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문제 정의
- 본 연구는 GSE와 법제유황수(Processed sulfur solution,PSS)의 구강질환 예방 및 치료제로서의 가능성을 평가하기 위해 구강질환 원인균 4종에 대한 항균효과를 확인하고, GSE 와 PSS를 함유한 치약 시제품을 제조하여 시제품의 항균효과와 물리·화학적 특성을 확인하였다.
- 신고 . 심사 규정에서 성상, 확인, 함량, 질량(용량)편차시험 및 pH 등을 시험항목으로 정하고 있는데[24], 본 연구에서는 GSE와 PSS7} 함유된 치약의 상업적 활용 가능성을 타진하기 위해, pH뿐만 아니라 굴절율, 점도, 색도 등의 물리적 특성도 확인하였다. GSE와 PSS가 각각 0.
제안 방법
- gingi- valis 균주는 37℃로 유지된 혐기성 배양기인 Bactron Ⅳ.Chamber(SHELLAB, USA)에서 배양하였으며, 이때 혐기조건은 5% CO2, 10% H2, 및 85% N2로 유지하였다.
- , Japan)를 평판배지의 표면에 밀착시켰다. GSE와 PSS< 각각 10, 20 및 40 μ1씩 점적하고 37℃로 유지된 혐기성 배양기(5% CO2, 10% Hz, 및 85% N2) 및 호기성 배양기에서 48시간 배양하면서 생성된 투명환의 크기(mm)로 항균 활성을 측정하였다.
- 심사 규정에서 성상, 확인, 함량, 질량(용량)편차시험 및 pH 등을 시험항목으로 정하고 있는데[24], 본 연구에서는 GSE와 PSS7} 함유된 치약의 상업적 활용 가능성을 타진하기 위해, pH뿐만 아니라 굴절율, 점도, 색도 등의 물리적 특성도 확인하였다. GSE와 PSS가 각각 0.1, 0.25 그리고 0.5%씩 함유된 치약 시제품을 제조하여 항균물질을 포함하지 않은 치약을 대조군으로 하여 각각의 특성을 비교하였다(Table 4). 그 결과, 대조군 치약의 pH는 5.
- 시제품의 물리·화학적 특성을 확인하기 위해 pH, 점도 및 굴절률(Refractive Index) 및 색도를 측정하였다. GSE와 PSS가 농도별로 함유된 치약시제품의 pH는 25℃에서 보관한 농도별 치약 시제품을 증류수로 10배 희석하여 원심분리 한상둥액을 pH meter (SevenEasy pH S-20K, Mettler-Toledo GmbH, S* witzerland) 사용하여 측정하였다. 점도는 Brookfidd (DV-D+Pro, USA)사의 점도계를 사용하여 25℃에서 스핀들(spindle) No.
- gjn&valis Aichigakuin University Graduate School of dentistry (Nagoya, Japan)0)]서 치주질환 환자에서 분리하여 수득한 것을 분양받아 사용하였다. S nvtans 균주는 5% serum (GIBCO BRL, USA) 이 포함된 brain heart infusion (OXOID, England) agar 배지로 배 양하였고, P. intemedia와 P. gin&valis 균주는 10% sheep blood 와 0.1% 의 hemin (Sigma, USA) 과 vitamin Ki (Sigma, USA) 이 포함된 tryptic soy agar (Difco, USA) 배지로 배양하였으며, C albicanse: 5% serum을 포함한 Sabourand 배지로 배양하였다. 배 양조건으로 S.
- S. mutans 균주는 BHI broth 배지를 사용하여 NCCLS Guide Line M7-A6 [%]에 준하여 MIC값을 측정하였고, P. interimdia와 P. gingivalis 균주는 GAM broth (Nissui, Japan)배 지를 사용하여 NCCLS Guide Line M11-A6 [3기에 준하여 MIC 값을 측정하였으며, C albicans균주는 Sabourand broth 배지를 사용하여 NCCLS Guide Line M27-A2 [34]에 준하여 MIC 값을 측정하였다. 최소억제농도를 측정하기 위하여 대상균액은 각각의 균주에 적합한 액체배지에서 24시간 동안 전배양하면서 활성화시 켜, Mcfarland 0.
- gjngjvali&는 NCCLS Guide Line M11-A6 [37]에 준하여 실험하였다. 각 공시 균들을 평판배지에 도말 접종한 다음, 직경 8 mm의 멸균된 paper disk (ADVANTEC, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Japan)를 평판배지의 표면에 밀착시켰다. GSE와 PSS< 각각 10, 20 및 40 μ1씩 점적하고 37℃로 유지된 혐기성 배양기(5% CO2, 10% Hz, 및 85% N2) 및 호기성 배양기에서 48시간 배양하면서 생성된 투명환의 크기(mm)로 항균 활성을 측정하였다.
- 이때, 희석액으로는 멸균 증류수를 사용하였다. 각 공시 균들을 평판배지에 도말 접종한 다음, 직경 8 mm의 멸균된 paper disk(ADVANTEC, Japan)에 농도별로 제조된 치약시제품 원액, 멸균수로 2배 및 4배로 희석한 치약용액을 40 μ1씩 점적하여 평판배지의 표면에 밀착 시킨 후, 각 균주의 특성에 맞게 37℃로 유지된 혐기성 배양기 및 호기성 배양기에서 48시간 배양하면서 생성된 투명환의 크기(mm)로 항균 활성을 측정하였다.
- 각각 0.1, 0.25 그리고 0.5%의 GSE와 PSS가 함유된 치약시제품의 항균활성을 평판배지 확산법을 이용하여 측정하였다. 치약은 구강에서 사용 시 타액에 의해 희석되는 점을 감안하여 시제품 원액, 2배 및 4배 희석액을 사용하여 항균 활성을 측정하였다.
- 구강질환 원인균에 대한 자몽종자추출물(GSE)과 법제 유황 수(PSS)의 항균활성을 확인하기 위해, 평판배지확산법 및 액체 감수성 실험 법으로 Streptococcus mutans, Prevotdla media, Porphyramonas gingivalis 및 Candda albicane 대한 항균활성을 측정하였다. 평판배지확산법의 경우, GSE의 농도가 40 μ1/disk 일 때, S.
- S94 (T-bar;D)로 4 rpm에서 1분간 측정하였다. 굴절률은 굴절계 (ABBE Refractometer DR-A1, ATAGO CO., LTD. Japan)를 사용하여 25℃에서 측정하였다. 치 약의 색도는 치 약표면에 색차계 (Milnolta CR-200, Japan)를사용하여 명도(lightness, Z), 적색도(redness, a) 황색도 (yellowness, 0를 3회 반복 측정하여 평균값으로 나타내었다.
- mutans에 대한 항균효과를 확인한 것으로 나타났다. 본 연구에서는 자몽종자추출물(GSE)만을 사용하여 충치, 치은염, 치주염 및 아구창의 원인균에 대한 항균효과를 확인하였을 뿐만 아니라 또 다른 천연항균제인 법제 유황수(PSS)를 사용하여 치주염 원인균을 제외한 주요 구강질환 원인균에 대한 항균활성도 확인하였다. 또한 이들 두 종류의 천연항균물질을 사용하여 제조한 치약시제품의 항균효과도 확인할 수 있었다.
- 25% 그리고 05%가 되도록 혼합하여 제조하였다. 시제품의 물리·화학적 특성을 확인하기 위해 pH, 점도 및 굴절률(Refractive Index) 및 색도를 측정하였다. GSE와 PSS가 농도별로 함유된 치약시제품의 pH는 25℃에서 보관한 농도별 치약 시제품을 증류수로 10배 희석하여 원심분리 한상둥액을 pH meter (SevenEasy pH S-20K, Mettler-Toledo GmbH, S* witzerland) 사용하여 측정하였다.
- gingivalis 균주는 GAM broth (Nissui, Japan)배 지를 사용하여 NCCLS Guide Line M11-A6 [3기에 준하여 MIC 값을 측정하였으며, C albicans균주는 Sabourand broth 배지를 사용하여 NCCLS Guide Line M27-A2 [34]에 준하여 MIC 값을 측정하였다. 최소억제농도를 측정하기 위하여 대상균액은 각각의 균주에 적합한 액체배지에서 24시간 동안 전배양하면서 활성화시 켜, Mcfarland 0.5로 탁도를 조절한 후에 최종농도가 lxioWells/ml이 되도록 하여 GSE와 PSS의 농도를 2배 연속 희석 (twcnfold serial dilution)하면서 MIC 값을 측정하였다.
- Japan)를 사용하여 25℃에서 측정하였다. 치 약의 색도는 치 약표면에 색차계 (Milnolta CR-200, Japan)를사용하여 명도(lightness, Z), 적색도(redness, a) 황색도 (yellowness, 0를 3회 반복 측정하여 평균값으로 나타내었다. 이때 표준 백판의 Z값 98.
- 치약베 이스는 바이오생 명 공학연구소(Hanam, Gyeonggi-do, Korea) 에서 제공받았으며, Silicon dioxide, Aminocaproic acid, Alumium chlorhydroxy allantointe, Glycerin, Polyethylene glycol 1500, Sorbitol, CMC, Chitosan, Xylitol, Sodium saccharin, Methyl parahydroxy benzoate 및 물을 함량별로 각각 칭량하여 순차적으로 모두 투입한 후, 진공 상태를 유지하여 45~50℃에서 25~30분간 가열하면서 교반 하여 제조하였다(Table 3). 치약 시제품은 치약 베이스에 GSE와 PSS를 각각 0.1%, 0.25% 그리고 05%가 되도록 혼합하여 제조하였다. 시제품의 물리·화학적 특성을 확인하기 위해 pH, 점도 및 굴절률(Refractive Index) 및 색도를 측정하였다.
- 치약 시제품의 항균활성을 확인하기 위해, 각각 0.1, 0.25, 0.5%의 GSE와 PSS를 첨가한 치약 시제품 원액 및 이를 멸균증류수로 2배와 4배로 희석한 치약시제품 용액의 항균 활성을 평판배지 확산법을 이용하여 측정하였다 (Fig. 1). S.
- 5%의 GSE와 PSS가 함유된 치약시제품의 항균활성을 평판배지 확산법을 이용하여 측정하였다. 치약은 구강에서 사용 시 타액에 의해 희석되는 점을 감안하여 시제품 원액, 2배 및 4배 희석액을 사용하여 항균 활성을 측정하였다. 이때, 희석액으로는 멸균 증류수를 사용하였다.
- 항균물질으로서 GSE와 PSS의 가능성을 확인하기 위하여, 치약 시제품을 제조하여 물리화학적 특성을 확인하였다. 치약베 이스는 바이오생 명 공학연구소(Hanam, Gyeonggi-do, Korea) 에서 제공받았으며, Silicon dioxide, Aminocaproic acid, Alumium chlorhydroxy allantointe, Glycerin, Polyethylene glycol 1500, Sorbitol, CMC, Chitosan, Xylitol, Sodium saccharin, Methyl parahydroxy benzoate 및 물을 함량별로 각각 칭량하여 순차적으로 모두 투입한 후, 진공 상태를 유지하여 45~50℃에서 25~30분간 가열하면서 교반 하여 제조하였다(Table 3).
대상 데이터
- GSE와 PSS의 구강질환 원인균에 대한 항균효과를 측정하기 위하여 Streptococcus mutans 3065 KCTC, Prevoteila inta- media 25611 KCTC, Paphynauonas gingivalis 381 및 Candida albicans T74S5 KCTC 균주는 생물자원센터 (Daejeon, Korea) 로부터 분양받아 사용하였으며, P. gjn&valis Aichigakuin University Graduate School of dentistry (Nagoya, Japan)0)]서 치주질환 환자에서 분리하여 수득한 것을 분양받아 사용하였다. S nvtans 균주는 5% serum (GIBCO BRL, USA) 이 포함된 brain heart infusion (OXOID, England) agar 배지로 배 양하였고, P.
- , Inc, USA)로서 자몽종자추출액 70%와 glycerine 30%로 구성되어 있다. PSS는 신미산업(Busan, Korea)에서 생산한 제품을 사용하였으며, 제조방법은 다음과 같다. 먼저 유황 20 g과 수산화칼슘 25 g을 증류수 140 ml에 함께 혼합하고, 100℃로 가열하여 용해시킨 후, 촉매로서 황산나트륨 5 g과 염화칼슘 2 g을 첨가하여 130℃로 2시간 가열하여 반응시켰다.
- 실험 재료로 사용된 GSE는 현재 시판되고 있는 천연항균제(DF-100, Chemie Research & Manufacturing Co., Inc, USA)로서 자몽종자추출액 70%와 glycerine 30%로 구성되어 있다. PSS는 신미산업(Busan, Korea)에서 생산한 제품을 사용하였으며, 제조방법은 다음과 같다.
- 시제품을 제조하여 물리화학적 특성을 확인하였다. 치약베 이스는 바이오생 명 공학연구소(Hanam, Gyeonggi-do, Korea) 에서 제공받았으며, Silicon dioxide, Aminocaproic acid, Alumium chlorhydroxy allantointe, Glycerin, Polyethylene glycol 1500, Sorbitol, CMC, Chitosan, Xylitol, Sodium saccharin, Methyl parahydroxy benzoate 및 물을 함량별로 각각 칭량하여 순차적으로 모두 투입한 후, 진공 상태를 유지하여 45~50℃에서 25~30분간 가열하면서 교반 하여 제조하였다(Table 3). 치약 시제품은 치약 베이스에 GSE와 PSS를 각각 0.
이론/모형
- GSE와 P%의 최소억제농도(Minimal Inhibitory Concentration, MIC)를 측정하기 위하여 액체배지감수성실험법 (Broth Microdilution Susceptibility Tests)을 이용하였다. S.
- 구강질환 원 인균에 대한 GSE와 PSS의 항균활성은 평판배지 확산법을 이용하여 측정하였다. 호기성 조건에서 배양한 S.
- 이용하여 측정하였다. 호기성 조건에서 배양한 S.mutant C albicanse: NCCLS Guide Line M2-A8 [35] 에 준하여 실험하였고, 혐 기성 균주인 P. intermedia P. gjngjvali&는 NCCLS Guide Line M11-A6 [37]에 준하여 실험하였다. 각 공시 균들을 평판배지에 도말 접종한 다음, 직경 8 mm의 멸균된 paper disk (ADVANTEC, Toyo Roshi Kaisha, Ltd.
성능/효과
- mrfans에서가장 높은 항균활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. GSE 는 혐기성 조건에서 배양한 P. intermedia와 P. gingivalis에서 항균활성 이 더 높게 나타났으며, PSS는 호기성 조건에서 배양한 S. mutant C alticane\ 활성이 더 높게 나타났다. 그러므로, GSE와 PSS를 각각 단독으로 사용하는 것보다 복합적으로 사용하는 것이 다양한 구강질환 원인균에 대해 더 효과적인 예방 및 치료 효과를 나타낼 것으로 사료된다.
- PSS의 항균활성을 Table 1에 나타내었다. GSE는 모든 균주에 대해서 항균활성을 나타냈으며, 농도가 증가함에 따라 활성이 증가하는 것을 알 수 있었다. 특히, 충치 원인균인 S.
- ffnffvaliSe 대하여 항균활성을 나타내지 않는 것을 알 수 있었다. GSE와 PSS의 MIC값 측정 결과 각각 P. intamedia 와 S. mrfans에서가장 높은 항균활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. GSE 는 혐기성 조건에서 배양한 P.
- 81 μ 1/ml로 나타났다. P. gingivalis에 대한 PSS의 MIC를 측정한 바 125 μ 1/ml의 농도에서는 항균활성을 나타내지 않았는데, 이는 평판 배지 확산법을 이용한 항균활성의 결과와도 일치하며, PSS는 P. ffnffvaliSe 대하여 항균활성을 나타내지 않는 것을 알 수 있었다. GSE와 PSS의 MIC값 측정 결과 각각 P.
- 0 mm의 항균 활성을 나타내었다. S. m* utant P. interimedia 경우 2배 희석한 치약에서 가장 높은 항균활성을 나타내었고, P. gjngivaB는치약 시제품 원액과 2배 희석한 치약에서 비슷한 수준의 항균 활성을 나타내었다. 반면에, C alticane 치약 시제품을 희석할수록 항균활성이 낮아지는 것을 확인할 수 있었다.
- 63 μ 1/ml 로 나타났다. S. mutans, P. intermeda 및 C albicans에 대한 PSS의 MIC 값은 각각 0.12, 3.91, 7.81 μ 1/ml로 나타났다. P.
- interimediaP. gingivalis 및 C alticane 대한 0.5% 치약 시 제품 원액의 항균활성을 확인한 결과, 각각 2.3, 1.2, 2.2 그리고 1.7 mm로 나타났고, 2배 희석한 0.5% 치약 시제품에서는 각각 7.3, 4.3, 2.2 그리고 1.5 mm로 나타났으며, 4배 희석한 0.5% 치약 시제품에서는 각각 4.8, 3.3, 15 그리고 1.0 mm의 항균 활성을 나타내었다. S.
- 5%씩 함유된 치약 시제품을 제조하여 항균물질을 포함하지 않은 치약을 대조군으로 하여 각각의 특성을 비교하였다(Table 4). 그 결과, 대조군 치약의 pH는 5.97이 었으며, GSE와 PSS의 농도가 높아질수록 pH가 증가하여 0.5% 함유 치약의 경우 6.00으로 나타났으나, 그 차이가 미미한 것으로 보아 GSE와 PSS가 치약의 pH에는 크게 영향을 주지 않는 것을 알 수 있었다. 굴절률의 경우에도 대조군이 14.
- 점도를 측정한 결과, 410, 000에서 370, 000 cps로 GSE와 PSS를 첨가하지 않은 대조군의 420, 000 cps보다 낮아 농도가 증가할수록 점도가 다소 감소하는 경향을 보였으나 치약을 1 cm 짜내었을때 떨어지지 않고 20초간 유지하는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 치약 시제품의 Hunter 색도 변화를 측정한 결과, 농도가 증가할수록 명도를 나타내는 값은 점점 감소하는 경향을 보여 대조구에서는 94.71, 0.5%에서는 85.85로 나타났다. 적색 도를 나타내는 a값은 농도가 증가할수록 색도가 증가하는 경향을 보였으며, 대조구에서는 0.
- 본 연구에서는 자몽종자추출물(GSE)만을 사용하여 충치, 치은염, 치주염 및 아구창의 원인균에 대한 항균효과를 확인하였을 뿐만 아니라 또 다른 천연항균제인 법제 유황수(PSS)를 사용하여 치주염 원인균을 제외한 주요 구강질환 원인균에 대한 항균활성도 확인하였다. 또한 이들 두 종류의 천연항균물질을 사용하여 제조한 치약시제품의 항균효과도 확인할 수 있었다. 이상의 결과들을 종합해 볼 때, 구강질환 예방 및 치료제로서 GSE와 PSS의 가능성을 확인할 수 있었으며, 치약 시제품에 혼합했을 때 물리 화학적으로 비교적 안정한 것으로 확인되어 치약 이외의 구강 위생관련제품에도 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- gjngivaB는치약 시제품 원액과 2배 희석한 치약에서 비슷한 수준의 항균 활성을 나타내었다. 반면에, C alticane 치약 시제품을 희석할수록 항균활성이 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. GSE와 PSS를 첨가하지 않은 대조구 치약 원액과 2배 및 4배 희석한 치약 용액에서는 항균활성을 보이지 않았다.
- ffnffvalie\ 경우에는 모든 농도에서 투명환이 형성되지 않았다. 이상의 결과에서 평판배지 확산법으로 측정했을 때는 전반적으로 GSE가 PSS에 비해 구강질환 원인균에 대해 더 높은 항균 활성을 보이는 것으로 나타났다.
- 85로 나타났다. 적색 도를 나타내는 a값은 농도가 증가할수록 색도가 증가하는 경향을 보였으며, 대조구에서는 0.42이고, 0.5%에서는 0.63로 측정되었다. 황색도를 나타내는 b값 역시 0.
- 4355 및 14389로 나타나 점점 증가하는 것을 알 수 있었다. 점도를 측정한 결과, 410, 000에서 370, 000 cps로 GSE와 PSS를 첨가하지 않은 대조군의 420, 000 cps보다 낮아 농도가 증가할수록 점도가 다소 감소하는 경향을 보였으나 치약을 1 cm 짜내었을때 떨어지지 않고 20초간 유지하는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 치약 시제품의 Hunter 색도 변화를 측정한 결과, 농도가 증가할수록 명도를 나타내는 값은 점점 감소하는 경향을 보여 대조구에서는 94.
- 81 μ 1/ml이 었다. 치 약 시 제품의 항균효과를 확인하기 위해, GSE와 PSS가 농도별로 함유된 치약시제품 원액과 2배 및 4배 희석액을 제조하여 평판배지 확산법을 수행한 결과, 0.5% 치약 시제품의 2배 희석액에서 각각 7.3, 4.3, 2.2 그리고 1.5 mm로 나타났다. 치약 시제품의 물리 .
- 치약 시제품의 물리 .화학적 특성을 확인한 결과, pH, 점도, 굴절 및 색도 변화에 있어서 모두 안정성을 보였고, 이상의 결과를 바탕으로 기능성 치약과 같은 구강질환 예방 및 치료제 개발 가능성을 확인하였다.
후속연구
- mutant C alticane\ 활성이 더 높게 나타났다. 그러므로, GSE와 PSS를 각각 단독으로 사용하는 것보다 복합적으로 사용하는 것이 다양한 구강질환 원인균에 대해 더 효과적인 예방 및 치료 효과를 나타낼 것으로 사료된다. GSE와 PSS에대하여 평판배지확산법에 의한 항균결과와 MIC 측정에 따른 결과가 다른 경향을 보이는 것으로 나타났는데 이는 고체 배지와 액체배지 상에서 GSE와 PSS의 용해도와 확산속도가 다르기 때문으로 추정된다.
- 또한 이들 두 종류의 천연항균물질을 사용하여 제조한 치약시제품의 항균효과도 확인할 수 있었다. 이상의 결과들을 종합해 볼 때, 구강질환 예방 및 치료제로서 GSE와 PSS의 가능성을 확인할 수 있었으며, 치약 시제품에 혼합했을 때 물리 화학적으로 비교적 안정한 것으로 확인되어 치약 이외의 구강 위생관련제품에도 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
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