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문제 정의
- 그러나 이러한 식물 소재에 포함될 수 있는 phytoestrogen의 과다한 섭취는 남성에게 부작용을 유발할수 있어 기능성 소재로서 활용에 앞서 식품안전성 확보가요구된다. 따라서 기능성 원료로 새롭게 주목 받고 있는호박종자추출물의 에스트로겐 활성의 존재여부를 측정하고자 하였다.
제안 방법
- 03에 되도록희석한 후 10 mM CuSC)4(5 μl/ml)를 넣어 receptor를 발현을 개시하였다. 50 ml conical tube에 분주된 재조합 효모배양액에 호박종자추출물, 양성대조군 및 음성대조군을 각각 5 μl씩 처치하고, 배양기에서 30℃, 150rpm으로 18시간 배양하였다. 호박종자추출물은 에탄올에 희석하여 250mg/ml의 농도가 되도록 준비하고 10배 단계 희석하여샘플을 준비하였다.
- 에스트로젠 활성 측정에 사용한 재조합 효모 균주 Saccharomyces cerevisiae ER+LYS 8127(YER)은 서울대학교 수의과대학 수의공중보건학 연구실에서 분양 받아 사용하였다. 균주의 배양은 Yeast Nitrogen Base(without amino acid, 67 g/ml, YNB: Invitrogen, USA), 1% dextrose, L-lysine (36 pig/ml), 그리고 L-histidine (24 ㎍/ml)이 혼합된 선택 증균 배양액을 이용하여 30℃ 배양기(EYELA, LTI-600 SD, Japan)에서 150rpm으로 진탕 배양(OPTIMA, orbital shaker, os-752, Japan)하였다. 재조합 효모는 분광광도계 (Spectronic 20 Genesys, Spectronic instruments, USA) 로 측정한 600nm O.
- 균주의 배양은 Yeast Nitrogen Base(without amino acid, 67 g/ml, YNB: Invitrogen, USA), 1% dextrose, L-lysine (36 pig/ml), 그리고 L-histidine (24 ㎍/ml)이 혼합된 선택 증균 배양액을 이용하여 30℃ 배양기(EYELA, LTI-600 SD, Japan)에서 150rpm으로 진탕 배양(OPTIMA, orbital shaker, os-752, Japan)하였다. 재조합 효모는 분광광도계 (Spectronic 20 Genesys, Spectronic instruments, USA) 로 측정한 600nm O.D.값이 1.0에서 2.0사이에 도달할 때까지 배양한 후 본 실험에 사용하였다.
- 0)를각 well에 100 ul씩 처리 하여 P-Galactosidase 활성을 유도하고 20분이 지난 뒤 420nm에서 OD를 측정하였다. 측정된 각각의 3개 well의 값을 평균 낸 후 420nm에서 측정한 값에서 590nm에서 측정한 값을 뺀 후 반응 정도를 살펴보았다.
대상 데이터
- 호박종자추출물은 에탄올에 희석하여 250mg/ml의 농도가 되도록 준비하고 10배 단계 희석하여샘플을 준비하였다. 양성대조군으로 사용되는 estradiole 10배 단계 희석하여 # 농도를 준비하였으며, Vehicle controle 추출물 용해시 사용한 100% ethanol이사용되었다. 배양 후 배양액에 희석하며 600nm에서 OD 값이 0.
- 에스트로젠 활성 측정에 사용한 재조합 효모 균주 Saccharomyces cerevisiae ER+LYS 8127(YER)은 서울대학교 수의과대학 수의공중보건학 연구실에서 분양 받아 사용하였다. 균주의 배양은 Yeast Nitrogen Base(without amino acid, 67 g/ml, YNB: Invitrogen, USA), 1% dextrose, L-lysine (36 pig/ml), 그리고 L-histidine (24 ㎍/ml)이 혼합된 선택 증균 배양액을 이용하여 30℃ 배양기(EYELA, LTI-600 SD, Japan)에서 150rpm으로 진탕 배양(OPTIMA, orbital shaker, os-752, Japan)하였다.
- 연구에 사용된 호박종자추출물은 이산화탄소를 이용한초임계 추출법으로 분리하고 maltodextrin으로 분말화 가공한 제품을 RIA INTERNATIONAL LLC(NJ, USA)에서 구입한 후 4℃에서 보관하며 실험에 사용하였다. 호르몬활성 즉정을 위한 양성대조 시료는 Sigma Chemical Co.
- 재조합 효모는 양성대조 시약인 17B-Estradiol(E2) 처치에 강한 에스트로겐 활성을 나타내었다. 처치된 17p-Estradiol의 농도 희석에 따라 에스트로겐 활성이 일부 감소하는 경향이 있었으며, 10'l0M 이하의 농도에서는 호르몬 활성이 현저히 감소되 었다(Data not shown).
- 호르몬활성 즉정을 위한 양성대조 시료는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MI, USA)에서 170-Estradiol(E2)을 구입하였다. Park의 연구에서 phytosterol의 추출온도에 따른 추출량은유의적 차이가 없었고일반적으로 호박씨를 생으로 섭취하고 분말형태의 시료임을 감안하여 각 재료는 100% Ethanol을 이용하여 40℃에서 15분간 추출하여 각각의 농도로 희석하였다.
데이터처리
- 1, SAS Institute, Cary, NC, USA)의 ANOVA procedure을 이용하여 분석되었다. 각각의 처리군이 통계적으로 유의적으로 나타나는 경우에 (PM0.05)각각의 3반복 실험에 의한 평균값은 DuncanE multiple range test를 이용하여 분석하였다.
- 모든 실험은 3반복으로 수행되었으며 관찰된 실험결과는 SAS 통계 프로그램 (version 9.1, SAS Institute, Cary, NC, USA)의 ANOVA procedure을 이용하여 분석되었다. 각각의 처리군이 통계적으로 유의적으로 나타나는 경우에 (PM0.
성능/효과
- 또한 양성대조군과 실험군과의 통계학적 유의성 검정에서도.모든 실험군의 에스트로겐 활성값이 유의하게 (PM0.05) 낮게 관찰되었다 (Fig. 1).
- 약용식물 9종의 추출물 중에서 7종의 추출물은 에스트로겐 활성을 나타내었으며, 4종의 추출물은 안드로겐 활성을 나타내는 것으로 조사되어 식물 추출물 중에서 phytoestrogen0] 상당히 포함되어 있음을 제시하였다. 한편 에스트로겐 양성 세포주 MCF-7의 증식능 실험에서는 한국산 약용식물 추출물 9종 중에서 8종의 추출물이 유방암 세포주의 증식을 유의적으로 억제하였다고 보고하였다.
- 재조합 효모를 이용한 에스트로겐 활성 측정 실험에 사용된 호박종자추출물은 Phytoestrogen을포함하는 다른 식물성 추출물들과 달리 에스트로겐 활성을 갖지 않는 것으로 조사되었다. 다만 Lee 등의 연구와 같이 호박 종자 추출물의 대사산물이 에스트로겐 활성을 갖는지 여부는 조사되지 못 하였다13).
- 강한 에스트로겐 활성을 나타내었다. 처치된 17p-Estradiol의 농도 희석에 따라 에스트로겐 활성이 일부 감소하는 경향이 있었으며, 10'l0M 이하의 농도에서는 호르몬 활성이 현저히 감소되 었다(Data not shown). 따라서 양성대조군은 10-9M estradiol을 처치하였다.
- 따라서 양성대조군은 10-9M estradiol을 처치하였다. 최종농도 250 ug/ ml~2.5 pg/ml 호박종자주줄물을 처치한 모든 실험군에서 뚜렷한 에스트로겐 활성이 관찰되지 않았다. 또한 양성대조군과 실험군과의 통계학적 유의성 검정에서도.
후속연구
- 그러나 최근 실험동물에서 수행된 호박 종자 추출물 실험에서 에스트로겐 활성에 따른 부작용 보고가 없는 것을 근거로 대사산물의 에스트로겐 활성과 상관성이 없을 것으로 추정할 수 있다. 따라서 향후 수행될 연구에서는 호박종자추출물의 대사산물의 에스트로겐 활성 측정 또는 MCF-7 세포주 등을 이용한 추가적인 연구가 수행될 필요가 있다고 하겠다. 한편 본 연구결과와 같이 호박종차추출물의 에스트로겐 활성 부재는 식품 안전성 확보 측면에서 중요한 의미로 해석될 수 있다.
- 한편 본 연구결과와 같이 호박종차추출물의 에스트로겐 활성 부재는 식품 안전성 확보 측면에서 중요한 의미로 해석될 수 있다. 또한 호박 종자 추출물은 건강기능식품의 안전한 식품소재로 활용될 수 있을 것이다.
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