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문제 정의
- . 袪風燥 濕淸熱, 生進潤燥의 치료목표가 알레르기성 또는 아토피 피부염시 초래되는 부종성 반응에 적합하다고 판단되어 본 실험을 수행하였다.
- 따라서 본 연구에서는 현재 아토피 피부염과 두드러기 치료에 응용되고 있는19) 消風散의 PCA에의한 Type I 피부염에 대한 효과를 관찰하였다.
- 본 연구에서는 현재 아토피 피부염과 두드러기 치료에 응용되고 있는19) 消風散의 알러지성 피부염에 대한 효과를 확인하기 위해, PCA에 의한 Type I 피부염 모델을 이용하여 평가하였다. 항원 노출전 12시간 간격으로 소풍산 물 추출물 500, 250 및 125 ㎎/㎏을 총 4회 경구 투여한 다음, 항원 노출 부위에 누출된 염색액의 양과 누출 직경, 조직병리학적 변화, 혈중 IgE 및 histamine 함량을 DEXA 1 ㎎/㎏ 투여군과 비교 관찰하였다.
제안 방법
- 2) 감작 준비된 anti-OVA serum을 생리식염수를 이용하여, 1:8로 희석한 다음, 제모된 Rat의 배측 피부 2개부위에 각각 0.05 ㎖ 씩 피내 주사 하였다.
- 3) 항원노출 : 감작 48시간 후, OVA(2.0 ㎎)와 Evans blue(5.0 ㎎; Sigma, USA)가 함유된 생리식염수 0.5 ㎖를 미정맥으로 투여하여, PCA 반응과 모세혈관 확장에 의한 염색액의 누출을 유발 시켰다.
- 500, 250 및 125 ㎎/㎏의 소풍산 추출물은 멸균 증류수에 용해시켜 동물 체중 ㎏ 당 5 ㎖의 용량으로, 감작일 직후부터 12시간 간격으로 금속제 Zonde가 부착된 3 ㎖ 주사시(syringe)를 이용하여, 총 4회 강제 경구 투여하였으며, 1 ㎎/㎏ 의 DEXA(Sigma, USA) 역시 멸균 증류수에 용해시켜, 동일한 방법으로 경구 투여 하였다.
- 감작 부위 피부 조직을 분리하여 10% neutral buffered formalin에 고정한 다음, 탈수, 포매를 거쳐 파라핀 block을 준비하고, 3 ㎛의 조직절편을 제작하여 Masson Trichrome 염색을 실시하여 광학현미경하에서 관찰하였으며, 진피(dermis)의 부종 반응이 일어난 percentages와 부종 부위의 장축의 길이를 각각 CCD image analyzer (DMI-300, DMI, Korea)를 이용하여 측정하였다.
- 항원 노출 30분 후, 최종 희생시 안와 정맥총에서 2 ㎖의 혈액을 채혈하여, 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여, 혈청(serum)을 분리하였다. 분리된 혈청에서 각각의 ELISA Kit (Shibayagi Co., Japan)을 이용하여 IgE 및 histamine의 양을 측정 하였다.
- 실험방법 : Rat OVA 항혈청 (역가, 1:32)을 8배 희석하여 유발부위 당 0.05 ㎖을 피내 주사하여 감작시켰으며, 감작 48시간 후, OVA 2 ㎎과 5 ㎎의 Evans blue를 0.5 ㎖의 생리식염수에 녹여 미정맥투여 하여 PCA를 유발시켰다. 항원 노출전 12시간 간격으로 소풍산 물 추출물 500, 250 및 125 ㎎/㎏을 총 4회 경구 투여한 다음, 항원 노출 부위에 누출된 염색액의 양과 누출 직경, 조직병리 학적 변화, 혈중 IgE 및 histamine 함량을 DEXA 1 ㎎/㎏ 투여군과 비교 관찰하였다.
- 즉, OVA(1.0 ㎖; Sigma, USA)와 aluminum hydroxide gel(10 ㎎; Aldrich, USA)이 포함된 생리식염수 0.5 ㎖를 피내 주사하고, 불활화시킨 Bordetella pertussis(2×1010 cells/㎖) 현탁액 1 ㎖을 복강 주사하여 Rat을 감작시킨 7일 후, 1 ㎖의 불활화 세균 현탁액을 다시 근육내 주사하여 재 감작시켰다.
- 5 ㎖를 피내 주사하고, 불활화시킨 Bordetella pertussis(2×1010 cells/㎖) 현탁액 1 ㎖을 복강 주사하여 Rat을 감작시킨 7일 후, 1 ㎖의 불활화 세균 현탁액을 다시 근육내 주사하여 재 감작시켰다. 초회 감작 14일 후, 혈액을 채취하여 일반적인 방법으로 Rat anti-OVA serum을 얻었으며, 이때 얻어진 anti-OVA serum의 역가 즉, 피내 주사 48시간 후 5 ㎜ 이상의 부종 반점을 나타내는 희석 배수는 1:32로 측정되었다. Anti-OVA serum은 -80 °C에 보관 후 사용하였다.
- 消風散의 알러지성 피부염에 대한 효과를 확인하기 위해, PCA에 의한 Type I 피부염 모델을 이용하여 평가하였다. 항원 노출전 12시간 간격으로 소풍산 물 추출물 500, 250 및 125 ㎎/㎏을 총 4회 경구 투여한 다음, 항원 노출 부위에 누출된 염색액의 양과 누출 직경, 조직병리학적 변화, 혈중 IgE 및 histamine 함량을 DEXA 1 ㎎/㎏ 투여군과 비교 관찰하였다.
- 消風散의 알러지성 피부염에 대한 효과를 확인하기 위해, PCA에 의한 Type I 피부염 모델을 이용하여 평가하였다. 항원 노출전 12시간 간격으로 소풍산 물 추출물 500, 250 및 125 ㎎/㎏을 총 4회 경구 투여한 다음, 항원 노출 부위에 누출된 염색액의 양과 누출 직경, 조직병리학적 변화, 혈중 IgE 및 histamine 함량을 DEXA 1 ㎎/㎏ 투여군과 비교 관찰하였다.
- 항원 및 Evans blue가 함유된 생리식염수 주입 30 분 후, 감작부위의 피부를 적출한 다음 모세혈관 확장에 의해 염색액의 누출이 일어난 부분의 직경을 electronic digital caliper (Mytutoyo, JAPAN)를 이용하여 각각 측정하였다.
대상 데이터
- 1) Rat anti-Ovalbumin의 준비 : Stotland와 Share21)의 방법에 따라 IgE가 함유된 Rat anti-Ovalbumin(OVA)을 준비하였다. 즉, OVA(1.
- 50 마리의 수컷 Sprague-Dawely 랫트(6-wk old upon receipt, SLC, Japan)를 7일간의 순화과 정을 거쳐 실험에 사용하였으며, 순화과정 및 실험전 기간동안 온도(20-25ºC)와 습도(30-35%)가 조절된 사육실에서 랫트용 polycarbonate 사육상자에 5마리씩 수용하여 사육하였고, 명암 주기(light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였으며, 사료(Samyang, Korea)와 음수는 자유롭게 공급하였으며, picric acid로 개체를 식별하였다.
- 본 실험에 사용된 약재는 효성약업사(Daegu, Korea)에서 매입한 것을 현미경하에서 관능검사를 통하여 선정하여 사용 하였으며, 본 실험에 사용된 소풍산 1점 분량의 조성은 Table 1과 같다. 선정된 약제 2점 분량(72 g)을 취하여 정제수 720 ㎖ 로 가열 추출한 후, 흡인 여과한 여과액을 rotary vacuum evaporator(N-N type; LAB Camp, Daejeon, Korea)로 감압·농축하여 점조성의 추출물을 얻은 다음 동결건조기(PVTFD10A; Ilshin Lab.
- 선정된 약제 2점 분량(72 g)을 취하여 정제수 720 ㎖ 로 가열 추출한 후, 흡인 여과한 여과액을 rotary vacuum evaporator(N-N type; LAB Camp, Daejeon, Korea)로 감압·농축하여 점조성의 추출물을 얻은 다음 동결건조기(PVTFD10A; Ilshin Lab., Seoul, Korea)를 사용하여 동결 건조시켜 총 14.06 g(수율 19.53%)의 연갈색의 물 추출물을 얻어 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 모든 수치는 평균 ± 표준편차로 표시하였으며, 다중비교검증을 이용하여 통계처리를 실시하였고, 분산 동질성을 Levene test를 실시하여 검증 하였다. 등분산일 경우, one way ANOVA test를 실시한 다음 least-significant differences(LSD) test 로 사후 검증을 실시하여 군간의 유의성을 측정하였다. 비등분산일 경우에는 비모수 검증인 Kruskal- Wallis H test를 실시하여 유의성이 인정된 경우에는, Mann-Whitney U-Wilcoxon Rank Sum W를 실시하여 군간의 유의성을 검증 하였다.
- 모든 수치는 평균 ± 표준편차로 표시하였으며, 다중비교검증을 이용하여 통계처리를 실시하였고, 분산 동질성을 Levene test를 실시하여 검증 하였다.
- 등분산일 경우, one way ANOVA test를 실시한 다음 least-significant differences(LSD) test 로 사후 검증을 실시하여 군간의 유의성을 측정하였다. 비등분산일 경우에는 비모수 검증인 Kruskal- Wallis H test를 실시하여 유의성이 인정된 경우에는, Mann-Whitney U-Wilcoxon Rank Sum W를 실시하여 군간의 유의성을 검증 하였다. 모든 통계처리는 SPSS for Windows (Release 14.
이론/모형
- Katayama 등22)의 방법에 따라, 직경 10 ㎜의 감작부위 피부를 적출하고, 1.0 N KOH(1.0 ㎖) 용액에 37°C, 48시간 동안 반응시킨 다음, 0.6 NH3PO4(2.5 ㎖)과 acetone(6.5 ㎖)을 첨가하고, 원심분리(900×g, 10min)하여, 그 상층액을 620 ㎚에서 흡광도를 측정하여, 누출된 염색액의 양을 ㎎/site로 정량하였다.
- 실험목적 : 아토피 피부염과 두드러기 치료에 응용되고 있는 消風散의 알러지성 피부염에 대한 효과를 PCA에 의한 Type I 피부염 모델을 이용하여 평가하였다.
성능/효과
- Rat OVA 항혈청과 OVA로 PCA반응을 유발시킨 부위에서는 혈관확장에 의한 현저한 국소 진피 부종 인정되었으나, 이러한 국소 진피 부종은 소풍산 추출물 투여에 의해 현저히 감소되었으며, 진피 에서 국소 부종 부위가 차지하는 비율 및 부종 부위의 장축 길이가 매체 대조군에 비해 소풍산 추출물 투여 용량 의존적으로 유의성 있게 (p<0.01) 감소되었다(Fig. 3).
- 결론: 500 ㎎/㎏의 消風散은 1 ㎎/㎏의 DEXA 투여군과 유사한 PCA (1형 알러지성 피부염)에 양호한 효과를 나타내는 것으로 관찰되어, 아토피 피부염을 포함한 알러지성 피부염 치료에 매우 유용할 것으로 사료된다.
- 본 실험의 결과, 항원 노출 30 분 후, 현저한 모세혈관 확장에 의한 염색액의 누출이 인정되었으며, 혈중 histamine 및 IgE 함량의 증가가 매체 대조군에서 인정되었고, 조직병리학적으로 항원 노출 부위의 부종성 변화가 인정되었다. 한편 투여 용량 의존적으로 소풍산 추출물 투여에 의해 이러한 PCA 반응이 경감되어, 消風散이 즉시형 과민 반응인 1형 알러지성 피부염에 매우 유효할 것으로 판단되었으며, 소풍산 추출물 500 ㎎/㎏의 PCA 에 대한 효과는 1 ㎎/㎏의 DEXA 투여군과 유사한 것으로 관찰되었다.
- 본 실험의 결과, 항원 노출 30 분 후, 현저한 모세혈관 확장에 의한 염색액의 누출이 인정되었으며, 혈중 histamine 및 IgE 함량의 증가가 매체 대조군에서 인정되었고, 조직병리학적으로 항원 노출 부위의 부종성 변화가 인정되었다. 한편 투여 용량 의존적으로 소풍산 추출물 투여에 의해 이러한 PCA 반응이 경감되어, 消風散이 즉시형 과민 반응인 1형 알러지성 피부염에 매우 유효할 것으로 판단되었으며, 소풍산 추출물 500 ㎎/㎏의 PCA 에 대한 효과는 1 ㎎/㎏의 DEXA 투여군과 유사한 것으로 관찰되었다.
- 53%)의 연갈색의 물 추출물을 얻어 실험에 사용하였다. 준비한 소풍산 추출물은 -20˚C의 냉장고에 보관 후 실험에 사용하였으며, 본 실험에서 사용한 용매인 멸균 증류수에 100 ㎎/㎖의 농도까지 비교적 잘 용해되었다.
- 본 실험의 결과, 항원 노출 30 분 후, 현저한 모세혈관 확장에 의한 염색액의 누출이 인정되었으며, 혈중 histamine 및 IgE 함량의 증가가 매체 대조군에서 인정되었고, 조직병리학적으로 항원 노출 부위의 부종성 변화가 인정되었다. 한편 투여 용량 의존적으로 소풍산 추출물 투여에 의해 이러한 PCA 반응이 경감되어, 消風散이 즉시형 과민 반응인 1형 알러지성 피부염에 매우 유효할 것으로 판단되었으며, 소풍산 추출물 500 ㎎/㎏의 PCA 에 대한 효과는 1 ㎎/㎏의 DEXA 투여군과 유사한 것으로 관찰되었다. PCA 반응시 감작부 위에서 염색액의 누출은 모세혈관 확장에 의하며23), 이러한 누출 반점의 직경 및 누출된 염색시료의 감소는 모세혈관 확장을 억제하는 것으로 의미 한다24,25).
- 실험결과 : 항원 노출 30 분 후, 현저한 모세혈관 확장에 의한 염색액의 누출이 인정되었으며, 혈중 histamine 및 IgE 함량의 증가가 매체 대조군 에서 인정되었고, 조직병리학적으로 항원 노출 부위의 부종성 변화가 인정되었다. 한편 투여 용량 의존적으로 소풍산 추출물 투여에 의해 이러한 PCA 반응이 경감되었고, 소풍산 추출물 500 ㎎/㎏의 PCA 에 대한 효과는 1 ㎎/㎏의 DEXA 투여 군과 유사한 것으로 관찰되었다.
후속연구
- 소풍산은 當歸, 生地, 防風, 蟬蛻 知母, 苦蔘, 胡 麻, 荊芥, 蒼朮, 牛蒡子, 石膏, 甘草, 木通 등 13종의 약재로 구성되어 있으며, 각각 수 많은 생리활성 물질을 함유하고 있어18,34), 금후 개별 구성 약재에 대한 구성 약재 각각에 대한 효능 및 생리활성을 나타내는 화학성분의 검색을 수행해야 할 것으로 판단된다. 이상의 결과에서, 500 ㎎/㎏의 消 風散은 1 ㎎/㎏의 DEXA 투여군과 유사한 PCA (1형 알러지성 피부염)에 양호한 효과를 나타내는 것으로 판단되었으나, 구성 약재 각각에 대한 효능 및 생리활성을 나타내는 화학성분의 검색과 더불어 금후 다양한 방면으로 기전적인 연구를 더 수행해야 할 것으로 판단된다.
- , 금후 개별 구성 약재에 대한 구성 약재 각각에 대한 효능 및 생리활성을 나타내는 화학성분의 검색을 수행해야 할 것으로 판단된다. 이상의 결과에서, 500 ㎎/㎏의 消 風散은 1 ㎎/㎏의 DEXA 투여군과 유사한 PCA (1형 알러지성 피부염)에 양호한 효과를 나타내는 것으로 판단되었으나, 구성 약재 각각에 대한 효능 및 생리활성을 나타내는 화학성분의 검색과 더불어 금후 다양한 방면으로 기전적인 연구를 더 수행해야 할 것으로 판단된다.
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