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문제 정의
- 본 연구에서는 서울시 종로구 등에 위치한 대중 목욕탕의 수질에서 분원성 대장균군, 대장균 등의 지표 미생물과 16S rRNA gene의 염기서열을 이용한 다양한 종류의 미생물을 파악하여 현 실태를 조사하고 목욕탕이용자들의 인체위해 가능성을 파악하고자 한다.
가설 설정
- 0 mg/Z 미만으로 규정하고 있는데 이러한 수돗물을 바로 욕탕 수로 사용하는 경우 14번 샘플과 같이 잔류염소가 높게 검출되는 것으로 생각된다. 또한 업소에 따라 사용하는 수질의 종류가 다르고 정수지와 관말사이에서의 온도, 체류시간, 급수거리에 따라 잔류염소의 감소율이 다르므로1。)욕탕수의 잔류염소농도에는 다양한 요인들이 관여할 것으로 분석된다. 본 연구에서 측정된 잔류염소의 농도는 대부분 수영장의 잔류염소 수질의 하한치에 미달하는 것点 나타나, 미생물의 살균 효과가 제한적일 수 있을 것으로 보인다.
제안 방법
- 35°C 또는 44。<2에서 24시간 배양한 다음 comparator와 비교하여 더 진한 황색을 나타내는 것을 총대장균군과 분원성대장균군 양성으로 판정하였다. 또한 대장균은 MUG를 분해하여 UV하에서 형광을 나타나게 하는 [3-glucuronidase> 생성하므로 fluorescence analysis cabinet (Spectroline®, US A)를 이용하여 형광을 나타내는 것을 양성으로 판정하였다.
- 5 以의 조성으로 pre-denature# 94°C 5분 동안 반응한 다음 94°C 1분, 46°C 1분, 72°C 1분 30 초의 세 단계를 35 cycle 반복한 후 72°C 10분 동안 final extention한 PCR 산물을 4。(2에 보관하였다. PCR 산물은 1% agarose gel에 전기영동하여 1, 466 bp 크기의 증폭산물을 QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였다. 정제된 DNA는 염기서열분석을 위하여 의뢰하였다(Cosmo, Korea).
- CoUlert® kit의 사용방법은 제조자의 지시에 따라 진행하였으며 정량검사를 위해 Quanti-Tray®72000을 이용하여 35°C 또는 44。<2에서 24시간 배양한 다음 comparator와 비교하여 더 진한 황색을 나타내는 것을 총대장균군과 분원성대장균군 양성으로 판정하였다. 또한 대장균은 MUG를 분해하여 UV하에서 형광을 나타나게 하는 [3-glucuronidase> 생성하므로 fluorescence analysis cabinet (Spectroline®, US A)를 이용하여 형광을 나타내는 것을 양성으로 판정하였다. 이와 같은 효소 발색을 나타내는 색의 수를 산출하여 최확수법(most probable number, MPN) 표를 통해 정 량적 인 수치 (MPN/lOOnV)를 나타내었다.
- 보통한천배지에서 배양 시 집락을 형성하지 않는 4지점을 제외한 나머지 지점의 샘플은 세균이 배양되었으며 각 배지에서 두 개의 집락 만을 선택하여 액체배양후 16S rRNA gene을 분석하였다. 분석된 미생물은 Acinetobacter, Bacillus, Klebsiella, Halomonas 순으로 많이 발견되었다([Table 1]).
- 정제된 DNA는 염기서열분석을 위하여 의뢰하였다(Cosmo, Korea). 염기서열의 동정은 미국 NCBI (National Center for Biotechn이ogy Informatioii)에서 제공하는 BLAST# 이용하여 미생물을 분석을 하였다.
- 추출한 DNA를 주형으로 PCR 을 통해 16S rRNA를 증폭한 다음 QIAquick Gel Extraction Kit를 사용하여 정제하였다. 욕조수 내의 총 세균의 종류를 동정하기 위해 정제된 DNA를 pGEM®- T Easy Vector Systems (Promega, USA)을 사용하여 재조합 DNA를 만들고 Chemically competent E. coli 에 형질전환 시켰다. 형질전환된 E.
- 욕조수 농죽액 2 m/ 중 1 mZ를 G-spin™ Genomic DNA Extraction Kit를 이용하여 세균의 genome DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 주형으로 PCR 을 통해 16S rRNA를 증폭한 다음 QIAquick Gel Extraction Kit를 사용하여 정제하였다.
- PCR 산물은 1% agarose gel에 전기영동하여 1, 466 bp 크기의 증폭산물을 QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였다. 정제된 DNA는 염기서열분석을 위하여 의뢰하였다(Cosmo, Korea). 염기서열의 동정은 미국 NCBI (National Center for Biotechn이ogy Informatioii)에서 제공하는 BLAST# 이용하여 미생물을 분석을 하였다.
- 배양하였다. 집락수를 계수한 다음 각각의 한천배지에서 2개의 집락을 선택하여 액체배지에 배양한 후 G-spin™ Genomic DNA Extraction Kit (INTRON Biotechnology, Korea)를 이용하여 미생물의 genomic DNA를 주줄 하였다. Genomic DNA에서 16S rRNA의 증폭은 기존에 入卜용된 universal primer set (27F, 1492R)를 이용하였다.
- c湖는 ampicillin이 포함된 LB 배지에 도말하여 16시간 후 배지에서 다섯 개의 집락을 선택하였다. 집락을 액체배지에 배양한 후 plasmid miniprep kit (Labopass, Korea) 를 시■용하여 plasmid를 정제하여 염기서열 분석을 수행 하였고 BLAST를 이용하여 비교분석 하였다.
- 추출하였다. 추출한 DNA를 주형으로 PCR 을 통해 16S rRNA를 증폭한 다음 QIAquick Gel Extraction Kit를 사용하여 정제하였다. 욕조수 내의 총 세균의 종류를 동정하기 위해 정제된 DNA를 pGEM®- T Easy Vector Systems (Promega, USA)을 사용하여 재조합 DNA를 만들고 Chemically competent E.
대상 데이터
- 채수가 이루어졌다. 기능성 약재나 온도에 의한 영향을 줄이기 위해 수온 40°C 이하의 일반 온탕수 만을 대상으로 하였다. 목욕탕의 종류는 소규모 목욕탕과 24 시간 동안 운영되는 찜질방을 포함하였으며 여탕 10 건, 남탕 4건으로 총 14군데의 목욕탕에서 1Z 폴리에틸린 재질의 일회용 채수병을 사용하여 중복채수 하여 총 28건의 샘플을 수집하였다.
- 기능성 약재나 온도에 의한 영향을 줄이기 위해 수온 40°C 이하의 일반 온탕수 만을 대상으로 하였다. 목욕탕의 종류는 소규모 목욕탕과 24 시간 동안 운영되는 찜질방을 포함하였으며 여탕 10 건, 남탕 4건으로 총 14군데의 목욕탕에서 1Z 폴리에틸린 재질의 일회용 채수병을 사용하여 중복채수 하여 총 28건의 샘플을 수집하였다. 채수 시간은 오전 10시부터 오후 7시까지 다양한 시간에 이루어 졌으며, 채수후 1시간 이내에 농축 및 지표미생물의 배양을 진행하였고 보관이 필요할 경우 41에 냉장 보관하였다.
- 본 연구에서는 서울시 종로구에 위치한 14개의 목욕시설 중 온탕 내에 존재하는 대장균과 병원성 미생물을 조사하였으며, 그 결과는 다음과 같다.
- 서울시 종로구에 위치한 목욕탕내의 미생물 분포를 조사하기 위해 2008년 10월, 11월에 걸쳐 욕조수에 대한 채수가 이루어졌다. 기능성 약재나 온도에 의한 영향을 줄이기 위해 수온 40°C 이하의 일반 온탕수 만을 대상으로 하였다.
- coli 에 형질전환 시켰다. 형질전환된 E. c湖는 ampicillin이 포함된 LB 배지에 도말하여 16시간 후 배지에서 다섯 개의 집락을 선택하였다. 집락을 액체배지에 배양한 후 plasmid miniprep kit (Labopass, Korea) 를 시■용하여 plasmid를 정제하여 염기서열 분석을 수행 하였고 BLAST를 이용하여 비교분석 하였다.
이론/모형
- 총 14지점에서 채수한 욕조수를 약 "씩 미생물의 배양 및 16S rRNA 증폭을 위해 막여과법(nitrocellulose 재질, 0.45 (Am pore size, Pall Life Sciences, US A)을이용하여 미생물을 농축하였다. 농축된 여과지는 코니칼 튜브에 넣 어 phosphate buffered saline (PBS) 10mZ와 함께 약 1분간 강하게 진탕한 다음 여과지를 제거하고 10, 000RPM에서 10분간 원심분리하여 농축액을 의 PBS에 재부유시켜 실험에 사용하였다’
- 또한 대장균은 MUG를 분해하여 UV하에서 형광을 나타나게 하는 [3-glucuronidase> 생성하므로 fluorescence analysis cabinet (Spectroline®, US A)를 이용하여 형광을 나타내는 것을 양성으로 판정하였다. 이와 같은 효소 발색을 나타내는 색의 수를 산출하여 최확수법(most probable number, MPN) 표를 통해 정 량적 인 수치 (MPN/lOOnV)를 나타내었다.
- 채집된 욕조수에 대한 잔류염소는 Free Chlorine ISM (HANNA, USA)을 사용하여, 제조사의 지시에 따라 측정 하였다. 이 장비 는 EPA (Environmental Protection Agency)에서 제안한 DPD (N, N-dimethyl-p- phenylenediamine) 방법을 사용하며, 유리잔류염소 (firee chlorine)와 DPD reagent의 반응에 의한 분홍색의 발색을 파장 555nm에서 흡광도를 측정하는 방법이다.
- 총 대장균군, 분원성 대장균군, 및 대장균 등의 수질 지표 미생물은 효소발색법에 기초한 Colilert® kit (IDEXX, USA)를 이용하여 분석을 수행하였다. CoUlert® kit의 사용방법은 제조자의 지시에 따라 진행하였으며 정량검사를 위해 Quanti-Tray®72000을 이용하여 35°C 또는 44。<2에서 24시간 배양한 다음 comparator와 비교하여 더 진한 황색을 나타내는 것을 총대장균군과 분원성대장균군 양성으로 판정하였다.
성능/효과
- 1. 대부분 수질의 잔류염소의 평균 농도는 수영장 수질 기준에 미치지 못하였다. 오직 1지점에서만 검출 한계 이상의 농도(>2.
- 2. 지표미생물 분석에서 총대장균군은 전체 14곳 중 43%가, 분원성대장균군은 29%, 대장균은 7%에서 수질 기준을 만족하지 못했다.
- 4. 약 10개(71%) 지점에서 인체에 유해한 기회병원 성미 생 ^(Acinetobacter baumannii, Acinetobacter junii, Bacillus cereus, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas otitidis 등)이 배양되었다.
- 발견된 것으로 나타났다. 대중 목욕장의 수질 기준 및 위생관리의무를 위반할 시에는 개선명령 후 과태료를 부과하게 되어 있으나 수질검사의 횟수나 기간에 대한 규정이 명확하지 않아 본 사례와 같이 불시에 샘플링을 실시하였을 경우는 대다수의 영업장이 수질 기준을 준수하지 못하는 것으로 확인되었다. 욕조수의 경우 이용자의 위생상태, 물의 교환횟수, 배수되는 물의 재순환여부 등에 따라 수질에 큰 차이가 있으므로장시간 동안 깨끗한 수질을 유지하기 위해서는 개인의 위생 관념과 업주들의 청결을 유지하려는 노력이 필요할 것이다.
- 또한 업소에 따라 사용하는 수질의 종류가 다르고 정수지와 관말사이에서의 온도, 체류시간, 급수거리에 따라 잔류염소의 감소율이 다르므로1。)욕탕수의 잔류염소농도에는 다양한 요인들이 관여할 것으로 분석된다. 본 연구에서 측정된 잔류염소의 농도는 대부분 수영장의 잔류염소 수질의 하한치에 미달하는 것点 나타나, 미생물의 살균 효과가 제한적일 수 있을 것으로 보인다. 가존 연구에서 유리 잔류염소의 농도는 1.
- 본 연구의 미생물 실태조사를 통하여 서울시 종로구에 위치한 대중 목욕탕 중 절반가량은 총대장균군 수질 기준을 초과하며 이들 목욕장에서 병원성 미생물도 상당수 발견된 것으로 나타났다. 대중 목욕장의 수질 기준 및 위생관리의무를 위반할 시에는 개선명령 후 과태료를 부과하게 되어 있으나 수질검사의 횟수나 기간에 대한 규정이 명확하지 않아 본 사례와 같이 불시에 샘플링을 실시하였을 경우는 대다수의 영업장이 수질 기준을 준수하지 못하는 것으로 확인되었다.
- 16S rRNA gene을 분석하였다. 분석된 미생물은 Acinetobacter, Bacillus, Klebsiella, Halomonas 순으로 많이 발견되었다([Table 1]). AcSeSbacW속 중에서 특히 A.
- 3]에 나타내었다. 약 1.5 kb의 鉴R 산물을 cloning에 사용하여 염기서열을 분석한 결과 가장 많이 발견된 세균은 Gulbenkiania mobilis로 전체 14곳 중, 5지점(36%)에서 동정되었다. 또한 Tepidimonas sp가 4 지점(29%), Acinetobacter sp.
- 욕탕수 농축액에서 16S rRNA gene의 cloning을 통하여 수질에 존재하는 총 세균의 종류를 동정한 결과, 2지점은 세균이 검출되지 않았으며, 나머지 12지점에서 다양한 종류의 세균이 검출되었다([Table 1]), 16SrRNA를 증폭하기 위한 universal primer의 증폭 산물은 [Fig. 3]에 나타내었다. 약 1.
- 2]에서 3, 5, 7, 8, 13, 14번 지점으로 주로 오후 4시에서 6시에 채수된지점이 총대장균군 오염도가 높은 것으로 드러났다. 이 결과를 [Fig. 1]의 잔류염소 농도와 비교하기 위해 Spearmen 상관분석을 실시한 결과 순위상관계수가 0.241 로 약한 양적 선형관계를 나타내었지만 통계학적으로 유의하지 않은 것으로 나타났다(p-value>0.05) (SPSS ver. 12.0, USA). 그러나 본 실험의 샘플 수가 극히 제한적이고 잔류염소의 농도가 수영장의 수질 기준을 초과하는 곳은 1지점만이므로 이 자료만으로 잔류염소가 미생물의 농도를 감소시킬 수 없다는 결론을 내리기 어려우므로, 차후 추가적인 현장시료의 분석을 통하여 연관성을 확인할 필요가 있다.
- 본 연구의 한계점으로는 세 가지가 있다. 첫째, 샘플을 농죽하는 과정 에서 pore size 0.45 pn filter® 사용하여 이보다 작은 세균(0.2-0.45 剛)이 샘플링이 되지 않았을 가능성이 존재한다. 둘째, 일회적 샘플링이기 때문에 시간대별 사람 수, 욕조수의 교환시기, 욕조 수량 등을 고려하지 않아 샘플링 bias를 일으킬 가능성이 있다.
- 이중분원성 대장균군은 4지점(29%), 대장균은 1지점(7%)에서 검출되어 수질기준을 만족하지 못했다. 총대장균군이 기준치 이상으로 검출된 곳은 [Fig. 2]에서 3, 5, 7, 8, 13, 14번 지점으로 주로 오후 4시에서 6시에 채수된지점이 총대장균군 오염도가 높은 것으로 드러났다. 이 결과를 [Fig.
후속연구
- 0, USA). 그러나 본 실험의 샘플 수가 극히 제한적이고 잔류염소의 농도가 수영장의 수질 기준을 초과하는 곳은 1지점만이므로 이 자료만으로 잔류염소가 미생물의 농도를 감소시킬 수 없다는 결론을 내리기 어려우므로, 차후 추가적인 현장시료의 분석을 통하여 연관성을 확인할 필요가 있다.
- 본 연구에서 발견된 병원성 미생물들은 호흡기 , 구강 및 상처 난 부위를 통해 감염되므로 다중이용시설 등이 오염될 경우 집단 감염에 따른 피해가 클 것으로 예상되므로 정기적인 위생실태조사와 감시가 필요하다. 또한 관리자 및 이용자에게 올바른 입욕 문화 형성을 위한 홍보와 교육, 철저한 위생관리 및 계속적인 자료의 발표가 필요하다.
- 수 있는 민감한 검사라고 할 수 있다. 본 연구에서는 cloning후 생성된 모든 집락을 screening 하지 못하고 배지당 두 개의 집락만을 테스트 했으므로 욕탕수 농축액에 존재하는 모든 세균을 검줄하기에는 한계가 있다. 그러나 배양이 가능한 세균은 물론 생존력이 없는 naked DNA 등 배양이 불가능한 다양한 미생물을 검출하여 욕탕수 중의 미생물 분포를 폭넓게 이해할 수 있다는 점에서 의의가 있다.
- 둘째, 일회적 샘플링이기 때문에 시간대별 사람 수, 욕조수의 교환시기, 욕조 수량 등을 고려하지 않아 샘플링 bias를 일으킬 가능성이 있다. 셋째, 목욕탕 수질 기준에 제시된 5가지 검사 종목을 모두 시행하지 못하고 미생물 분석만 수행하여 수질 기준 적합성 여부를 판단하는데 제 한점이 존재한다.
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