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문제 정의
- 따라서 본 연구팀에서는 부들 화분의 생리활성에 관한 연구를 수행하던 중 부들 화분의 혈전용해능이 있음을 확인하고 혈전 용해 물질의 특성 규명이 필요하게 되었다. 특히 본 연구에서는 부들 화분으로부터 혈전용해 효소를 분리 정제하고 순도를 확인한 다음 정제한 혈전용해 효소의 특성을 조사하여 보고하는 바이다.
- 따라서 본 연구팀에서는 부들 화분의 생리활성에 관한 연구를 수행하던 중 부들 화분의 혈전용해능이 있음을 확인하고 혈전 용해 물질의 특성 규명이 필요하게 되었다. 특히 본 연구에서는 부들 화분으로부터 혈전용해 효소를 분리 정제하고 순도를 확인한 다음 정제한 혈전용해 효소의 특성을 조사하여 보고하는 바이다.
제안 방법
- 0.1M-Tris완충액(pH 7.5)에 용해된 1% casein에 정제 효소액과 금속이온농도가10-3M되도록 첨가하여 40℃에서 1시간 반응시켜 효소활성을 측정하여 금속이온 영향을 검토하였다. 여러 종류의 저해제를 정제 효소액에 가하여 최종농도가 10mM가 되도록 조정한 후 1% casein용액을 가하여 37℃, 1시간 반응시킨 다음 생성된 tyrosine equivalent양을 측정하여 무 첨가구와 비교하여 %로 표시하였다.
- 5)에 1% 농도가 되도록casein을 용해시켜 효소액을 가하고 30～80℃에서 1시간 반응시켜 온도에 따른 효소활성을 측정하였다. 0.1M-Tris완충용액(pH 7.5)에 효소액을 가한 후 30～80℃에서 1시간 방치하여 잔존하는 효소 활성을 측정하여 안정성을 검토하였다.
- 0.1M-Tris완충용액(pH7.5)에 1% 농도가 되도록casein을 용해시켜 효소액을 가하고 30～80℃에서 1시간 반응시켜 온도에 따른 효소활성을 측정하였다. 0.
- Glass column(2.8×44cm)에 Sigma제 DEAE-Cellulose를 충진 시키고 0.1M Tris-HCl buffer용액(pH 7.5)으로 미리 평형 시킨 후 sample 15ml을 loading하고 NaCl을 1M로 gradient하였으며 50mL/hr속도로 용출하여 10mL씩 분획을 받아 효소 활성을 측정하였다.
- Robbin 방법(15)을 변형하여 사용하였다. 즉, 4% α-casein 용액 2mL에 Tris-lysine-NaCl-EDTA buffer 1.
- Sephadex G-150 column에 의해 분획된 sample은 농축한 후 reversed-phase C18 column(Agilent C18, 4.60×250mm, 5㎛)를 이용하여 혈전 용해능이 있는 분획을 HPLC로 분리 하였다.
- 각 기질을 0.1M-Tris 완충액(pH 7.5)에 용해하고 기질 농도 10mg/mL가 되도록 효소액과 기질을 혼합하여 40℃에서 1시간 반응 시켜 단백질의 가수분해 정도를 340nm에서 흡광도를 측정하여 비교 표시하였다.
- 4)에 용해 시킨 뒤 Sephadex G-150 column에 주입하고 동일한 buffer로 시간당 18mL의 유속으로 용출시키면서 tube당 5mL씩 분획하였다. 모든 정제 과정마다 혈전용해능과 단백질 농도를 측정하였다.
- 부들 화분(蒲黃)의 혈전 용해능을 검토하기 위하여 부들 화분을 물 추출하여 혈전 분해능이 있음을 확인하였다. 부들 화분의 혈전용해효소를 DEAE-cellulose, Sephadex G-150을 이용한 gel filteration, HPLC로 정제하여acrylamide gel electrophoresi로 정제를 하였다.
- 부들 화분(蒲黃)의 혈전 용해능을 검토하기 위하여 부들 화분을 물 추출하여 혈전 분해능이 있음을 확인하였다. 부들 화분의 혈전용해효소를 DEAE-cellulose, Sephadex G-150을 이용한 gel filteration, HPLC로 정제하여acrylamide gel electrophoresi로 정제를 하였다. 정제효소는 HPLC와 전기영동에 의하여 순수하게 정제되었음을 확인하였고 비활성은 38U/mg로서 정제도는 86.
- 부들화분에 10배량의 물을 가하여 진탕기로 10시간 진탕하여 효소를 추출하고 원심분리(3,500rpm, 15분)하여 상징액을 조효소액으로 하였다.
- 8) 15mL에 녹인 후 thrombin(20unit/mL) 100㎕를 넣고 1% agarose용액을 15ml 첨가하여 petri-dish에 분주한 후 30분간 응고 시켰다. 여기에 조 효소액을 50㎕를 점적한 후 36.5℃, 24시간 반응하여 용해된 환의 면적을 측정하였다.
- 여러 종류의 저해제를 정제 효소액에 가하여 최종농도가 10mM가 되도록 조정한 후 1% casein용액을 가하여 37℃, 1시간 반응시킨 다음 생성된 tyrosine equivalent양을 측정하여 무 첨가구와 비교하여 %로 표시하였다.
- 1M Tris-HCl buffer, pH 10～11: NaHCO3-NaOH buffer, pH 12～13: NaOH-KCl buffer)에 효소액을 첨가하여 pH에 따른 효소활성을 측정하여 활성이 가장 높은 pH를 최적 pH로 하였다. 정제효소의 pH에 대한 안정성을 조사하기 위하여 pH 3～6 완충액과 정제 효소액과 1:1로 혼합하여 30℃에서 6시간 정치시킨 후 효소활성을 측정하여 pH안정성을 검토 하였다.
- 정제효소의 최적 pH를 검토하기 위하여 1% casein이 함유된 완충액(pH 3～6: Na2HPO4-KCl buffer, pH 7～9: 0.1M Tris-HCl buffer, pH 10～11: NaHCO3-NaOH buffer, pH 12～13: NaOH-KCl buffer)에 효소액을 첨가하여 pH에 따른 효소활성을 측정하여 활성이 가장 높은 pH를 최적 pH로 하였다. 정제효소의 pH에 대한 안정성을 조사하기 위하여 pH 3～6 완충액과 정제 효소액과 1:1로 혼합하여 30℃에서 6시간 정치시킨 후 효소활성을 측정하여 pH안정성을 검토 하였다.
대상 데이터
- Fibrinogen, plasmin, plasminogen, thrombin, bovine serum albumin, casein, α-casein, β-casein, κ-casein는 Sigma사 제품, DEAE-cellulose, Sephadex G-150은 Pharmacia사 제품을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 부들 화분은 충남대학교 실습답과 충남지역에서 2007년 애기부들을 재배, 수확하여 실험재료로 하였다.
- 용매로는 H2O와 0.1% TFA를 함유한 acetonitrile을 사용하였으며 용매의 공급은 0.5 mL/min의 유속으로 acetonitrile을 30%에서 60%로 농도로 gradient하였다.
이론/모형
- Casein을 기질로 하여 효소작용 시킨 후 Km value를 Lineweaver-Burk plot(18)상에서 작도하여 구하였다.
- SDS-PAGE는 Laemmli’s(17)의 방법에 따라 수행하였으며 acrylamide의 농도는 12%, gel은 silver staining kit로 염색하였고 표준물질은 Broad-way(15) prestained protein marker를 사용하여 효소 단백질의 순도와 분자량을 측정하였다.
- 효소의 단백질 정량은 Lowry등의 방법(16)에 의하여 측정하였으며 bovine serum albumin을 표준 단백질로 하였다.
성능/효과
- Sephadex G-150에 의하여 얻어진 활성 분획을 모아 HPLC로 확인한 결과 RT 21.6분에서 단일 peak를 얻었다.
- 각각의 pH별로 효소를 녹여 40℃에서 60분간 반응시켜 잔존하는 효소활성을 확인한 결과 pH 4～6까지는 매우 안정함을 보였으며 새우젓(14)의 혈전 용해 효소 pH안전성 범위보다 안정 영역이 좁은 것을 볼 수 있으나 잔존 활성은 90% 이상으로 높게 나타났다.
- 기질특이성은 fibrin을 가장 잘 분해하였고 fibrin, whole casein, κ-casein, α-casein, β-casein, BSA순으로 나타났다.
- 본 효소의 Km값은 효소 ml당 0.44mM로써 본 기질에 대한 친화력이 높다는 것을 알 수 있었다. 이는 청국장(12)의 혈전용해 효소 연구에서 보고된 0.
- 7과 같다. 본 효소의 최적 활성은 pH 4이였으나 pH 4～4.5에서 활성이 80～90% 수준임을 알 수 있다. 이는 새우젓(14)의 혈전 용해 효소와 할미송이버섯(13)의 혈전 용해효소 최적 pH보다는 현저히 낮았다.
- 부들 화분의 혈전 용해효소를 정제하여 요약한 결과는 Table 2와 같으며 최종적으로fibrinolytic enzyme은 회수율이 8%로서 86.4배로 정제되었으며 효소의 비활성도는 38u/㎎ protein이었다. 할미송이버섯(13)의 혈전 용해 효소 정제도 45.
- 5와 같이 단일 band를 나타내었다. 이 정제 효소의 분자량이 75kDa으로 갯지렁이(19)의 혈전 용해 효소 29kDa, 할미송이버섯(13)의혈전 용해 효소 18.2kDa, 청국장(12)의 혈전 용해 효소 29kDa, 새우젓(14)의 혈전 용해 효소 43-46kDa과 비교하였을 때 분자량이 큰 것을 확인 할 수 있었다.
- 정제효소 액에 저해제를 10mM 농도로 첨가하여 이들이 효소활성에 미치는 영향을 검토한 결과 PMSF, iodoacetic acid 및 SDS에 의하여 심하게 저해되는 것으로 보아 serine protease로 추정되었고 SDS 에 의하여 저해 받는 결과로 미루어 볼 때 S-S기가 존재할 것으로 사료된다. 이는 청국장(12)의 혈전용해 효소와 새우(14)의 혈전용해 효소에서 PMSF가 심하게 저해한다는 보고와 비슷한 경향이었다.
- 부들 화분의 혈전용해효소를 DEAE-cellulose, Sephadex G-150을 이용한 gel filteration, HPLC로 정제하여acrylamide gel electrophoresi로 정제를 하였다. 정제효소는 HPLC와 전기영동에 의하여 순수하게 정제되었음을 확인하였고 비활성은 38U/mg로서 정제도는 86.4배이었고 분자량은 75kDa이었다. 정제효소의 최적 pH는 4.
- 44 mM 이었으며 casein에 대한 친화력이 높은 것으로 나타났다. 효소활성에 미치는 금속이온의 영향은 K+, Na+, Mg2+ 등은 효소반응에 영향을 미치지 않았으나 Zn2+, Fe2+는 심하게 저해작용을 나타내었고 정제효소는 PMSF, iodoacetic acid 및 SDS에 의하여 심하게 저해되는 것으로 보아 serine protease로 추정되었다.
후속연구
- 또한, natto(10), tofuyo(11), 청국장(12)등과 같은 발효 식품과 식용 버섯(13), 새우 paste(14)와 같은 양념류가 강력한 혈전 용해능을 가지고 있는 것으로 보고된 바 있다. 이와 같이 식용 가능한 자원 중에서 혈전용해 효소는 부작용을 일으키는 의약품과는 달리 식품은 반복해서 장기간 섭취하기 때문에 유효성분이 미량이라 하더라도 항상 공급됨으로써 큰 영향을 줄 수 있어 심혈관계 관련 질환을 효과적으로 예방할 수 있는 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 사료된다.
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