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문제 정의
- 이 경우 함량과 제형이 모두 변경되었기 때문에, 식품의약품안전청 자문을 받아 국내최초로 원 개발사의 “디푸루칸 (Diflucan) 캡슐 50 mg” 3캡슐과 “푸루나졸(Plunazol) 정 150 mg” 1정의 생물학적동등성시험에 준하는 임상약리시험을 통해 약동학적 특성평가, 안전성 평가를 수행함으로써 시험약과 대조약이 동등함을 입증하고자 하였다.
제안 방법
- 2 mL에 메탄올을 가하여 혼합한 후 상층액을 취하여 LC-MS-MS로 분석하였다.(Figure 2, 3) Calibration standard 및 quality control sample(QC sample)에서 플루코나졸의 농도는 낮은 농도에서의 accuracy를 향상시키기 위하여 weight를 준 linear regression을 이용하여 구하였다.
- LC-MS-MS를 사용하여 plasma에서의 플루코나졸의 농도를 측정하기 위하여 sample volume 0.2 mL에 메탄올을 가하여 혼합한 후 상층액을 취하여 LC-MS-MS로 분석하였다.(Figure 2, 3) Calibration standard 및 quality control sample(QC sample)에서 플루코나졸의 농도는 낮은 농도에서의 accuracy를 향상시키기 위하여 weight를 준 linear regression을 이용하여 구하였다.
- 기존에 시판중인 플루코나졸 제제인 화이자의 “디푸루칸캡슐 50 mg” 3캡슐을 한 번에 복용하는 것과 환자의 복용 편의성을 증대시키기 위해 새롭게 개발된 대웅제약의 “푸루나졸 정 150 mg” 1정을 복용하는 것의 그 생체이용률에 있어 생물학적으로 동등함을 평가하기 위해 건강한 성인 남자 24명을 대상으로 2×2 라틴방격법에 따라 플루코나졸로서 150 mg을 경구 투여한 후, 168시간에 걸쳐 총 14시점에서 채혈하고 LC-MS-MS를 이용하여 혈장 중 약물의 농도를 측정하여 얻은 결론은 다음과 같다.
- 대조약으로 “디푸루칸 캡슐 50 mg” 3캡슐과 시험약으로 “푸루나졸 정 150 mg” 1정을 24명의 지원자에게 라틴방격법에 따른 교차시험법에 따라 경구투여하여 얻은 각 제품의 혈장 중 약물농도-시간 곡선으로부터 약물 속도론적 약동학 파라미터인 약물농도-시간 곡선하면적 (AUCt), 최고혈중농도(Cmax) 및 최고혈중농도 도달시간 (Tmax)과 그 외 혈중반감기 (t1/2), 평균체류시간 (mean residence time, MRT)을Win Nonlin (Pharsight, USA) 소프트웨어를 사용하여 구하였다.
- 따라서, 본 연구에서는 대웅제약에서 발매하고자 하는 플루코나졸 고용량 제제인 “푸루나졸 정 150 mg” 1정이 기존의 플루코나졸 저용량 제제인 “디푸루칸 캡슐 50 mg” 3캡슐과 그 생체이용률에 있어 통계적으로 동등하다는 것을 입증하기 위해서 “디푸루칸 캡슐 50 mg” 3캡슐과 “푸루나졸 정150 mg” 1 정에 대하여 대한약전 제 8개정 용출시험법 중제 2법 (패들법)에 따라 비교용출시험을 먼저 실시한 다음, 식품의약품안전청이 고시한 생물학적동등성시험 기준에 따라 건강한 성인 남자 (만 20~30세) 24명을 대상으로 라틴방격법에 따라 생체내이용률 시험을 한 후, 얻어진 플루코나졸의 혈장 중 약물 농도-시간 곡선 하 면적 (AUCt), 최대혈중농도 (Cmax)와 최대혈중농도시간 (Tmax)에 대하여 Tmax를 제외한 AUCt와 Cmax는 로그 변환한 후 통계검정과 분산분석 (ANOVA, analysis of variance)을 통하여 생물학적동등성을 비교 판정하였다.
- 시험 전 저녁부터 모두 동일하게 절식시키고, 투약 10시간 전부터는 물 이외에는 금식하였다. 또한 투약 당일 투약 후 2시간까지 물을 포함하여 일체 금식하며 투약 후 2시간부터 4시간까지는 물을 제외하고 금식하도록 하였고 투약 후 4시간까지 45o 이상의 자세로 앉아 있거나 서 있도록 하였다.
- 비교용출시험용 기기로는 용출시험기 (VanKel VK7010, Varian, Palo Alto, CA, USA), UV spectrometer (Cary1C, Varian, Palo Alto, CA, USA)를 사용하였으며, 혈중약물 농도 분석기기로는 LC-MS-MS 장치 (API 3000TM system, MDS Analytical Technologies, Concord, Ontario, Canada), C18 컬럼(2.1 mm×50 mm, 5 µm particle size, Capcell Pak, Shiseido, Japan), 원심분리기(MF-550, HanilCo, Korea), 볼텍스 혼합기 (Vortex-2 Genie, ScientificIndustries, New York, USA)를 이용하였다.
- 약물 투약은 2시기 2제품의 라틴방격법에 따른 교차시험법으로 투약계획을 세우고 24명의 피험자를 군당 12명씩 무작위로 A, B 2군으로 나누고 제 1기 때에는 A군에는 대조약인 “디푸루칸 캡슐 50 mg” 3캡슐을, B군에는 시험약인 “푸루나졸 정 150 mg” 1정을 투여하였고 제 2기 때에는 그 반대로 투여하였다.
- 유기용매층을 37℃ 질소기류 하에서 증발건조 시킨 후 잔사에 이동상 200 µL로 reconstitution시키고 30초간 vortexing한 다음, 이 최종시료용액 중 20 µL를 취하여 LC-MS-MS에 주입하였다. 얻은 fluconazole와 내부표준물질의 피이크 면적을 이용해 검량선을 작성하였다. 하루에 실험을 5번 시행하여 일내 재현성을 구하고 연속하여 5일간 실험을 행하여 일간 재현성을 구했다.
- 용출액은 용출시험 조건에 따라 물의 용출액을 각각 900 mL씩 사용하여 용출 개시 후 30분까지 용출액을 채취하고 0.45 µm 멤브레인 필터로 여과한 후 자외선 분광광도계를 사용하여 용출률을 산출하였다.
- 플루코나졸 표준품을 메탄올에 녹여 농도를 1000 ng/mL로 만든 후 냉장 보관시키고, 이 용액을 메탄올로 희석하여 검량선 농도의 10배의 농도인 5, 10, 50, 100, 200, 500, 1000(ng/mL) 농도가 되도록 표준용액시료를 만들었다. 이 표준용액 20 L을 각각 공혈액 180 L에 가하여 최종농도가 0.5, 1, 5, 10, 20, 50, 100 (ng/mL)인 표준혈장시료를 조제하였다. 각각의 표준혈장시료 0.
- 대조약 3캡슐씩 그리고 시험약 1정씩을 240 mL의 물과 함께 복용시켰다. 최고혈장농도 도달 이전에 2회 이상 채혈하고, 도달후 반감기의 4배 정도 시간까지 채혈하기 위해, 채혈시점을 0 (투약 전), 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 168시간의 총 14회로 설정하였다. Heparin이 포함된 채혈용기 (BD Vacutainer tube, USA)에 전혈을 약 6 mL 채취한 후 취하여 Vacutainer (Boin medica, Korea)로 옮기고, 1800 rpm에서 8분간 원심분리한 후 혈장을 취해 eppendorf tube에 옮겨 담고 -70℃로 옮겨 농도 측정 시까지 보관하였다.
- 플루코나졸에 대한 검량선은 다음과 같이 작성하였다. 플루코나졸 표준품을 메탄올에 녹여 농도를 1000 ng/mL로 만든 후 냉장 보관시키고, 이 용액을 메탄올로 희석하여 검량선 농도의 10배의 농도인 5, 10, 50, 100, 200, 500, 1000(ng/mL) 농도가 되도록 표준용액시료를 만들었다. 이 표준용액 20 L을 각각 공혈액 180 L에 가하여 최종농도가 0.
- 1 mm×50 mm, 5 µm particle size)을 사용하였으며 이동상으로는 aceton itril과 10 mM formic acid의 혼합액 (90:10, v/v)을, 유속은 230 µL/min, 주입량은 5 µL로 LC-MS-MS에 주입하였다. 플루코나졸의 검출은 API 3000 (MDS Analytical Technologies)을 이용하여 검출하고 fluconazole m/z (307.2/238.1), metronidazole m/z (103.1/85.0)를 모니터링 하였다.
- 얻은 fluconazole와 내부표준물질의 피이크 면적을 이용해 검량선을 작성하였다. 하루에 실험을 5번 시행하여 일내 재현성을 구하고 연속하여 5일간 실험을 행하여 일간 재현성을 구했다.
- 한편, 플루코나졸의 건강한 성인을 대상으로 한 최종상의 반감기는 약 30~37시간으로 보고되어 있어 생물학적동등성시험 기준 제 18조 제 4항 휴약기간의 산정기준에 따라 2주일의 휴약기간을 두었다.
- 한편, 혈장시료의 분석은 먼저 피험자로부터 각 시간별로 채혈하여 70℃에 보관했던 혈장 시료를 실온에 방치하여 녹인 후 30 초간 진탕한 다음 이 혈장 200 µL를 취하여 시험관에 옮기고 검량선 작성 방법과 동일한 방법으로 전처리 한후 LC-MS-MS에 주입하여 얻어진 크로마토그램으로부터 내부표준물질의 피크 면적에 대한 플루코나졸의 피크면적비를 구하여 미리 작성된 검량선에 의해 혈장 중의 플루코나졸의 농도를 산출하였다.
- 혈장 중 플루코나졸의 농도를 측정하기 위하여 이미 보고된 분석법9-10)을 참조하여 생체시료의 검체처리 및 분석을 실시하였다.
대상 데이터
- 대조약 “디푸루칸 캡슐 50 mg” 3캡슐과 시험약 “푸루나졸 정 150 mg” 1정을 각각 피험자 23명에게 경구 투여한후 일정 시간마다 채혈하여 얻은 혈장 중 플루코나졸 평균농도를 Figure 4에 나타내었으며, 혈장 중 약물농도-시간 곡선으로부터 산출한 약물 속도론적 파라미터 (AUCt, Cmax)를 Table 2에 나타내었다. 24명의 피험자 중 1명이 개인적인 사정으로 인해 중도 탈락하여 총 23명에 대하여 나타내었다.
- 35인의 지원자가 이 시험에 대한 설명회에 참석하였고 설명문을 통해 설명하였으며, 본시험의 목적 및 위험 등을 알고 동의서를 작성한 자원자만 시험에 참여하였다.
- 86 kg 이었다. 그 중 1인이 부작용 이외의 개인적인 사유로 첫 번째 투약기 5d 0h 째 채혈부터 참여를 철회하는 관계로 중도 탈락하여 최종 23인으로 임상시험을 완료하였다.
- 35인의 지원자가 이 시험에 대한 설명회에 참석하였고 설명문을 통해 설명하였으며, 본시험의 목적 및 위험 등을 알고 동의서를 작성한 자원자만 시험에 참여하였다. 스크리닝을 위해 서울아산병원에서 전문의사의 건강진단을 실시하여 건강인으로 판정된 24명을 선정하였다. 전체 피험자의 평균 연령은 24.
- 시험에 사용된 시험약은 의약품임상시험관리기준8) 제 36조 및 제 37조의 규정에 따라 제조한 대웅제약의 “푸루나졸정 150 mg”(제조번호: PLNT100B), 대조약은 식품의약품안전청으로부터 허가를 받아 화이자의 “디푸루칸 캡슐 50mg” (제조번호: 391005201)이다.
- 제 36조 및 제 37조의 규정에 따라 제조한 대웅제약의 “푸루나졸정 150 mg”(제조번호: PLNT100B), 대조약은 식품의약품안전청으로부터 허가를 받아 화이자의 “디푸루칸 캡슐 50mg” (제조번호: 391005201)이다. 플루코나졸 표준품은 대웅제약으로부터 제공받았으며, 내부표준물질로 사용한 메트로니다졸 (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA), HPLC용 메탄올과 아세토니트릴은 Fisher Scientific Co. (Springfeild, NJ, USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 기타 그 외의 시약들은 특급 및 1등급 시약들을 사용하였다.
- 피험자는 식품의약품안전청이 고시한 생물학적동등성시험기준7)에 근거하여 만 19~55세의 건강한 성인 남성 지원자를 공고를 통하여 모집하였다. 35인의 지원자가 이 시험에 대한 설명회에 참석하였고 설명문을 통해 설명하였으며, 본시험의 목적 및 위험 등을 알고 동의서를 작성한 자원자만 시험에 참여하였다.
데이터처리
- 그 외 약물 속도론적 파라미터들을 살펴보면 혈중반감기(t1/2, hr)는 각각 33.72±5.88과 34.26±6.65로 평균 1.60%의 차이를 보였고 평균체류시간 (mean residence time, MRT)은 43.39±3.97과 43.86±3.48로 평균 1.08%의 차이로 매우 유사한 것을 확인하여 이하 분산분석을 행하였다.
- 이들 두 제품에서 각각 얻은 값에 대해 Tmax를 제외한 AUCt와 Cmax의 로그 변환치를 생물학적동등성시험 통계처리용 프로그램인 K-BE Test 2002를 이용하여 유의수준 α=0.05에서 분산분석을 실시하여 순서효과 (sequence effect)를 검증한 후, 각 변동요인간의 유의성 여부를 검토하였고 90% 신뢰구간을 구함으로써 대조약인 “디푸루칸 캡슐 50 mg” 3캡슐과 시험약인 “푸루나졸 정 150 mg” 1정의 생물학적동등성 여부를 판정하였다.
이론/모형
- 최고혈중농도 (Cmax)와 최고혈중농도 도달시간 (Tmax)은 내삽법 (interpolation)을 사용하지 않고 관측된 값을 사용하였다. AUCt를 구하는 데는 사다리꼴 공식을 사용하였다. 이들 두 제품에서 각각 얻은 값에 대해 Tmax를 제외한 AUCt와 Cmax의 로그 변환치를 생물학적동등성시험 통계처리용 프로그램인 K-BE Test 2002를 이용하여 유의수준 α=0.
- 대조약 “디푸루칸 캡슐 50 mg” 각 3캡슐과 시험약 “푸루나졸 정 150 mg” 각 1정씩을 취하여 대한약전 제 8개정 용출시험법 중 제 2법(패들법)에 따라 50 rpm으로 시험하였다.
- 대조약으로 “디푸루칸 캡슐 50 mg” 3캡슐과 시험약으로 “푸루나졸 정 150 mg” 1정을 24명의 지원자에게 라틴방격법에 따른 교차시험법에 따라 경구투여하여 얻은 각 제품의 혈장 중 약물농도-시간 곡선으로부터 약물 속도론적 약동학 파라미터인 약물농도-시간 곡선하면적 (AUCt), 최고혈중농도(Cmax) 및 최고혈중농도 도달시간 (Tmax)과 그 외 혈중반감기 (t1/2), 평균체류시간 (mean residence time, MRT)을Win Nonlin (Pharsight, USA) 소프트웨어를 사용하여 구하였다. 최고혈중농도 (Cmax)와 최고혈중농도 도달시간 (Tmax)은 내삽법 (interpolation)을 사용하지 않고 관측된 값을 사용하였다. AUCt를 구하는 데는 사다리꼴 공식을 사용하였다.
성능/효과
- )는 모두 15% 이내로 나타났고 40, 400 및 4000 ng/mL의 농도에서 5회 반복 측정하여 얻은 농도의 범위는 80~120% 이내였고 표준편차(%, deviation)도 모두 15% 아래로 나타났다. (Table 1) 이로부터 혈장 중 플루코나졸에 대한 상기 분석방법은 인체에 대한 생체이용률 시험에 이용될 수 있는 적합한 정밀성 및 정확성을 갖고 있음을 알 수 있었다.
- 1. LC-MS-MS를 이용하여 혈장 중 플루코나졸의 농도를 빠른 시간 내에 정량한계농도 (20 ng/mL)까지 측정함으로써 생체이용률의 시험에 이용할 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성 및 정밀성을 갖는 분석조건을 확립할 수 있었다.
- 2. 두 제제의 분산분석 결과 로그 변환한 AUCt, Cmax에 대한 결과를 보면 유의수준 (α)=0.05에서 군간 순서 효과는 나타나지 않았으며, 90% 신뢰한계가 모두 log 0.8~log 1.25이어야 하는 생물학적동등성 시험기준을 만족하였다.
- AUCt, Cmax에 대한 결과를 보면 유의수준 (α)=0.05일 때, 군간 순서 효과 검정에 대한 F비 (FG)가 F분석표의 한계 값인 F0.05(1,21)=4.32보다 작아 교차시험이 제대로 이루어졌음을 확인할 수 있었으며, 개체 내 변동에서 기간별(period effect) 변동 및 제제별 (formulation effect) 변동 모두 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- 대조약인 “디푸루칸 캡슐 50 mg” 3캡슐 복용 시 평균AUCt (µg·hr/mL)는 159.59±38.36, 시험약인 “푸루나졸 정 150 mg” 1정 복용 시 153.64±33.78으로 대조약에 대한 평균치 차가 -3.72%이었고, Cmax (µg/mL)는 3.84±0.75과 3.44±0.71로 -10.4%의 차이를 보였으며 Tmax (hr)는 1.22±1.08과 1.59±1.28로 30.2%의 차이를 나타내, 대조약에 대한 시험약의 평균치 차이는 대조약의 ±20%이내이어야 한다는 생물학적동등성 평가를 위한 전제 조건을 만족하였다.
- 25 이내이어야 한다는 생물학적동등성시험 기준을 충족시켰다. 또한, 참고평가변수인 AUClast, t1/2, MRT를 통계처리 하였을 때의 90% 신뢰구간 역시 모두 log 0.8 에서 log 1.25 이내임을 확인할 수 있었다.
- 약효측면에서 약물 방출속도의 동등성 확인을 위해 대한약전에 수재된 패들법에 따라 비교용출시험을 수행한 결과, “푸루나졸 정 150 mg”은 대조약인 “디푸루칸캡슐 50 mg”과 의약품 기준 및 시험방법의 용출조건에서 동등하였고 해당 비교용출시험의 모든 용출액 조건에서 모두 동등한 결과를 나타내었다 (Figure 1).
- 이러한 실험결과와 50~400 mg까지 혈중농도와 혈중농도곡선하면적 (AUCt)이 약물 복용량에 비례한다는 근거논문들3,6,11)을 참고할 때 생체 내에서도 “푸루나졸 정 150 mg” 1정과 “디푸루칸 캡슐 50 mg” 3캡슐이 동등한 약동력학적 특성 및 효과를 나타낼 것으로 기대되었다.
- 이상의 결과를 종합해보면 시험약인 “푸루나졸 정150 mg” 1정을 복용하는 것은 대조약인 “디푸루칸 캡슐50 mg” 3캡슐을 한 번에 복용하는 것과 생물학적으로 동등하다고 사료되었다.
- 이상의 시험결과를 종합해 보면 시험약인 “푸루나졸 정150 mg” 1정은 대조약인 “디푸루칸 캡슐 50 mg” 3캡슐에 대하여 생물학적동등성시험의 판단기준인 AUC와 Cmax가 모두 동등조건을 만족함으로써 생물학적으로 동등함을 알 수 있었다.
- 전체 피험자의 평균 연령은 24.78±3.27 (평균±표준편차)세 이었으며, 신장은 175.56±5.45 cm, 체중은 67.24±6.86 kg 이었다.
- 혈장시료로부터 구한 플루코나졸의 검량선의 계산식은 y=0.99728x-0.03333 (r2=0.9973)[y=플루코나졸/내부표준물질 피크면적의 비율, x=플루코나졸의 농도 (µg/mL)] 이었으며, 20~6000 ng/mL의 범위에서 양호한 선형성을 나타내었다.
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