본 연구에서는 저온에서의 재조합 단백질 생산성 향상을 위하여 저온에서 RNA 샤페론 활성을 지닌다고 알려진 CspA 단백질의 발현이 서로 다른 온도에서 대장균의 성장 및 GFP의 발현 속도에 어떻게 영향을 미치는지를 살펴보았다. $20^{\circ}C$, $25^{\circ}C$, $37^{\circ}C$에서는 세포 성장 및 GFP의 생산이 CspA의 발현에 영향을 받지 않았으나, $15^{\circ}C$에서는 GFP의 총 생산성이 CspA의 동시 발현에 의해 향상되었으며 이는 세포 성장 속도의 향상에 기인함을 확인하였다. 결론적으로 CspA의 발현은 $15^{\circ}C$에서 세포 당 재조합 단백질 생산량의 증가에는 영향을 미치지 않으나, 즉 재조합 단백질의 번역 효율에는 큰 영향을 미치지 않으나, 대장균 성장 속도에 영향을 미치며, 이를 통해 재조합 단백질의 총 생산량 향상을 유도 할 수 있을 것으로 기대된다.
본 연구에서는 저온에서의 재조합 단백질 생산성 향상을 위하여 저온에서 RNA 샤페론 활성을 지닌다고 알려진 CspA 단백질의 발현이 서로 다른 온도에서 대장균의 성장 및 GFP의 발현 속도에 어떻게 영향을 미치는지를 살펴보았다. $20^{\circ}C$, $25^{\circ}C$, $37^{\circ}C$에서는 세포 성장 및 GFP의 생산이 CspA의 발현에 영향을 받지 않았으나, $15^{\circ}C$에서는 GFP의 총 생산성이 CspA의 동시 발현에 의해 향상되었으며 이는 세포 성장 속도의 향상에 기인함을 확인하였다. 결론적으로 CspA의 발현은 $15^{\circ}C$에서 세포 당 재조합 단백질 생산량의 증가에는 영향을 미치지 않으나, 즉 재조합 단백질의 번역 효율에는 큰 영향을 미치지 않으나, 대장균 성장 속도에 영향을 미치며, 이를 통해 재조합 단백질의 총 생산량 향상을 유도 할 수 있을 것으로 기대된다.
One of the major drawbacks associated with the high-level expression of the recombinant proteins in Escherichia coli is the formation of insoluble inclusion bodies in the cytoplasm. Production of recombinant protein at reduced temperature has proven effective in improving the solubility of a number ...
One of the major drawbacks associated with the high-level expression of the recombinant proteins in Escherichia coli is the formation of insoluble inclusion bodies in the cytoplasm. Production of recombinant protein at reduced temperature has proven effective in improving the solubility of a number of structurally and functionally unrelated proteins, but a major limitation of using low temperatures for recombinant protein production in E. coli is the reduced rate of synthesis of the heterologous protein caused by the significant reduction of cell growth rate. Here we investigated the effect of co-expression of CspA, a cold-shock protein known to be RNA chaperone at low temperature, on the productivity of recombinant protein at various temperatures by using green fluorescence protein (GFP) as a model recombinant protein. We could observe that the co-expression of CspA enhanced the productivity of GFP at $15^{\circ}C$ by accelerating the growth of E. coli at the temperature. On the other hand, the CspA coexpression didn't affect the cell growth rate as well as the specific GFP production rate at other tested temperatures, $20^{\circ}C$, $25^{\circ}C$, and $37^{\circ}C$.
One of the major drawbacks associated with the high-level expression of the recombinant proteins in Escherichia coli is the formation of insoluble inclusion bodies in the cytoplasm. Production of recombinant protein at reduced temperature has proven effective in improving the solubility of a number of structurally and functionally unrelated proteins, but a major limitation of using low temperatures for recombinant protein production in E. coli is the reduced rate of synthesis of the heterologous protein caused by the significant reduction of cell growth rate. Here we investigated the effect of co-expression of CspA, a cold-shock protein known to be RNA chaperone at low temperature, on the productivity of recombinant protein at various temperatures by using green fluorescence protein (GFP) as a model recombinant protein. We could observe that the co-expression of CspA enhanced the productivity of GFP at $15^{\circ}C$ by accelerating the growth of E. coli at the temperature. On the other hand, the CspA coexpression didn't affect the cell growth rate as well as the specific GFP production rate at other tested temperatures, $20^{\circ}C$, $25^{\circ}C$, and $37^{\circ}C$.
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문제 정의
다음으로 GFP가 20 ℃ 및 25 ℃ 에서 대장균 성장 속도 및 GFP의 발현도에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위한 실험을 수행하였다. E.
본 연구에서는 저온에서의 재조합 단백질 생산성 향상을 위하여 저온에서 RNA 샤페론 활성을 지닌다고 알려진 CspA 단백질의 발현이 서로 다른 온도에서 대장균의 성장 및 GFP의 발현 속도에 어떻게 영향을 미치는지를 살펴보았다. 20℃, 25℃, 37℃ 에서는 세포 성장 및 GFP의 생산이 CspA의 발현에 영향을 받지 않았으나, 15 ℃ 에서는 GFP의 총 생산성이 CspA의 동시 발현에 의해 향상되었으며 이는 세포 성장 속도의 향상에 기인함을 확인하였다 결론적으로 CspA의 발현은 15 ℃ 에서 세포 당 재조합 단백질 생산량의 증가에는 영향을 미치지 않으나 즉 재조합 단백질의 번역 효율에는 큰 영향을 미치지 않으나, 대장균성장 속도에 영향을 미치며, 이를 통해 재조합 단백질의 총생산량 향상을 유도 할 수 있을 것으로 기대된다.
즉 저온에서는 세포내의 mRNA들이 2차 구조 (secondary structure)를 형성하게 되어 번역 (translation)효율이 감소될 수 있는데, 저온에서의 CspA 발현은 mRNA의 2차 구조 형성을 제어하는 기능을 수행하여 저온에서의 세포 내 번역 효율을 증진, 단백질 생성을 유도하고 이는 저온에서의 대장균 성장 및 생존과 관계가 있다는 것이다. 이에 본 논문에서는 CspA의 발현이 저온 및 상온에서 대장균 성장과 재조합 단백질 생산성에 미치는 영향을 조사하였으며, 이로부터 CspA를 이용한 저온에서의 재조합 단백질 생산 효율성 향상에 관한 가능성을 알아보고자 하였다 이를 위해 CspA를 목표 단백질인 Green Fluorescent Protein (GFP)과 동시 발현하는 시스템을 구축, 상온 및 저온에서의 목표 재조합 단백질 생산성 및 대장균 성장 속도에 관하여 살펴보았다.
이에 본 연구에서는 저온에서의 CspA 효과를 알아보기 위하여 대장균에서 일반적으로 CspA의 발현을 유도하는 15 ℃ 에서 CspA 발현이 GFP 생산 균주의 성장 속도 및 단백질 발현 속도에 미치는 영향을 조사하였다. E.
제안 방법
이에 본 연구에서는 저온에서의 CspA 효과를 알아보기 위하여 대장균에서 일반적으로 CspA의 발현을 유도하는 15 ℃ 에서 CspA 발현이 GFP 생산 균주의 성장 속도 및 단백질 발현 속도에 미치는 영향을 조사하였다. E. coli BCG와 E. coli BG를 37 ℃ 에서 OD 0.4까지 성장시킨 후 두 균주를 15℃로 옮겨 배양하였으며, arabinose 와 IPTG를 첨가 CspA와 GFP의 발현을 유도한 후 이후 세포 성장과 총 GFP 발현도 및 활성 GFP 발현도를 측정하였다. Fig.
다음으로 GFP가 20 ℃ 및 25 ℃ 에서 대장균 성장 속도 및 GFP의 발현도에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위한 실험을 수행하였다. E. coli BCG와 E. coli BG를 37℃에서 약 OD 0.4까지 성장시킨 후 두 균주를 25 ℃ 및 20 ℃로 옮겨 배양하였으며, arabinose와 IPTG를 첨가 CspA와 GFP의 발현을 유도한 후 이후 세포 성장과 총 GFP 발현도 및 활성 GFP 발현도를 측정하였다. 25 ℃ 와 20℃ 모두에서 CspA의 발현은 세포 성장 속도, GFP 발현도에 크게 영향을 미치지 않았으며, 활성 GFP의 생산 속도에도 큰 영향을 미치지 않았다(data not shown).
E. coll BCG와 E. coli BG를 37℃ 에서 OD 0.4까지 배양한 후 후 0.1% arabinose와 1 mM IPTG를 첨가 CspA와 GFP의 발현을 유도하였으며, 이후 세포 성장과 총 GFP 발현도 및 활성 GFP 발현도를 측정하였다. 총단백질 발현도는 SDS-PAGE를 이용하여 분석하였으며, 활성 GFP 발현도는 전세포 (whole cell)의 세포당 GFP의 형광도를 측정하여 분석하였다 GFP와 CspA의 발현 유도후 BG와 BCG의 성장 측정 결과, 37℃ 에서의 CspA의 발현은 세포 성장 속도에 크게 영향을 미치지 않았iedata not shown).
1%의 arabinose와 1 mM의 IPTG를 넣고 induction을 시킨 뒤 2시간 간격으로 세포를 수확하였다. GFP 발현을 위한 배양온도는 15℃, 20℃, 25℃, 37℃를 사용하였으며, shaking incubator에서 200 rpm으로 호기적으로 배양하였다. 각 온도에서 CspA의 발현이 세포성장속도 GFP 발현 속도에 미치는 영향을 알아보기 위하여 세포농도측정 SDS-PAGE 분석, GFP 형광도 측정을 수행하였다.
9% NaCl 1 mL로 현탁하여 600 nm에서 OD를 측정하였다. OD 측정값이 0.1-0.2 사이가 되도록 0.9% NaCl 용액을 이용하여 희석한 후 0.2 皿씩 취하여 96 well plate에 각각 분주, Victor Multilabel Counter( 1420-011) (Wallac, Finland)를 이용하여 excitation 파장 485 nm, emission 파장 515 nm에서 형광도 세기를 측정하였다.
i 유전자를 pGlnAp2-gmmut3」(8)로부터 5'-primer(ggattccgtaaa ggagaagaacttttc) 와 3'-primer(gagctcttattatttgtatagttcatccat)-S- 이용, PCR 증폭흐]여 pET24ma의 BamHI, SacI을 이용하여 pET 24ma에 삽입, 제조하였다. pBAD-CspA는 E. coli JM109 의 genomic DNA를 template로 하여 5, -primer(ccatggccggtaaaatgactggt)와 3'-primer(ctctcgttacaggctggttacgttacc)> 이용 212 bp의 cspA gene을 PCR 증하여 pBAD/HisC vector 에 Neo I 와 Xho I의 restriction endonuclease를 이용하여 삽입, 제조하였다
pET24ma-GFP와 pBAD-CspA를 E. coli BL21(DE3)에 도입 GFP와 CspA의 동시 발현 시스템을 구축하였으며 이 균주를 E. coli BCG로 명명 하였다. 대조군으로 pET24ma-GFP와 pBAD/HisC vector를 가진 재조합 균주를 제조, E.
GFP 발현을 위한 배양온도는 15℃, 20℃, 25℃, 37℃를 사용하였으며, shaking incubator에서 200 rpm으로 호기적으로 배양하였다. 각 온도에서 CspA의 발현이 세포성장속도 GFP 발현 속도에 미치는 영향을 알아보기 위하여 세포농도측정 SDS-PAGE 분석, GFP 형광도 측정을 수행하였다.
coli BCG로 명명 하였다. 대조군으로 pET24ma-GFP와 pBAD/HisC vector를 가진 재조합 균주를 제조, E. coli BG로 명명하였다.
먼저 CspA의 대장균 생장 속도 및 단백질 발현 속도에의 영향을 일반적인 재조합 단백질 생산 온도인 37℃에서 살펴보았다. E.
저온 충격 단백질인 CspA의 발현을 위해 CspA 유전자를 BAD promoter 발현 시스템인 pBAD/HisC 에 클로닝, pBAD-CspA를 제조하였다 저온 발현을 위한 재조합 단백질 모델로는 green fluorescent protein (GFP)를 이용하였으며 GFP 유전자를 T7 promoter 발현시스템인 pET24ma에 클로닝 pET24ma-GFP를 제조하였다 pET24ma-GFP는 pl5A replication origin을 pBAD-CspA는 pBR322 replication origin을 가지고 있어 하나의 대장균에서 양립, GFP와 CspA 의 동시 발현이 가능하며, pET24ma-GFP는 IPTG에 의해, pBAD-CspA는 arabinose에 의해 유전자 발현이 제어될 수 있다. pET24ma-GFP와 pBAD-CspA를 E.
1% arabinose와 1 mM IPTG를 첨가 CspA와 GFP의 발현을 유도하였으며, 이후 세포 성장과 총 GFP 발현도 및 활성 GFP 발현도를 측정하였다. 총단백질 발현도는 SDS-PAGE를 이용하여 분석하였으며, 활성 GFP 발현도는 전세포 (whole cell)의 세포당 GFP의 형광도를 측정하여 분석하였다 GFP와 CspA의 발현 유도후 BG와 BCG의 성장 측정 결과, 37℃ 에서의 CspA의 발현은 세포 성장 속도에 크게 영향을 미치지 않았iedata not shown). Fig.
대상 데이터
coli XLl-blue를 사용하였다. pET24ma-GFP는 gfpmuts.i 유전자를 pGlnAp2-gmmut3」(8)로부터 5'-primer(ggattccgtaaa ggagaagaacttttc) 와 3'-primer(gagctcttattatttgtatagttcatccat)-S- 이용, PCR 증폭흐]여 pET24ma의 BamHI, SacI을 이용하여 pET 24ma에 삽입, 제조하였다. pBAD-CspA는 E.
이론/모형
유전자 cloninge Promega 사의 pGEM-T vecor 시스템을 이용하였으며 cloning을 위한 균주로 E. coli XLl-blue를 사용하였다. pET24ma-GFP는 gfpmuts.
성능/효과
20℃, 25℃, 37℃ 에서는 세포 성장 및 GFP의 생산이 CspA의 발현에 영향을 받지 않았으나, 15 ℃ 에서는 GFP의 총 생산성이 CspA의 동시 발현에 의해 향상되었으며 이는 세포 성장 속도의 향상에 기인함을 확인하였다 결론적으로 CspA의 발현은 15 ℃ 에서 세포 당 재조합 단백질 생산량의 증가에는 영향을 미치지 않으나 즉 재조합 단백질의 번역 효율에는 큰 영향을 미치지 않으나, 대장균성장 속도에 영향을 미치며, 이를 통해 재조합 단백질의 총생산량 향상을 유도 할 수 있을 것으로 기대된다.
4까지 성장시킨 후 두 균주를 25 ℃ 및 20 ℃로 옮겨 배양하였으며, arabinose와 IPTG를 첨가 CspA와 GFP의 발현을 유도한 후 이후 세포 성장과 총 GFP 발현도 및 활성 GFP 발현도를 측정하였다. 25 ℃ 와 20℃ 모두에서 CspA의 발현은 세포 성장 속도, GFP 발현도에 크게 영향을 미치지 않았으며, 활성 GFP의 생산 속도에도 큰 영향을 미치지 않았다(data not shown).
이는 CspA의 발현이 15 ℃ 에서 재조합 대장균의 성장 속도에 영향을 미치고 있음을 보여주고 있다. Fig. 2(B)에서 볼 수 있듯이 SDS-PAGE 분석 결과 8시간 이후부터 BCG균주의 GFP 종 발현량이 BG균주보다 약 1.5-2배 정도 많은 양을 보이고 있으며 이는 세포 성장 결과와 일치하는 결과이다. 한편 Fig.
2(A) 에서 볼 수 있듯이 재조합 균주 BCG와 BG는 성장속도에 차이를 보이고 있다. 두 균주 모두 OD 0.4에서 배양을 시작하였으나 20시간 동안 배양한 뒤 OD는 BCG의 경우 약 0.8, BG의 경우 약 0.6으로 더블링 타임이 약 1.5-2배 정도 차이가 나는 것을 확인할 수 있었다. 이는 CspA의 발현이 15 ℃ 에서 재조합 대장균의 성장 속도에 영향을 미치고 있음을 보여주고 있다.
1(A)는 GFP와 CspA의 발현 유도 후 6시간 및 8시간의 총 GFP 발현량을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다. 분석 결과 BG, BCG 두 가지 균주 모두에서 약 27 kDa의 GFP의 과발현이 확인되었으며, 이 결과에서 볼 수 있듯이 CspA의 발현은 GFP 발현 속도에도 큰 영향을 미치지 않았다 이 연구에서 사용한 모델 단백질은 GFP는 단백질 폴딩 (folding)이 완벽하게 이루어 졌을 때 발광하며, 따라서 서]포의 형광도는 활성 GFP의 생산과 관계가 있다
위의 결과들에서 볼 수 있듯이 CspA의 발현은 15 ℃에서는 대장균 성장 속도 증가를 유도하여 GFP의 총 생산속도를 증가 시켰으며, 37℃ 에서는 큰 영향을 미치지 않았다. 다음으로 GFP가 20 ℃ 및 25 ℃ 에서 대장균 성장 속도 및 GFP의 발현도에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위한 실험을 수행하였다.
2(B)에서 볼 수 있듯이 37 ℃ 에서 CspA의 발현이 활성 GFP 생산 속도에 크게 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다. 위의 결과들은 37℃ 에서는 CspA의 발현이 대장균 성장 속도, GFP의 총 생산 속도 GFP의 세포당 생산 속도 및 폴딩에 큰 영향을 주지 않음을 시사하고 있다.
한편 본 실험을 통해 단백질 발현 온도를 감소시킴에 따라 활성 단백질의 생산 속도가 증가함을 다시 한번 확인할 수 있었다. Fig.
활성 GFP의 생산속도를 알아보기 위하여 GFP와 CspA의 발현 유도 후 BG와 BCG의 형광도를 측정하여 활성 단백질의 생산량 속도를 비교하였으며, Fig. 2(B)에서 볼 수 있듯이 37 ℃ 에서 CspA의 발현이 활성 GFP 생산 속도에 크게 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다. 위의 결과들은 37℃ 에서는 CspA의 발현이 대장균 성장 속도, GFP의 총 생산 속도 GFP의 세포당 생산 속도 및 폴딩에 큰 영향을 주지 않음을 시사하고 있다.
참고문헌 (11)
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