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문제 정의
- 본 연구에서는 HCCR promoter의 특성을 분석하였다. 이과정 에서 -390에서 -366 사이 에 TGIF 전사인자 결합하여 전사활성을 조절함을 관찰하였다.
- 본 연구에서는 HCCR의 발현기전을 이해하기 위하여 pro moter 영역을 분리하여 특성을 분석하였다.
- 1). 여기서는, 반대로 TGIF 자리에핵단백질 결합의 방해가 promoter 활성을 회복 시킬 수 있는지 그 연관성을 확인하였다. 이를 위해, pGL3-406〜+30 내에포함된 TGIF에 대한 consensus sequence자리를 치환한(TGA 를 GTC로 치환함) mutant돌연변이(pGL3-mTGIF)를 제작하였다(Fig.
- 그러나, 아직 정확한 발암 유도기 전이 알려져 있지 않다. 이러한 의문을 해소하기 위한 일환으로 본 연구에서는 HCCR의 발현이 어떻게 조절되는지를 조사하였다. 이를 위해 먼저 HCCR 5' 쪽의 promoter 영 역을 분리하여 Luciferase assay법을 이용하여 K562, HEK293, A549 세포에서 분석하였고, Promoter의 -370에서 -406사이 36bp의 첨가로 promoter활성이 의미 있게 억제됨을 관찰하였다.
제안 방법
- CA, USA) 와 함께 co-transfection하였다. 30 hr 이지난 후에 Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 각 promoter의 활성을 측정하였다.
- K562, HEK293, A549 세포주는 각각의 promoter를 포함하는 200 ng의 pGL3-baseic vector 와 internal standard로 40 ng 의 pCMV-RL 혼합하여 3 ㎕의 Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 와 함께 co-transfection하였다. 30 hr 이지난 후에 Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 각 promoter의 활성을 측정하였다.
- Mutant plasmid는 pGL3-406 〜+30을 주형으로 QuikChangesite-directed mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA) 와 mutant oligonucleotides (GenoTech, Table 1)을 이용하여제공된 매뉴얼에 따라 합성하였다.
- Nuclear extraction kit (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 매뉴얼에 따라 각 세포로부터 핵단백질을 추출하였다. 먼저, 1 X 1()7세포를 수거하여 500 ㎕ 의 hypotonic lysis buffer에서 4°C에서 15 min 반응하여 세포를 파쇄하였다.
- Pfu DNA polymerase (MBI Fermentas, MD, USA) 를 이용하여 4개의 다른 HCCR promoter 영 역을 합성하였다(Fig. 1). 분리한 promoter 영 역을 주형으로 Table 1에 제시한 primer를 이용하여 PCR로 증폭하였다(Fig.
- Probe와 핵단백질 결합은 Gel shift Assay kit (Promega)를 제작사의 매뉴얼에 따라 진행하였다.
- 1). Renilla luciferase (RL)를 포함하는 pCMV-RL은 internal standard로 함께 co-transfection하여 LUC값을 RL값으로 normalization하여 결과값을 환산하였다. 측정한 모든 promoter fragment의 활성은 K562에서 가장 높은 활성을 보였지만, HEK293에서는 낮은 활성을, A549에서는 거의 활성이 없음을 관찰하였다(Fig.
- TGIF 핵단백 질의 결합을 확인하기 위해 TG probe의 TGIF 에 대한 consensus sequence를 치환한(TGA를 GTC로 치환함) mutant TG probe (mTG)를 제작하여 TGIF와의 결합 여부를 관찰하였다. Fig.
- 이들 promoter 영 역을 포함하는 reporter 벡터를이용하여 K562 세포에서 luciferase reporter assay를 수행하였다. pGL3-mTGIF에서 의미 있는 전사활성의 회복을 관찰하였다(Fig. 4). 이 결과를 종합해 보면, HCCR의 promoter에 TGIF 전사인자가 결합하여 그 유전자 발현을 부분적으로 억제하고, TGIF의 결합을 방해하면 그 활성이 의미 있게 회복됨을 알수 있다.
- 또한, TGIF 자리 에 돌연변이를 유발하면(pGL3-mTGIF) 발현의 억제가 회복됨을 관찰하였다. 본 연구에서는 HCCR promoter의 특성을 분석하였고, 이 과정 에서 -390에서 -366 사이 에 TGIF 전사인자가 결합하여 전사 활성을 조절함을 증명하였다.
- 관찰하였다⑷6]. 본 연구에서는 HCCR발현에 중요한 역할을 담당하는 부위를 검색하기 위하여 promoter 영역의 단백질합성 시작점 +30에서 5' 쪽 -147, -370, -406, -980까지 각각 합성하여 Firefly luciferase (LUC) 를 reporter gene으로 포함하는 pGL3-basic vector 에 cloning하였고, 이를 K562, HEK293, A549 세포주에 각각 transfection하여 각각의 reporter의 활성을 측정하였다(Fig. 1). Renilla luciferase (RL)를 포함하는 pCMV-RL은 internal standard로 함께 co-transfection하여 LUC값을 RL값으로 normalization하여 결과값을 환산하였다.
- 두 번째, promoter 내의 -370〜 4)6사이에 어떤 중요한 전사억제인자를 위한 부위가 존재 할수 있다. 실제로 전사인자가 결합하는지 확인하기 위하여, 합성한 36 bp 의 double strand oligo를 probe (P36)로 K562 핵단백질을 이용한 EMSA 분석을 하였다. Fig.
- 4). 이들 promoter 영 역을 포함하는 reporter 벡터를이용하여 K562 세포에서 luciferase reporter assay를 수행하였다. pGL3-mTGIF에서 의미 있는 전사활성의 회복을 관찰하였다(Fig.
- 먼저, 1 X 1()7세포를 수거하여 500 ㎕ 의 hypotonic lysis buffer에서 4°C에서 15 min 반응하여 세포를 파쇄하였다. 이를 IQOOOx g에서 20 min 4°C에서 원심 분리하여 침 전물을 extraction buffer (60 mM HEPES [pH 7.9], 1.5 mM MgCl2, 420 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 25% glycerol, 1 mM dithiothreitol, and protease inhibitor cocktail)를 이용하여 추출하였다.
- motif가 존재함을 확인하였다[4]. 이를 근거로 TGIF에대한 consensus sequence를 포함하는 oligo probe (TG)를 합성하여 K562 핵단백질을 대상으로 EMSA를 수행하였다. Fig.
- 이러한 의문을 해소하기 위한 일환으로 본 연구에서는 HCCR의 발현이 어떻게 조절되는지를 조사하였다. 이를 위해 먼저 HCCR 5' 쪽의 promoter 영 역을 분리하여 Luciferase assay법을 이용하여 K562, HEK293, A549 세포에서 분석하였고, Promoter의 -370에서 -406사이 36bp의 첨가로 promoter활성이 의미 있게 억제됨을 관찰하였다. 또한, 36 bp만을 포함하는 probe를 이용한 mobility shift assays (EMSA)에서 핵단백질이 결합함을 관찰하였고, 컴퓨터를 이용한 분석 에 서 TG-interacting factor (TGIF)에 대한 consensus sequences 존재함을 관찰하였다.
- 여기서는, 반대로 TGIF 자리에핵단백질 결합의 방해가 promoter 활성을 회복 시킬 수 있는지 그 연관성을 확인하였다. 이를 위해, pGL3-406〜+30 내에포함된 TGIF에 대한 consensus sequence자리를 치환한(TGA 를 GTC로 치환함) mutant돌연변이(pGL3-mTGIF)를 제작하였다(Fig. 4). 이들 promoter 영 역을 포함하는 reporter 벡터를이용하여 K562 세포에서 luciferase reporter assay를 수행하였다.
- 1). 증폭된 산물은 pGL3- Basic vector의 Xhol과 Kpnl 사이에 cloning하여 sequencing (GenoTech, Daejeon, Korea)을 통해 염기서열을 확인하였다.
대상 데이터
- 3 jig의 K562에서 추출한 nuclear extracts를 이용하였고, Double-strand oligonucleotide probes (G36, TG, mTG, Table 1)를 [r-32P]ATP (3, 000 Ci/mmol [10 mCi/ml]; NEN Life Science products) 와 T4 polynucleotide kinase (Invitrogen)로표지하였다. Probe와 핵단백질 결합은 Gel shift Assay kit (Promega)를 제작사의 매뉴얼에 따라 진행하였다.
- 구입하였다. HEK293는 DMEM (Gibco, Grand Island, NY, USA) 을 K562 와 A549세포는 RPMI에 각각 10% FBS와 1% penstrep (Gibco) 를 추가하여 37°C, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
- Human embryonic kidney (HEK)293 (ATCC CRK-1573), K562 chronic myelogenous leukemia (ATCC CCL-243), A549 lung cancer (ATCC CCL-185) 세포주는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. HEK293는 DMEM (Gibco, Grand Island, NY, USA) 을 K562 와 A549세포는 RPMI에 각각 10% FBS와 1% penstrep (Gibco) 를 추가하여 37°C, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
성능/효과
- 이를 위해 먼저 HCCR 5' 쪽의 promoter 영 역을 분리하여 Luciferase assay법을 이용하여 K562, HEK293, A549 세포에서 분석하였고, Promoter의 -370에서 -406사이 36bp의 첨가로 promoter활성이 의미 있게 억제됨을 관찰하였다. 또한, 36 bp만을 포함하는 probe를 이용한 mobility shift assays (EMSA)에서 핵단백질이 결합함을 관찰하였고, 컴퓨터를 이용한 분석 에 서 TG-interacting factor (TGIF)에 대한 consensus sequences 존재함을 관찰하였다. TGIF 만을 포함하는 probe (TG)와 돌연변이를 유발한 probe (mTG)를 이용한 EMSA에서이 자리 에 TGIF가 결합함을 보였다.
- TGIF 만을 포함하는 probe (TG)와 돌연변이를 유발한 probe (mTG)를 이용한 EMSA에서이 자리 에 TGIF가 결합함을 보였다. 또한, TGIF 자리 에 돌연변이를 유발하면(pGL3-mTGIF) 발현의 억제가 회복됨을 관찰하였다. 본 연구에서는 HCCR promoter의 특성을 분석하였고, 이 과정 에서 -390에서 -366 사이 에 TGIF 전사인자가 결합하여 전사 활성을 조절함을 증명하였다.
- 3A에서 나타난 것처럼 TG probe에 핵단백질이 결합함을 관찰하였다. 반면, 표지하지 않은 10배 농도의 TG probe (TG)와함께 반응한 EMSA에서는 관찰되지 않았고, 미표지의 2배의 TG probe (2TG)에서는 일부 결합이 방해됨을 관찰하였다(Fig. 3A).
- 4). 이 결과를 종합해 보면, HCCR의 promoter에 TGIF 전사인자가 결합하여 그 유전자 발현을 부분적으로 억제하고, TGIF의 결합을 방해하면 그 활성이 의미 있게 회복됨을 알수 있다. 하지 만, Fig.
- 여기서 두 가지 결과를 얻을 수 있었다. 첫 번째, 동일한 promoter가 세포주에 따라 전사활성이 크게 차이를 보인다. 이것은 특정 전사인자가 세포에 따라 다르게 발현하거나, 각각의 세포에서 각기 다른 전사인자가 작용하여 전사활성을조절할 수 있음을 의 미한다.
- Renilla luciferase (RL)를 포함하는 pCMV-RL은 internal standard로 함께 co-transfection하여 LUC값을 RL값으로 normalization하여 결과값을 환산하였다. 측정한 모든 promoter fragment의 활성은 K562에서 가장 높은 활성을 보였지만, HEK293에서는 낮은 활성을, A549에서는 거의 활성이 없음을 관찰하였다(Fig. 1). 실제로, 이들 세포주를 이용한 northern blot결과에서도 일치하는 결과를 얻었다 [11], 또한, pGL3-406〜+30과 pGL3-370〜+30의 활성을 비교해보면, 단지 36 bp의 추가로 의미 있는 활성의 감소를 관찰하였다.
- 이 결과를 종합해 보면, HCCR의 promoter에 TGIF 전사인자가 결합하여 그 유전자 발현을 부분적으로 억제하고, TGIF의 결합을 방해하면 그 활성이 의미 있게 회복됨을 알수 있다. 하지 만, Fig. 1과 4의 결과에서 TIGF자리를 존재 유무에 따라 의미 있게 활성 이 변화 하지만 그 차이가 크지 않음을고려한다면 HCCR 발현 조절에서 TGIF의 역할이 TGIF 단독의 효과라기보다는 또 다른 전사인자가 존재할 수 있으며, 이자리가 특정 환경 에서 이 proto-oncogene을 발현을 조절하는데 관여할 수 있음을 암시한다.
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