세포의 세포 고사 및 성장억제를 유발하는 것을 확인하였다 또한 택란의 추출물이 MCF-7 세포에 미치는 영향을 세포고사 및 세포주기와 관련된 단백질의 발현변화를 통해 확인하였다.
- 0X103 cells/well로 분주하고, 24시간 동안 배양한 후 택란 추출물을 농도 별로 (1-300 gg/ml) 처리하였다. 세포에 택란 추출물을 처리한 후, 시간대 별로 (0~72시간) 재차 배양하였다. 세포의 성장 및 생존 여부를 분석하기 위해 세포에 MTT working 용액 [3-(4, 5-dimethylthiazol-z-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) (Sigma)] 10 gl/ well 첨가하여, 4시간 동안 반응시켰다.
- 세포에 택란 추출물을 처리한 후, 시간대 별로 (0~72시간) 재차 배양하였다. 세포의 성장 및 생존 여부를 분석하기 위해 세포에 MTT working 용액 [3-(4, 5-dimethylthiazol-z-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) (Sigma)] 10 gl/ well 첨가하여, 4시간 동안 반응시켰다. 반응 후, Stop 용액 [Isopropyl alcohol과 1 N HC1 을 각각 19:1로 혼합한 용액] 100 jil/well을 첨가하여 formazan을 잘 녹여 microplate reader [SpectraMax Plus384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)]를 이용하여 570nm 파장에서 측정하였다.
- 반응 후, Stop 용액 [Isopropyl alcohol과 1 N HC1 을 각각 19:1로 혼합한 용액] 100 jil/well을 첨가하여 formazan을 잘 녹여 microplate reader [SpectraMax Plus384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)]를 이용하여 570nm 파장에서 측정하였다. 이때, 각 well당 최종 DMSO 농도는 0.5%이었으며, 한 농도당 각각 4개의 well을 사용하여 평균값을 구하였다.
- 인간 유방암 세포 MCF-7 세포를 96-well 배양접시에 3.0X103 cells/well로 분주하고, 24시간 동안 배양한 후 택란 추출물을 농도 별로 (1-300 gg/ml) 처리하였다. 세포에 택란 추출물을 처리한 후, 시간대 별로 (0~72시간) 재차 배양하였다.
- 2에서 보이는 결과와 일치하였다. 택란 메탄올 추출물 처리시나타나는 세포고사 관련 단백질의 발현을 조사하기 위해 MCF-7 세포에 택란 메탄올 추출물을 처리한 후, Western Blot 분석을 수행하였다 (Fig. 3A). Bax와 Bcl-2 단백질은 Bcl-2 그룹에 속하는 단백질들로서 미토콘드리아에서 세포 고사 유전자를 가진 단백질들의 방출을 조절하는 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.
- 1에서 나타나듯이 MCF-7 세포에 택란 메탄올 추출물을 처리하면, 세포사멸뿐 아니라 세포증식 억제 효과를 보임을 알 수 있다. 택란 메탄올 추출물의 처리가 세포주기와 관련된 단백질의 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 Western blot 분석을 수행하였다 (Fig. 4). 대표적인 암 억제 유전자인 p53의 발현이 택란 메탄올 추출물 처리 24시간 후 급격히 증가하였고, 48시간에 최대의 발현량을 보였다 세포주기 G1 기에서 S기로 넘어가는 검문 지점에 관련되어 있는 단백질인 Cdk4와 cyclin-Dl 단백질의 발현량은 택란 메탄올 추출물 처리 24시간부터 줄어들어 72시간 까지 그 발현량이 점차 감소함을 확인할 수 있었다.
- 택란 메탄올 추출물이 MCF-7 세포사멸을 유도하는 분자적 기작을 조사하기 위해 세포핵을 염색할 수 있는 Hoechst 33258을 세포와 반응시켜 50 μg/ml의 택란 메탄올 추출물을 24시간 동안 처리시 나타나는 세포핵의 모양 변화를 관찰하였다 (Fig. 2). 택란 메탄올 추출물을 처리하지 않은 정상 세포의 핵과 비교하였을 때, 택란 메탄올 추출물을 처리한 실험군에서 전형적인 세포 고사를 나타내는 핵의 형태인 응축되어 밝게 빛나고 있는 핵 그리고 잘게 부서진 핵의 절편들도 관찰되었다.
- 택란 메탄올 추출물이 MCF-7의 성장 및 생존에 미치는 영향을 조사하기 위해 다양한 택란 메탄올 추출물의 처리농도 (1~300 pig/ml) 및 다양한 처리시간 (0~72시간) 을 대상으로 MTT 분석을 실시하였다 (Fig. 1). 택란 추출물의 처리농도 및 처리시간이 증가할수록 세포의 생존은 감소하는 양상을 보였으며, 전체 세포의 50%가 사멸하는 농도 (median effective dose, EC50)는 48, 72시간에서 각각 79.
대상 데이터
- 실험에 사용된 택란의 원산지는 경상북도 영천이며, 서울특별시 동대문구 제기동에 위치한 경동시장에서 구입하였다. 택란 5 g을 99.
- 인간 유방암 세포인 MCF-7 세포는 10% (v/v) fetal bovine serum (Hyclone, South Logan, UT), 100 units/ml penicillin과 100 )ig/ml streptomycin (Hyclone) 이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Hyclone) 의 성장 배지에서 37℃, 5%CO2 조건으로 배양하였다.
이론/모형
- Cells were treated with methanol extract of Lycopus lucidus Turcz in various time and concentration. Cell proliferation was determined by MTT assay. Each point represents the mean of the data from three independent experiments.
성능/효과
- 본 연구에서 택란 메탄올 추출물을 인간 유방암 세포인 MCF-7 세포에 처리하여 세포고사를 시사하는 단백질인 Bax, Bcl-2, caspase-7, PARP 단백질들의 발현을 확인하였다. Bax 단백질의 발현량의 변화는 보이지 않았으나, Bcl-2 단백질의 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 이는 미토콘드리아 외막의 투과성이 증가 됐을 것이라는 증거가 될 수 있다.
- 대표적인 암 억제 유전자인 p53의 발현이 택란 메탄올 추출물 처리 24시간 후 급격히 증가하였고, 48시간에 최대의 발현량을 보였다 세포주기 G1 기에서 S기로 넘어가는 검문 지점에 관련되어 있는 단백질인 Cdk4와 cyclin-Dl 단백질의 발현량은 택란 메탄올 추출물 처리 24시간부터 줄어들어 72시간 까지 그 발현량이 점차 감소함을 확인할 수 있었다. Cdk4와 cyclin-Dl 단백질의 발현량이 감소하고, 결국 E2F-1 단백질의 발현량 역시 현저히 감소함을 확인하였다. 이 결과들로부터 택란 메탄올 추출물이 MCF-7 세포의 증식을 억제시키는 현상은 세포주기에 관련된 몇몇 단백질의 발현량을 조절함으로써 가능하다는 것을 알 수 있었다.
- 조사하였다. 그 결과 택란 메탄올 추출물의 적용은 MCF-7의 세포사멸 및 세포성장억제를 유도하였다 (Fig. 1). 또한 택란 메탄올 추출물의 처리에 의해 세포핵의 응축 및 세포고사 관련 단백질의 발현이 변화하였으며 (Fig.
- 4). 대표적인 암 억제 유전자인 p53의 발현이 택란 메탄올 추출물 처리 24시간 후 급격히 증가하였고, 48시간에 최대의 발현량을 보였다 세포주기 G1 기에서 S기로 넘어가는 검문 지점에 관련되어 있는 단백질인 Cdk4와 cyclin-Dl 단백질의 발현량은 택란 메탄올 추출물 처리 24시간부터 줄어들어 72시간 까지 그 발현량이 점차 감소함을 확인할 수 있었다. Cdk4와 cyclin-Dl 단백질의 발현량이 감소하고, 결국 E2F-1 단백질의 발현량 역시 현저히 감소함을 확인하였다.
- 더 나아가, 암 억제 유전자 p53 단백질, cdk4, cyclin-Dl, E2F-1 단백질들의 발현이 시간이 지나면서 감소하는 것을 알 수 있었고, 이는 택란 메탄올 추출물이 G1 기에서 세포주기를 억제할 가능성이 있음을 시사한다. 따라서 택란 메탄올 추출물이 MCF-7 세포의 G1 세포주기를 실제로 억제할 수 있는지에 대한 추가 연구가 진행되어야 할 것이다.
- 이는 미토콘드리아 외막의 투과성이 증가 됐을 것이라는 증거가 될 수 있다. 또한, 일련의 세포고사 신호 기작에서 중요한 역할을 하는 caspase-7 단백질이 분해되어 발현이 감소됨을확인하였고, caspase-7 단백질이 활성화 됨에 따라 전체 116 Kd의 크기를 갖는 PARP 단백질이 활성화 형태인 cleaved-PARP 형태로 분해된 것을 확인하였으며, 시간에 의존적으로 발현량이 점차 증가됨을 확인하였다. 이상의 결과들로 볼 때, 택란 메탄올 추출물을 MCF-7 세포에 처리했을 때, 세포사멸을 유도함에 있어 세포고사가 그 분자적 기전임을 알 수 있다.
- 본 연구의 결과를 통해 택란 추출물이 기존의 보고된 항염증, 항알러지, 항산화 효과 외에 인간 유방암 세포인 MCF-7 세포에서 항암효과가 있음이 입증되었다. 택란이 함유하고 있는 대표적인 성분은 세 종류의 페놀류 (rosmarinic acid, methyl rosmarinate, ethyl rosmarinate) 그리고 두 종류의 플라보노이드 성분 (luteolin, luetolin-7-O-beta-D-Glucuronide methyl ester) 이라고 알려져 있다.
- 7 μg/ml이었다. 이 결과는 택란 메탄올 추출물의 처리시간과 처리농도 의존적으로 인간 유방암 세포인 MCF-7 세포의 세포사멸을 유도함을 알 수 있었다.
- Cdk4와 cyclin-Dl 단백질의 발현량이 감소하고, 결국 E2F-1 단백질의 발현량 역시 현저히 감소함을 확인하였다. 이 결과들로부터 택란 메탄올 추출물이 MCF-7 세포의 증식을 억제시키는 현상은 세포주기에 관련된 몇몇 단백질의 발현량을 조절함으로써 가능하다는 것을 알 수 있었다.
- 택란 메탄올 추출물을 처리하지 않은 정상 세포의 핵과 비교하였을 때, 택란 메탄올 추출물을 처리한 실험군에서 전형적인 세포 고사를 나타내는 핵의 형태인 응축되어 밝게 빛나고 있는 핵 그리고 잘게 부서진 핵의 절편들도 관찰되었다. 이 실험을 통하여 택란 메탄올 추출물이 MCF-7 세포의 세포고사를 유도하여 세포사멸을 일으킴을 확인하였다. 50 昭/ml의택란 메탄올 추출물을 24시간 동안 처리하게 되면 18.
- 4). 이러한 결과는 택란 메탄올 추출물에 존재하는 성분이 유방암세포의 항암효과를 유도할 수 있음을 강력히 시사한다.
- 세포 고사의 진행을 대변할 수 있는 또 하나의 단백질은 poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)이며, 이는 세포 고사의 진행과 함께 caspase 그룹 단백질의 활성화에 의해 116 Kd의 크기를 갖는 전장의 PARP가 잘린 형태인 89 Kd의 PARP (cleaved-PARP)로 나타나게 되는데 (Ricci and Zong, 2006), 택란 메탄올 추출물의 처리에 의해 cleaved-PARP 의 양이 처리시간에 비례하여 점진적으로 증가하는 양상을 확인하였다. 이상의 결과는 택란 메탄올 추출물이 세포사멸을 유도함에 있어 세포고사가 분자적 기전임을 알 수 있다.
- 또한, 일련의 세포고사 신호 기작에서 중요한 역할을 하는 caspase-7 단백질이 분해되어 발현이 감소됨을확인하였고, caspase-7 단백질이 활성화 됨에 따라 전체 116 Kd의 크기를 갖는 PARP 단백질이 활성화 형태인 cleaved-PARP 형태로 분해된 것을 확인하였으며, 시간에 의존적으로 발현량이 점차 증가됨을 확인하였다. 이상의 결과들로 볼 때, 택란 메탄올 추출물을 MCF-7 세포에 처리했을 때, 세포사멸을 유도함에 있어 세포고사가 그 분자적 기전임을 알 수 있다.
- 2). 택란 메탄올 추출물을 처리하지 않은 정상 세포의 핵과 비교하였을 때, 택란 메탄올 추출물을 처리한 실험군에서 전형적인 세포 고사를 나타내는 핵의 형태인 응축되어 밝게 빛나고 있는 핵 그리고 잘게 부서진 핵의 절편들도 관찰되었다. 이 실험을 통하여 택란 메탄올 추출물이 MCF-7 세포의 세포고사를 유도하여 세포사멸을 일으킴을 확인하였다.
- 1). 택란 추출물의 처리농도 및 처리시간이 증가할수록 세포의 생존은 감소하는 양상을 보였으며, 전체 세포의 50%가 사멸하는 농도 (median effective dose, EC50)는 48, 72시간에서 각각 79.4 pig/ml와 48.7 μg/ml이었다. 이 결과는 택란 메탄올 추출물의 처리시간과 처리농도 의존적으로 인간 유방암 세포인 MCF-7 세포의 세포사멸을 유도함을 알 수 있었다.
후속연구
- 억제할 가능성이 있음을 시사한다. 따라서 택란 메탄올 추출물이 MCF-7 세포의 G1 세포주기를 실제로 억제할 수 있는지에 대한 추가 연구가 진행되어야 할 것이다.
- , 2008). 향후 이어지는 연구에서 이들 유효성분들의 유방암 세포에서의 항암효과가 면밀히 조사된다면 본 연구를 더욱 발전시키는 계기가 될 것이며, 나아가 유방암 제어를 위한 약물개발 연구를 촉진시킬 수 있을 것이다.
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