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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 국내에서 사육되는 서양종 꿀벌(Apis mellifera. L)을 전기충격법을 사용하여 순수한 봉독만을 분리한 후, 분리한 국내산 봉독의 여드름 개선 및 치료효과를 과학적으로 규명하기 위하여 여드름 주요 원인균인 P. acnes과 피부의 호기성 상재균 증식 억제 효과에 대하 조사하였다.
제안 방법
- −시료 투여 후 시간별로 항균작용이 어떻게 변하는지 측정하기 위하여 time-kill curve를 구하였다.
- 20) 정제 봉독은 액체크로마토그래피 (AKTA explorer, Pharmacia, USA)를 사용하여 확인하였다. 전개용매는 0.
- HDF 세포를 96 well plate에 5×105 cell/ml로 하여 분주하여 하루 동안 배양하여 부착시키고 새로운 배지로 교환한 다음 다양한 농도의 벌독을 처리하였다. 37oC, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양한 후 세포 생존율을 methylthiazol-2-yl-2.5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) 시약으로 처리하여 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 봉독의 피부세포독성을 평가하였다.
- Agar well diffusion assay에 의한 항균효과 검정은 P. acnes와 내성균주인 P. acnes , 피부 상재균인 S. aureus , S. epidermidis 및 S. pyogenes를 미리 배지에 접종하여 만든 agar plate에 10 mm의 직경으로 구멍을 낸 후 무균 여과한 봉독 시료를 10 mg, 5 mg, 2.5 mg 및 1 mg의 농도로 조절한 후 100 μl를 가하여 배양 하여 세균 증식억제 환 직경을 caliper(Mitutoyo, Japan)로 측정하였다.
- 각각의 접종 균은 2×106 CFU/well이 되도록 조절하여 봉독 시료와 함께 18시간 동안 배양한 후, 육안 및 현미경으로 균의 성장을 관찰하였고, 흡수파장 540 nm에서 흡광도를 측정하여 순수배양액의 흡광도 값과 같은 결과를 얻은 것을 최소억제농도로 결정하였다.
- 봉독 투여 후 시간별로 항균작용이 어떻게 변하는지 측정하기 위해 time-kill curve를 작성하였다. 대수기 초기의 P. acnes와 S. aureus 균주 배양액에 봉독을 최소 성장억제 농도의 각각 2배, 10배가 되도록 처리하고 2시간 간격으로 배양액을 채취하여 십진 희석법에 의해 희석한 후 각 희석액을 일정량 배지에 접종하고 배양한 후 생성되는 집락의 수를 측정하여 cfu/로 환산하였다.
- 봉독 투여 후 시간별로 항균작용이 어떻게 변하는지 측정하기 위해 time-kill curve를 작성하였다. 대수기 초기의 P.
- 액체배지 희석법에 의한 P. acnes와 내성균주인 P. acnes, 피부 상재균인 S. aureus, S. epidermidis 및 S. pyogenes 에 대한 최저 성장억제농도를 구하였다. 건조봉독은 멸균 증류수로 희석한 후 무균 여과하여 액체배지희석법에 준하여 단계적으로 희석하였다.
- 한방에서 봉침요법으로 여드름 치료 및 개선의 목적으로 사용하는 봉독을 봉독채집장치를 사용하여 국내산 꿀벌로부터 대량 분리, 정제하여 여드름 원인균인 P. acnes와 내성균인 P. acnes, 피부 상재균인 S. aureus , S. epidermidis 및 S. pyogenes 균에 대한 성장 억제 효과를 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
대상 데이터
- acnes를 5% sheep blood를 첨가한 trypticase soy(TS) broth(Difco Laboratories, MI, USA)를 사용하여 35oC에서 48시간 동한 혐기조건으로 배양한 후 시험에 사용하였다. P. acnes에 대한 양성 대조구로 azelaic acid(Sigma, USA) 용액을 사용하였다. 그 외의 피부상재균은 Muller-Hiton broth(Difco Laboratories, MI, USA)를 이용하여 37oC에서 18시간 동한 배양 후 사용하였고, S.
- P. acnes와 내성균주인 P. acnes를 5% sheep blood를 첨가한 trypticase soy(TS) broth(Difco Laboratories, MI, USA)를 사용하여 35oC에서 48시간 동한 혐기조건으로 배양한 후 시험에 사용하였다. P.
- 본 연구에서 사용한 여드름 원인균인 Propionibacterium acne(ATCC 6919)은 한국미생물균주은행으로부터 분양 받았으며, clindamycin 내성균주인 Propionibacterium acne(CCARM 9010)은 한국내성균주은행에서 분양 받아 실험에 사용하였다. 대표적인 피부 상재균인 Staphylococcus aureus(ATCC 25923), Staphylococcus epidermidis(ATCC 12228) 및 Sreptococcus pyogenes (ATCC 12353)은 한국미생물균주은행으로부터 분양 받아 사용하였다.
- 배양기에서 계대배양하여 실험에 사용하였다. 배양세포가 바닥 면적의 90% 가량 차도록 자라면 계대배양을 하고 대수 성장기의 세포를 실험에 사용하였다. HDF 세포를 96 well plate에 5×105 cell/ml로 하여 분주하여 하루 동안 배양하여 부착시키고 새로운 배지로 교환한 다음 다양한 농도의 벌독을 처리하였다.
- 본 연구소에서 사육중인 서양종꿀벌을 봉독채집장치((주)청진바이오텍, 한국)를 이용하여 봉독을 분리하고 불순물을 제거한 후 순수한 봉독만을 실험에 사용하였다.20) 정제 봉독은 액체크로마토그래피 (AKTA explorer, Pharmacia, USA)를 사용하여 확인하였다.
- 본 연구에서 사용한 여드름 원인균인 Propionibacterium acne(ATCC 6919)은 한국미생물균주은행으로부터 분양 받았으며, clindamycin 내성균주인 Propionibacterium acne(CCARM 9010)은 한국내성균주은행에서 분양 받아 실험에 사용하였다. 대표적인 피부 상재균인 Staphylococcus aureus(ATCC 25923), Staphylococcus epidermidis(ATCC 12228) 및 Sreptococcus pyogenes (ATCC 12353)은 한국미생물균주은행으로부터 분양 받아 사용하였다.
- 20) 정제 봉독은 액체크로마토그래피 (AKTA explorer, Pharmacia, USA)를 사용하여 확인하였다. 전개용매는 0.1 M ammonium formate (pH 4.5)를 사용하였고, Sephadex TM75 컴럼을 사용하였으며, 봉독 표준품으로는 시그마산 꿀벌독(Sigma, USA)과 멜리틴(mellitin)(Sigma, USA)을 이용하였다. 봉독성분중에 멜리틴 함량은 아래와 같은 식으로 구하였다.
- 피부세포에 대한 봉독의 세포독성을 알아보기 위하여 human dermal fibroblast(HDF) 세포를 MCTT사(MCTT, 서울)로부터 구입하여 FGM-2 배지를 사용하여 37oC, 5% CO2 배양기에서 계대배양하여 실험에 사용하였다. 배양세포가 바닥 면적의 90% 가량 차도록 자라면 계대배양을 하고 대수 성장기의 세포를 실험에 사용하였다.
이론/모형
- acnes에 대해서도 성장 억제 효과를 보였다. Fig. 2에서와 같이 증식억제대의 측정은 well diffusion 법을 이용하였다. 대조군으로 사용한 배지만을 주입한 well에서는 균의 증식이 억제되지 않았으나, 봉독의 경우 P.
- pyogenes 에 대한 최저 성장억제농도를 구하였다. 건조봉독은 멸균 증류수로 희석한 후 무균 여과하여 액체배지희석법에 준하여 단계적으로 희석하였다.21)
성능/효과
- − Table I에서와 같이 봉독은 여드름의 주요 유발 원인균인 P. acnes에 대한 성장 억제 효과를 보였으며, clindamycin 내성균주인 P. acnes에 대해서도 성장 억제 효과를 보였다.
- 1. 액체배지 희석법에 의한 최저성장억제농도는 P. acnes에 대해서는 MIC , 내성균인 P. acnes, 의 경우 이며, 피부상재균인 S. aureus, S. epidermidis 및 S. pyogenes 균에 대한 MIC는 각각 으로 성장 억제 효과가 우수하였다.
- 2. well diffusion법에 의한 성장억제 효과 P. acnes의 경우 2.5mg의 봉독 양으로도 억제환이 관찰되었으며, 내성균인 P. acnes, 피부 상재균인 S. aureus , S. epidermidis 및 S. pyogenes 균에서도 각각 5 mg의 봉독으로도 세균 증식 억제 환을 볼 수 있었다.
- 3. 봉독 투여 후 시간별로 P. acnes와 S. aureus에 대한 항균작용이 어떻게 변하는지 측정하기 위하여 time-kill curve에서도 짧은 시간 내에도 항균효과를 보이며, 처리시간이 증가함에 따라 억제 효과가 증가하였다.
- 4,5) 또한 여러 가지 항균제를 포함하는 항균 비누을 사용할 경우 피부 상재균의 수를 줄여 여드름 치료뿐 아니라 염증성 병변으로의 진행을 막는 예방효과가 있음을 보여준다는 보고가 있다.5) 봉독은 대표적인 피부 상재균인 S. aureus, S. epidermidis 및 S. pyogenes 균 모두에서 우수한 항균 효과를 보이는 것으로 나타났다 (Table I). 특히 S.
- 2). S. epidermidis와 S. pyogenes 균주에 대해서는 5 mg 이상의 농도에서부터 균의 증식억제효과가 나타났다. Well diffusion법을 이용한 봉독의 항균력에서 생육저지대가 좁게 나타나는 현상은 봉독의 항균력을 가지고 있는 성분의 배지 내 확산이 다소 저해되기 때문인 것으로 추정된다.
- 2에서와 같이 증식억제대의 측정은 well diffusion 법을 이용하였다. 대조군으로 사용한 배지만을 주입한 well에서는 균의 증식이 억제되지 않았으나, 봉독의 경우 P. acnes과 내성균주인 P. acnes에서 모두 2.5 mg의 농도에서도 균의 증식억제 효과가 있었다 (Fig. 2). 실험에 사용한 농도범위에서는 봉독의 농도가 증가함에 따라 증식 억제 효과가 현저하게 증가하는 것으로 나타났으며, 봉독은 P.
- −시료 투여 후 시간별로 항균작용이 어떻게 변하는지 측정하기 위하여 time-kill curve를 구하였다. 대조군의 경우 시간이 경과함에 따라 P. acnes와 S. aureus균의 증식이 증가하였으나, 봉독 처리군은 시간이 경과할수록 균의 증식이 억제됨을 알 수 있었다 (Fig. 3). P.
- Well diffusion법을 이용한 봉독의 항균력에서 생육저지대가 좁게 나타나는 현상은 봉독의 항균력을 가지고 있는 성분의 배지 내 확산이 다소 저해되기 때문인 것으로 추정된다. 또한 봉독은 주요 피부 상재균에 대한 우수한 성장 억제 효과가 있을 알 수 있었다.
- acnes에 모두 강한 항균력을 보였으며, 피부 상재균에 대해서도 우수한 항균력을 보였다. 시간별 항균력을 측정한 결과 시료 처리 후 짧은 시간 내에도 항균효과를 나타내었으며, 처리 시간이 증가함에 따라 그 효과가 증가하였다. 항생제 투여가 모든 여드름에 치료효과가 있는 것은 아니지만 염증성 여드름 치료에 효과적이며, 모낭내 P.
- 2). 실험에 사용한 농도범위에서는 봉독의 농도가 증가함에 따라 증식 억제 효과가 현저하게 증가하는 것으로 나타났으며, 봉독은 P. acnes의 경우에 내성균에서도 강한 성장 억제 효과를 볼 수 있었다. P.
- 이상의 결과로 봉독은 여드름의 원인이 되는 P. acnes와 내성균인 P. acnes에 모두 강한 항균력을 보였으며, 피부 상재균에 대해서도 우수한 항균력을 보였다. 시간별 항균력을 측정한 결과 시료 처리 후 짧은 시간 내에도 항균효과를 나타내었으며, 처리 시간이 증가함에 따라 그 효과가 증가하였다.
- 1). 채집 봉독과 시그마산 봉독 모두의 멜리틴 함량은 약 50.9%였다. 이는 봉독의 멜리틴 함량이 40-60% 내외로 알려진 바와 같이 봉독채집장치를 사하여 채집된 봉독의 성분이 균일하며, 봉침요법과 달리 정량화 하는데 매우 용이하였다.
- pyogenes 균 모두에서 우수한 항균 효과를 보이는 것으로 나타났다 (Table I). 특히 S. aureus 균주에서는 2.5 mg의 낮은 농도에서도 균의 증식억제 효과가 있었으며, 농도가 증가 할 수록 증식억제 효과가 증가하였다 (Fig. 2). S.
후속연구
- acnes 균수를 감소시키며 지방분해효소의 활성을 억제시켜 유리지방산 생성을 감소시키고 호중구의 화학주성을 억제함으로 여드름의 염증성 병변을 감소시킨다고 하였다.3,22) 본 결과를 바탕으로 천연항균물질인 봉독을 1 mg/ml이하의 농도로 사용한다면 세포 안정성 뿐만 아니라, 여드름 유발균과 피부 상재균에 강한 억제 작용을 하며, 여드름 특히 염증성 여드름 치료에 효과가 뛰어날 것으로 생각되어 향후 여드름 치료제의 개발 가능성이 높은 것으로 사료된다.
- 봉독은 여드름 유발균과 피부 상재균에 강한 억제 작용을 하며, 여드름 특히 염증성 여드름 치료에 효과가 뛰어나 향후 여드름 치료제의 개발 가능성이 높은 것으로 생각된다.
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