[국내논문]소동물 발광영상 측정을 위한 광학분자영상기기의 개발 Development of Optical Molecular Imaging System for the Acquisition of Bioluminescence Signals from Small Animals원문보기
목적: 광학영상기술은 소동물이나 임상연구에서 분자영상법으로 알려진 첨단연구 분야이다. 광학영상기기는 소동물영상연구 및 추적연구에 중요한 역할을 수행하고 있다. 발광영상에서 소동물을 영상화 하기 위해서는 피부조직을 뚫고 나오는 광자를 검출하기 위한 고민감도 CCD카메라가 필요하다. 이 연구에서는 소동물에서 발생하는 발광신호를 검출하기 위해 개발한 광학영상기기를 소개하고자 한다. 대상 및 방법: 냉각형 CCD카메라와 집광렌즈, 8개의 백색광LED광원을 암실상자 안에 장치하였다. 팬텀 및 튜브를 이용한 영상을 얻은 후 발광 박테리아를 이용하여 CT26 암모델 누드마우스에서 영상을 획득하였다. 결과: 발광영상을 얻기 위한 광학영상기기를 설계하고 개발하였다. 영상획득이 성공적으로 수행되었고, 시스템을 완성하였다. 개발된 장비는 분자영상연구에 사용되고 있다. 결론 개발된 광학영상장비는 다양한 실험적 조건을 만족하는 연구에 최적화하여 유용한 도구로 자리잡을 것으로 기대한다.
목적: 광학영상기술은 소동물이나 임상연구에서 분자영상법으로 알려진 첨단연구 분야이다. 광학영상기기는 소동물영상연구 및 추적연구에 중요한 역할을 수행하고 있다. 발광영상에서 소동물을 영상화 하기 위해서는 피부조직을 뚫고 나오는 광자를 검출하기 위한 고민감도 CCD카메라가 필요하다. 이 연구에서는 소동물에서 발생하는 발광신호를 검출하기 위해 개발한 광학영상기기를 소개하고자 한다. 대상 및 방법: 냉각형 CCD카메라와 집광렌즈, 8개의 백색광 LED광원을 암실상자 안에 장치하였다. 팬텀 및 튜브를 이용한 영상을 얻은 후 발광 박테리아를 이용하여 CT26 암모델 누드마우스에서 영상을 획득하였다. 결과: 발광영상을 얻기 위한 광학영상기기를 설계하고 개발하였다. 영상획득이 성공적으로 수행되었고, 시스템을 완성하였다. 개발된 장비는 분자영상연구에 사용되고 있다. 결론 개발된 광학영상장비는 다양한 실험적 조건을 만족하는 연구에 최적화하여 유용한 도구로 자리잡을 것으로 기대한다.
Purpose: Optical imaging is providing great advance and improvement in genetic and molecular imaging of animals and humans. Optical imaging system consists of optical imaging devices, which carry out major function for monitoring, tracing, and imaging in most of molecular in-vivo researches. In bio-...
Purpose: Optical imaging is providing great advance and improvement in genetic and molecular imaging of animals and humans. Optical imaging system consists of optical imaging devices, which carry out major function for monitoring, tracing, and imaging in most of molecular in-vivo researches. In bio-luminescent imaging, small animals containing luciferase gene locally irradiate light, and emitted photons transmitted through skin of the small animals are imaged by using a high sensitive charged coupled device (CCD) camera. In this paper, we introduced optical imaging system for the image acquisition of bio-luminescent signals emitted from small animals. Materials and Methods: In the system, Nikon lens and four LED light sources were mounted at the inside of a dark box. A cooled CCD camera equipped with a control module was used. Results: We tested the performance of the optical imaging system using effendorf tube and light emitting bacteria which injected intravenously into CT26 tumor bearing nude mouse. The performance of implemented optical imaging system for bio-luminescence imaging was demonstrated and the feasibility of the system in small animal imaging application was proved. Conclusion: We anticipate this system could be a useful tool for the molecular imaging of small animals adaptable for various experimental conditions in future.
Purpose: Optical imaging is providing great advance and improvement in genetic and molecular imaging of animals and humans. Optical imaging system consists of optical imaging devices, which carry out major function for monitoring, tracing, and imaging in most of molecular in-vivo researches. In bio-luminescent imaging, small animals containing luciferase gene locally irradiate light, and emitted photons transmitted through skin of the small animals are imaged by using a high sensitive charged coupled device (CCD) camera. In this paper, we introduced optical imaging system for the image acquisition of bio-luminescent signals emitted from small animals. Materials and Methods: In the system, Nikon lens and four LED light sources were mounted at the inside of a dark box. A cooled CCD camera equipped with a control module was used. Results: We tested the performance of the optical imaging system using effendorf tube and light emitting bacteria which injected intravenously into CT26 tumor bearing nude mouse. The performance of implemented optical imaging system for bio-luminescence imaging was demonstrated and the feasibility of the system in small animal imaging application was proved. Conclusion: We anticipate this system could be a useful tool for the molecular imaging of small animals adaptable for various experimental conditions in future.
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문제 정의
이 연구에서는 분자영상연구를 수행하는데 있어서 소동물을 이용한 발광영상 측정을 위한 분자광학영상기기의 설계 및 제작과정을 소개하고, 획득된 발광신호를 영상으로 구현한 결과를 제시하였다. 마우스 암모델 및 팬텀에서 발현된 발광 신호를 실험조건을 달리하여 획득하였고 이렇게 획득된 발광영상을 통해서 개발된 분자광학영상기기의 활용 가능성을 소개하고자 한다.
결과를 제시하였다. 마우스 암모델 및 팬텀에서 발현된 발광 신호를 실험조건을 달리하여 획득하였고 이렇게 획득된 발광영상을 통해서 개발된 분자광학영상기기의 활용 가능성을 소개하고자 한다.
이렇게 민감도를 향상시키기 위한 방법으로 냉각형 CCD를 탑재하거나 신호증폭형 CCD를 이용하는 방법이 있다. 이 연구에서는 개발된 시스템의 활용가능성을 확인하기 위한 것을 목표로 하였으며 이를 확인하기 위해서 미약한 발광 영상 획득을 수행하였다. 따라서 목표에 맞추어 기초적인 발광 영상을 획득할 수 있었다.
이 연구에서는 개발된 시스템의 활용가능성을 확인하기 위한 것을 목표로 하였으며 이를 확인하기 위해서 미약한 발광 영상 획득을 수행하였다. 따라서 목표에 맞추어 기초적인 발광 영상을 획득할 수 있었다. 하지만 궁극적인 기기 개발의 목표는 다양한 분자영상실험을 지원할 수 있는 활용성이 극대화된 장비로 발전시키는 것이다.
따라서 목표에 맞추어 기초적인 발광 영상을 획득할 수 있었다. 하지만 궁극적인 기기 개발의 목표는 다양한 분자영상실험을 지원할 수 있는 활용성이 극대화된 장비로 발전시키는 것이다.
제안 방법
개발중인 발광영상기기 (ALIS: animal lighting imaging system) 의 하드웨어의 구성은 검출기부분, 스테이지부분, 암실부분으로 나누어져 있으며, 각각의 구동 및 제어 모듈은 작업용 컴퓨터를 통해서 제어할 수 있도록 설계하였다 검출 기부분에는 CCD (Princeton instruments, Roper scientific, USA) 카메라와 CCD 카메라 제어장치(ST133B, 16bit@ 100kHz & 1MHz) 그리고 집광 렌즈가 사용되었다. CCD 카메라를 암실상단에 수직으로 부착하였고 영상획득을 위해 이를 제어장치에 연결을 하였다.
CCD 카메라를 암실상단에 수직으로 부착하였고 영상획득을 위해 이를 제어장치에 연결을 하였다. CCD 카메라에 C 마운트를 통해서 집광 렌즈를 연결할 수 있도록 하였으며, 고효율 집광을 위해서 밝기가 밝은 일반 카메라용 렌즈(Nikon, 50mm, F/1.
CCD 카메라를 암실상단에 수직으로 부착하였고 영상획득을 위해 이를 제어장치에 연결을 하였다. CCD 카메라에 C 마운트를 통해서 집광 렌즈를 연결할 수 있도록 하였으며, 고효율 집광을 위해서 밝기가 밝은 일반 카메라용 렌즈(Nikon, 50mm, F/1.2) 를 CCD 카메라 앞에 장착하였다. 스테 이 지부 분에는 투명 패널, 검은색 불투명 패널, 케이스형 패널들을 교체 가능하도록 설계하였으며.
2) 를 CCD 카메라 앞에 장착하였다. 스테 이 지부 분에는 투명 패널, 검은색 불투명 패널, 케이스형 패널들을 교체 가능하도록 설계하였으며. 암실은 빛의 차단 및 내부반사가 없도록 내부 전체를 코팅처리를 하였다 CCD 카메라의 민감도를 보장하기 위하여 선택한 액체질소 냉각 CCD 카메라는 온도에 의한 잡음을 줄이기 위해 T20 도까지 냉각이 가능하다.
암실은 빛의 차단 및 내부반사가 없도록 내부 전체를 코팅처리를 하였다 CCD 카메라의 민감도를 보장하기 위하여 선택한 액체질소 냉각 CCD 카메라는 온도에 의한 잡음을 줄이기 위해 T20 도까지 냉각이 가능하다. 직접조명을 위해 암실내부상단에 8개의 백색 LED를 설치하였고 모터제어기(AJIN田XTEK, Korea)와 연결하여 광원의 on/off를 제어할 수 있도록 하였다. 스테이지는 실험대상체의 높이와 카메라의 초점 거리확보를 위해 40cm 이상 거리를 유지하였다.
스테이지는 실험대상체의 높이와 카메라의 초점 거리확보를 위해 40cm 이상 거리를 유지하였다. 제어상자는 작업용 컴퓨터에 연결되어 있어서 사용자가 컴퓨터를 이용하여 모든 하드웨어를 제어하고 영상을 획득할 수 있으며, 발광 영상을 처리하고 분석하기 위한 소프트웨어는 영상획득 라이브러리 모듈을 이용하여 Visual C++로 개발하였다(Fig 1).
Figure 1. Optic에 imaging system was designed and implemented. The bock diagram shows functional working flow for image ocqui$ition and processing.
발광의 세기에 따른 획득영상차이를 조사하기 위하여 발광 박테리아가 든 effendorf 튜브를 사용하였다. 발광 박테리아를 만들기 위해 E.
박테리아가 든 effendorf 튜브를 사용하였다. 발광 박테리아를 만들기 위해 E.coli 중에서도 DH5a를 이용하여 발광시키는 유전자인 lux CDABE로 형질전환 하였다. 형질전환 된 DH5a를 14시간에서 16시간 동안 세포배양을 하여 발광 박테리아 수를 lxio7, ixio8, 1x10® lxio10, 5xlO10
개로 달리 함으로써 밝기가 서로 다른 5개의 effendorf 튜브를 각각 만들었다. 다섯 개의 다른 밝기를 가지는 effendorf 튜브 속 발광신호를 영상화하였다
각각 만들었다. 다섯 개의 다른 밝기를 가지는 effendorf 튜브 속 발광신호를 영상화하였다
렌즈밝기차이에 따른 신호획득감소정도를 조사하기 위해 최대값에서부터 조리개수를 한 단계씩 줄여가며 영상을 얻었다. 가장 밝은 F 값은 1.
6, 8의 순서로 영상을 얻었다. 야광물질이 들어있는 모형쥐를 이용하여 시간에 따라 획득신호 카운트의 변화를 알아보기 위해 영상획득을 각 F수에 따라 구분하여 수행하였으며, 획득 시간은 0.5초, 1초 2초 3초, 4초, 5초 10초. 30초, 60초이였다.
배경부의 잡음신호의 균일성을 평가하기 위하여 샘플이 없는 상태에서 1초, 2초 3초 5S, 10초 20초, 30초 60초에서 영상을 얻은 후 전체 영상부분 중 12개의 관심 영역에서 총 계수를 얻어 이들의 평균을 구하였다.
살모넬라 JH20은 살모넬라 sch2130에 lux 유전자로 형질전환 한 두], GFP plasmid로 형질전환하여 만들었다. 마취한 쥐를 개발한 광학분자영상기기에서 1분 동안 노출을 주고 영상을 획득하였다.
두 기기들로부터 얻어진 영상데이터는 Xenogen에서 사용하고 있는 소프트웨어 (living image, v.2.5)» 이용하여 분석 및 비교하였으며, 팬텀영상 및 마우스 영상에서도 각각 같은 방법으로 결과를 얻었다.
2). 영하 120도로 냉각시키기 위해 액체질소로 약 1시간 이상 냉각 시킨 후 0.1 초에서 60 초까지 CCD가 이상없이 동작함을 확인하였으며, 팬텀을 이용한 영상을 획득하였다. 영상획득 신호처리 보드를 통해 영상신호가 정보의 손실없이 전달되었으며.
조명장치인 LED 광원들의 제어도 적절히 수행되었다. 렌즈에서 물체와의 초점거리는 수동으로 조절하였다. 광학 분자영상기기로부터 획득한 영상의 크기는 512x512 픽셀로 하였으며 사용자에 의한 변경이 가능하다.
조명영상을 0.15초 동안 얻어 배경영상을 확보한 후 발광 영상을 마우스 팬텀에서 60초 동안 신호를 획득하여 영상을 얻었다. 같은 영상획득 시간에서는 민감도가 높은 상용화 장비인 IVIS-100에서 얻어진 영상과 비교를 하였다.
15초 동안 얻어 배경영상을 확보한 후 발광 영상을 마우스 팬텀에서 60초 동안 신호를 획득하여 영상을 얻었다. 같은 영상획득 시간에서는 민감도가 높은 상용화 장비인 IVIS-100에서 얻어진 영상과 비교를 하였다. 광량이 ALIS에서 얻어진 것보다 전반적으로 높았으나, 발광 위치의 구분에서는 차이가 없었다(Fig.
소동물 발광신호를 측정하기 위한 광학 분자 영상 장치를 설계하고 개발하였다. 미약한 발광신호를 획득하기 위해 민감도가 높은 냉각형 CCD 카메라를 사용하였으며, 시스템을 암실로 구성하였다.
ALIS에서 단초점렌즈를 사용하였을 때, 렌즈의 조리개를 닫으면서 밝기조절을 하여 영상을 획득하였다. 영상의 대조 도가 점차 낮아졌으며 조리개의 f-수가 4 이상에서는 거의 육안으로는 구분하기 힘들었다.
대상 데이터
살아있는 balb 쥐에서 발광영상을 획득하기 위해 유방암 4T1 을 이식한 쥐에 개의 살모넬라 JH20을 정맥주사를 하고 10일 뒤에 복강 마취를 하여 살아있는 쥐에서의 발광 영상을 획득하였다. 살모넬라 JH20은 살모넬라 sch2130에 lux 유전자로 형질전환 한 두], GFP plasmid로 형질전환하여 만들었다.
획득하였다. 살모넬라 JH20은 살모넬라 sch2130에 lux 유전자로 형질전환 한 두], GFP plasmid로 형질전환하여 만들었다. 마취한 쥐를 개발한 광학분자영상기기에서 1분 동안 노출을 주고 영상을 획득하였다.
영상기기 본체의 크기는 높이 150 cm, 폭 65 cm, 깊이 65 cm 이고 120x65 cm2 크기의 보조선반에는 각종 제어장치 및 컴퓨터를 위치하였으며, 높이가 62 cm 이다(Fig. 2). 영하 120도로 냉각시키기 위해 액체질소로 약 1시간 이상 냉각 시킨 후 0.
개발한 ALIS 장비를 이용하여 광학분자영상 연구에서 많이 사용하고 있는 누드마우스의 발광영상을 획득하기 위해 F/1.2 렌즈를 사용하였으며, 0.15초간 배경영상을 얻은 후 60초간 발광영상을 얻었다. 픽셀의 민감도를 유지하기 위해 binning을 6으로 맞추었으며, 영상의 크기는 512柘12로 하였다.
개발하였다. 미약한 발광신호를 획득하기 위해 민감도가 높은 냉각형 CCD 카메라를 사용하였으며, 시스템을 암실로 구성하였다. 팬텀을 이용한 결과 및 실제 실험용 누드 마우스를 이용한 결과를 CCD 카메라를 이용하여 영상으로 획득할 수 있었다.
미약한 발광신호를 획득하기 위해 민감도가 높은 냉각형 CCD 카메라를 사용하였으며, 시스템을 암실로 구성하였다. 팬텀을 이용한 결과 및 실제 실험용 누드 마우스를 이용한 결과를 CCD 카메라를 이용하여 영상으로 획득할 수 있었다. 이 연구의 결과를 통하여 상용화된 장비에서는 제공되지 않는 연구자가 필요로 하는 기능을 시스템 개발에 반영하여 향후 개선할 수 있을 것으로 기대하며, 광학영상기기 개발에 필요한 기초연구 기반이 조성되었다는 점에서 의의가 크다고 하겠다.
성능/효과
5x1010개의 박테리아가 들어있는 튜브에서의 광량의 최대값은 24, 259였고, 1시(f 개의 박테리아가 들어있는 튜브에서의 광량의 최대값은 203으로 박테리아의 개수에 따라 측정되는 값이 비례하였다. 영상을 5초 동안 노출하여 획득한 결과는 광량이 낮은 영역에서는 신호가 모두 약하였으며, 박테 리아가 많은 튜브에서는 ALIS와 IVIS-100과 유사하게 영상이 얻어짐을 육안으로 확인할 수 있었다(Fig. 3).
배경영역에서의 획득된 카운트를 비교화기 위해서 주변부에서 설정한 12곳의 관심영역에서 측정한 카운트의 평균값을 비교한 결과는 획득시간의 변화와는 무관하게 12곳에서의 광량 평균이 일정하게 유지되는 것을 알 수 있었으며 편차는 0.27-0.28%로 매우 낮았다(Fig. 5).
1) 영상획득 시 조건을 일정하게 유지해야 하는데, 시간만 일정하게 하는 것이 아니고, binning, f-수, 확대비율 등을 일정하게 유지해야 한다.
2) 광자의 표준화 정량결과로서 IVIS-100에서는 flux라는 개념을 사용하고 있는데, 이는 단위면적당 단위시간에 통과하는 물리량에서 시작된 것이다. 실제 이것의 계산에는 검출기에서 대상체간의 거리가 들어가기 때문에 잘 안 보인다고 위로 올려서 찍거나 낮추어서 찍어도 차이가 없다고 보아야 할 지 생각해 보아야 한다.
4) F-수는 조리개의 크기에 해당하므로 발광의 세기가 큰 경우에 높은 수를, 발광의 세기가 낮은 경우에는 낮은 수를 설정해야 할 것이다.
6) 발광분자영상기기는 대부분 렌즈를 사용하는데, 렌즈에서 미세발광의 검출을 방해하는 것은 먼지, 지문 등이 있고, 습도가 높아져서 생기는 미세 물방울이 있을 수 있다. 왜냐하면 한 마리에서 여러 마리의 소동물을 여러 번 실험하다 보면 자연적으로 발생하는 습도가 렌즈의 상태를 변화 시킬 수 있기 때문이다.
7) 냉각형 CCD를 사용하는 기기인 경우 냉각시간을 충분히 주어 장비가 안정화 될 수 있도록 기다려야 할 것이다. 계속 냉각을 유지되게 하는 장비에서는 그렇지 않지만 실험 시작시점에서 다시 전원을 켜서 돌리는 장비는 초기 시간을 충분히 가져야 할 것이다.
기술력으로는 외국의 장비가 상당히 앞서 있다. 하드웨어를 설계하여 영상을 획득한 결과, 소프트웨어를 통해 하드웨어의 제어와 영상획득이 가능하며, 하드웨어들 간의 수행이 잘 이루어짐을 알 수 있었다. 분자영상분석용 처리도구들은 국내에서는 개발되지 않고 있다.
3) Binninge 기본으로 설정되어 있는 것을 사용하면 되겠지만 발광의 세기가 큰 경우에는 낮게, 발광의 세기가 작은 경우에는 높게 설정을 하면 민감도를 높일 수 있다. 하지만 이렇게 할 경우 상대비교에 영향을 줄 수도 있다.
후속연구
팬텀을 이용한 결과 및 실제 실험용 누드 마우스를 이용한 결과를 CCD 카메라를 이용하여 영상으로 획득할 수 있었다. 이 연구의 결과를 통하여 상용화된 장비에서는 제공되지 않는 연구자가 필요로 하는 기능을 시스템 개발에 반영하여 향후 개선할 수 있을 것으로 기대하며, 광학영상기기 개발에 필요한 기초연구 기반이 조성되었다는 점에서 의의가 크다고 하겠다.
상용화 되어 있는 발광 영상 장비에서도 민감도가 낮은 제품이 상당수 있는데, 이는 형광영상과의 병행실험이 가능하도록 하는 조건에서 하드웨어의 구성을 최적화하기 힘들었기 때문이라고 생각한다. 후속연구를 통해 소프트웨 어의 지속적인 개선을 수행하고 이를 기반을 범용적인 보정기법을 개발하고, 표준화된 정 량결과로 환산할 수 있게 된다면 특정형광파장에 의존성이 상대적으로 약한 활용범위가 넓은 시스템으로 확장할 것으로 기대한다.
5) 카운트 및 표준화 정량결과를 연속적으로 실험하여 비교할 경우에는 영상결과와 일치를 위해서 하향한계에 대한 역치값을 일정하게 잡아야 할 것이다. 그렇지 않은 경우에는 대부분 최적화 영상의 제공하기 때문에 값의 상대적 차이를 영상만으로 구분하기 힘든 경우가 있다.
그러나 하드웨어 부품들이 가지는 기본적인 라이브러리는 사용 가능하므로 하드웨어 부품을 초기화 하고 조절 할 수 있는 함수를 이용하여 소프트웨어를 개발 중에 있다. 향후 하드웨어의 최적화 및 소프트웨어의 개발을 통해 완성도 높은 발광영상측정기기를 개발할 수 있을 것으로 기대한다.
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