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제안 방법
- FCV RNA 검출과 상대정 량에 필요한 역 전사 PCRe one 야ep으로 real-time PCR 기법을 사용하여 실시하였디i 역전사 PCR 반응의 정확성을 확인하고 바이러스의 회수와 농축에사용된 beef extract와 같은 물질이 가지는 PCR 억제효과를확인하기 유■「해 internal control 물질 (합성 RNA, USFDA, United States Patent Application #20060166232)을 口H 반~응.구14 다 [“L씩 가하여 다중 채널 검출을 실시하였다.
- 구14 다 [“L씩 가하여 다중 채널 검출을 실시하였다. One step real-time PCRe Qiagen OneStep RT-PCR Kit (Qiagen Co., Holland)를 사용하여 Thermal Cycler Dice Real Time System (Takara Bio Inc., Japan)에서 역전사 50℃, 50분 그리고 효소활성화를 95℃, 15분 실시한 후 94℃」5초, 62饥20초, 72饥40초의 반응을 45회 반복하여 실시하였다. 반응에 사용된 FCV 및 internal control 검 줄에 사용된 primer와 probe 정보는 Table 1과 같다.
- 사용하였다. 바이러스 풀을 얻기 위해 (1) CrFK 단일세포층이 잘 형성된 플라스크를 선택하여 상층의배지를 홉입제거하고, (2) 바이러스 현탁액 200“L를 플라스크에 접종한 후, 37로37 ℃ 로 조정된 humidified 5% CO2 incuba心■에 90분간 배양하여 바이러스가 흡착되도록 하였다. 그리고 (4) 7mL의 maintenance media (DMEM+2% FBS)를가하여 샹기한 조건에서 배양하여 바이러스 작용으로 단일세포층이 90%가 파괴될 때까지 배양하였다.
- 음전하 필터를 이용한 바이러스의 회수는 pore size 0.45 um, 직경 47 mm의 HA type membrane filter (Nihon Miiipore, Tokyo, Japan) (HAMF)을 사용하여 Katayama 등 (2002)의 방법을 응용하여 실시하였다. 그 과정을 요약하면, HAMP®] GF/C glass filter (Whatman, England)를 앞뒤로 배치시킨 뒤 FCV를접종한 해수 시료 10 L를 여과하여 (유속: 1.
- 이 연구에서는 바이러스 최종 회수율 계산은 的이-time PCR 로 얻어진 RT-PCR 갸丽을 사용하였다. 그래서 무기시약을사용하는 음전하 필터인 HAMF법과는 달리 양전하를 띠는 NCCF법에는 유기물인 beef extract/} 사용되기 때문에 PCR 방해물질 제거 단계가 필요한지 확인하였다' 그 결과 PCR 방해물질을 제거한 경우에는 모든 반응구예서 양호한 PCR이진행됨을 알 수 있었으며 (Fig.
- 이에 대한 대안을 칯-고자 이 연구에서는 최근 nano 시umina (A1OOH) fiber를 활성 성분으로 하여 제작된 NanoCeram (Argonide, Sanford, FL) cartridge Eter의 자연해수 중 norovirus surrogate (feline calicivirus) 회수능력을 HA negative charge membrane fHtei■와 비교하였다.
- 3%로 나타나 모든 반응구에서 주형 RNA량과 검출 cycle (Ct 값) 사이에 적절한 상관관계를 얻을 수 있었다. 표준 곡선에서 산출된 방정식을 사용하여 시료의 효 CR 반응에서 얻어진 Ct 값을 대입하여 바이러스의 농도를 역산하여 회수율을 산정하였다.
- 제거한 자연 해수를 사용하였다. 해수 10L에 노로바이러스 swrogate으] FCV를 최종농도 10 TCIDso (Tissue Culture Infectious Dosee/mL이 되도록 접종하였다.
- 해수에 접종한 FCV의 회수율 계산과 이 실험에 사용한 one step re시布me RT-PCR의 검출한계를 파악하기 위해 표준 곡선을 작성하였다 (Fig. 1). 검출한계는 virus였으며 RT-PCR의 효율은 93.
- 회수된 바이러스의 상대적 정 링: (RT-PCR unit)을 위해 실험에 사용된 FCV 배양액 (8 logl0TCIDwL니)을 10°, 10 血까지 단계 희석한 후 각 희석액을 상기한 조간과 동일 조건에서 one step real-time RT-PCR을 실시하여 표준 검 량선 (standard curve)을 작성하였다. 표준 검량 선의 작성을 위한 통계처리에는 Thermal Cycler Dice Real Time TP 800 Software (Ver.
대상 데이터
- FCV (feline calicivirus) 인공배양을 위한 cell 血©은 Crandall-Reese feline kidney (CrFK) cell (ATCC#CCL-94)을이용하였다. 75 cm2 배양 플라스크 (Costar, Canada)에 10% fetal bovine serum (FBS) 이 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)을 적량 분주한 후 cell<- 접종하고 37℃로조정된 humidified 5% CO2 inc냐bafoF에서 배양하였다.
- 노로바이러스 surrogate는 FCV (feline calicivirus) Strain F9 (ATCC#VR-782)을 사용하였다. 바이러스 풀을 얻기 위해 (1) CrFK 단일세포층이 잘 형성된 플라스크를 선택하여 상층의배지를 홉입제거하고, (2) 바이러스 현탁액 200“L를 플라스크에 접종한 후, 37로37 ℃ 로 조정된 humidified 5% CO2 incuba心■에 90분간 배양하여 바이러스가 흡착되도록 하였다.
- 해수는 부산광역시 기쟝군 기장읍 시랑리 408」번지 인접 연안에서 취수하여 여과와 UV 조사를 실시하여 이물질과 미생물을 제거한 자연 해수를 사용하였다. 해수 10L에 노로바이러스 swrogate으] FCV를 최종농도 10 TCIDso (Tissue Culture Infectious Dosee/mL이 되도록 접종하였다.
데이터처리
- 작성하였다. 표준 검량 선의 작성을 위한 통계처리에는 Thermal Cycler Dice Real Time TP 800 Software (Ver. 2.10B, Takara Bio Inc, , Japan)를 사용하였다.
이론/모형
- 농축은 C야miprep Concentrator (YM-50, Millipore, USA)를 사용하여 3, 000 x g에서 15분간 (4℃) 원심분리를 34회 반복하여 실시하였다. NCCF를 사용하여 회수한 시료의 농축액은 PCR 방해물질의 제거를 위해 Fout et 요L (2003)의 방법에 따라 처리하였다.
- 음전하 필터를 이용한 바이러스의 회수는 NanoCeram (Argonide, Sanford, FL) electropositive cartridge filter (NCCF)를사용하여 Karim et aL (2009)의 방법을 옹용하여 실시하였다. 그 과정을 요약하면, FCV를 접종한 해수 시료 10 L를 여과하여(유속: 1.
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