[논문]활나물 잎 추출물의 분획별 항산화 활성

김태수; 고상범; 박춘근; 성하정; 강명화

[국내논문] 활나물 잎 추출물의 분획별 항산화 활성
Antioxidant Effects of Crotalaria sessiliflora L. Leaf Extracts Fractionated from Each Solvent 원문보기

東아시아食生活學會誌 = Journal of the East Asian Society of Dietary Life, v.19 no.2, 2009년, pp.180 - 186

김태수 (호서대학교 식품영양학과) , 고상범 (한국화학시험연구원 안전성 평가본부) , 박춘근 (농촌진흥청 국립원예특작과학원) , 성하정 (호서대학교 융합기술연구소) , 강명화 (호서대학교 식품영양학과)

초록
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활나물 잎을 에탄올과 메틸렌 클로라이드 혼합용매(3:1)로 추출하였다. 이중 가장 활성이 높은 유효성분을 추출 및 분리하기 위해서 당과 지방 성분을 제거하고, water와 n-butanol 용매를 1:1 비율로 혼합하여 분획 추출하였다. n-butanol층 은 감압 농축 후, Sephadex LH-20이 충진된 column chromatography를 이용하여 10개(Fr1, Fr2, Fr3, Fr4, Fr5, Fr6, Fr7, Fr8, Fr9, Fr10)의 소 분획물을 얻었다. 분획물의 각종 항산화 활성 결과 Fr1, Fr4, Fr6에서 높은 항산화 활성을 나타내었다(p<0.05). 분획물중 활성이 강한 F1, F4 및 F6에서 미지의 물질을 발견하였으므로 각종 기기분석을 통해 그물질을 동정 중에 있다.

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, Crotalaria sessiliflora L., leaf was extracted with a solvent mixture of $CH_2Cl_2$ and $CH_2OH$ (3:1). In order to draw or separate effective components from the leaf extract with high activity, a 1:1 solvent mixture of water and butanol was used after removal of the sugar and fat from the extract. From the decompressed and concentrated butanol layer, 10 small fractions (Fr1, Fr2, Fr3, Fr4, Fr5, Fr6, Fr7, Fr8, Fr9, and Fr10) were obtained using a chromatography column filled with sephadex LH-20. The activity of each fraction was measured by the same method as that used to measure the antioxidant effect of each part(p<0.05). The Fr1, Fr4, and Fr6 fractions showed the highest activity levels(p<0.05). The vital unknown material that vitality exists in the strong butanol fractions of F1, F4 and F6 will be isolated and identified. Currently, we are performing for a single compound from an unknown peak by instrumental analysis.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

각 부위별 활나물 에탄올 추출물의 항산화 효과와 활나물 부위별 항산화 활성을 비교한 결과 추출수율이 높았던 잎에서 활성도 높게 나타났다(Kang et al 2002, Woo et al 2005). 따라서 본 연구는 자생하고 있는 식물자원의 하나인 활나물을 부위별 항산화 활성을 토대로 활성이 가장 강한 잎 부위를 분획 추출하여 활나물의 분획별 항산화 활성 효과를 규명하고 추출물중 활성이 강한 butanol fraction에 존재하는 미지의 물질을 구조․동정하여 천연물의 항산화 활성과 천연 첨가물로서의 사용 가능성, 기능성 식품 신소재로서 개발의 기초 연구 자료로 제공하고자 한다.

제안 방법

2 mL 가하고 혼합하여 30분 정치하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. Catechin을 이용하여 시료의 페놀성 화합물 정량을 위한 검량선을 작성하였으며, 모든 과정은 3회 반복하였다.
FeSO₄/EDTA 용액, 2-deoxyribose, 각 분획물, phosphate-buffer, H₂O₂를 혼합, 2시간 동안 반응시킨 후 TCA(trichloroacetic acid)용액과 TBA(thiobarbituric acid) 용액을 넣고 15분 가열한 후 급속히 냉각시켜 532 nm에서 흡광도를 측정하여 항산화 활성을 비교하였다(Chung SK 1997).
각 시료의 항산화 활성은 DPPH free radical 소거법에 의한 전자공여능(EDA)으로 측정하였다(Marklund & Marklund 1974). 각 추출 방법에 의하여 추출된 시료는 0.5 mL DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydazyl) 시약 3 mL를 가하고, 실온에서 30분간 방치 후 UV-visible spectrophotometer(Phanrmaca biotech Ultraspec 3000, England)를 이용하여 517 nm에서 측정하였다.
활나물 잎을 에탄올과 메틸렌 클로라이드 혼합용매(3:1)로 추출하였다. 이중 가장 활성이 높은 유효성분을 추출 및 분리하기 위해서 당과 지방 성분을 제거하고, water와 n-butanol 용매를 1:1 비율로 혼합하여 분획 추출하였다. n-butanol층은 감압·농축 후, Sephadex LH-20이 충진된 column chromatography를 이용하여 10개(Fr1, Fr2, Fr3, Fr4, Fr5, Fr6, Fr7, Fr8, Fr9, Fr10)의 소 분획물을 얻었다.
활나물 잎 분획물 추출물의 페놀성 화합물은 Folin-Denis 법(Choi et al 2001)을 일부 변형하여 비색 정량하였다. 즉, 각 시료 0.2 mL에 Na₂CO₃를 2.0 mL 가하고 2분간 실온에 방치하고 50%의 Folin-Denis 시약을 0.2 mL 가하고 혼합하여 30분 정치하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. Catechin을 이용하여 시료의 페놀성 화합물 정량을 위한 검량선을 작성하였으며, 모든 과정은 3회 반복하였다.
활나물 잎 n-butanol 분획물 2 g을 loading하여 chloroform : ethanol(100 : 0 ～ 0 :100)으로 용출한 시료를 UV-vis spectrophotometer에 의해 흡수 파장을 확인하였으며, 같은 파장의 분획물은 하나의 fraction으로 모아서 감압 농축한 후 시료로 사용하였다(Fig. 2).
활나물 잎을 에탄올과 메틸렌 클로라이드 혼합용매(3:1)로 추출하였다. 이중 가장 활성이 높은 유효성분을 추출 및 분리하기 위해서 당과 지방 성분을 제거하고, water와 n-butanol 용매를 1:1 비율로 혼합하여 분획 추출하였다.
와 반응하며, 안정한 complex를 형성하여 이들의 소거 작용을 가지고 있어 지질의 과산화에 대한 항산화제로 잘 알려져 있다. 활나물 추출물로부터 항산화 활성이 높은 정제된 분획물을 동정하기 위해 silica gel을 이용하여 chloroform : ethanol (100 : 0 ～0 :100)로 Fr1～Fr10까지의 물질을 얻어 각 분획별 페놀 함량을 측정하였다.
Korea)를 이용하여 건조 후 각종 실험에 사용하였다. 활성이 높은 잎 추출물에서 유효 성분을 추출 및 분리하기 위해서 당과 지방 성분을 제거하고, water와 n-butanol 용매를 1:1 비율로 혼합하여 분획 추출하였다. n-butanol층은 감압·농축 후, Sephadex LH-20이 충진된 column chromatography를 이용하여 Fr1-Fr10의 소 분획물을 얻었다(Fig.

대상 데이터

n-butanol층은 감압·농축 후, Sephadex LH-20이 충진된 column chromatography를 이용하여 10개(Fr1, Fr2, Fr3, Fr4, Fr5, Fr6, Fr7, Fr8, Fr9, Fr10)의 소 분획물을 얻었다.
본 실험에 사용된 활나물은 농촌진흥청 작물과학원 약용 작물 시험 포장에서 2002년 재배된 것을 수확한 후 잎을 분류하여 세척한 후 그늘에서 자연 건조하여 공시 재료로 각종 분석에 이용하였다. 실험에 사용된 시약은 천연 항산화제로 tocopherol, sesamol(Sigma Co, U.
본 실험에 사용된 활나물은 농촌진흥청 작물과학원 약용 작물 시험 포장에서 2002년 재배된 것을 수확한 후 잎을 분류하여 세척한 후 그늘에서 자연 건조하여 공시 재료로 각종 분석에 이용하였다. 실험에 사용된 시약은 천연 항산화제로 tocopherol, sesamol(Sigma Co, U.S.A)을 각각 사용하였으며, 특급 chloroform, ethanol을 추출 용매로 사용하였다.

데이터처리

Values with different alphabets are significantly different among the groups by Duncan's multiple range test(p<0.05).
통계 분석은 SAS(Statistical Analysis System) 통계 프로그램을 사용하여 분산 분석(ANOVA)을 실시하였고(SAS 2000), 각 시료 간의 유의성 검증은 Duncan's multiple range test를 사용하였다(p<0.05).

이론/모형

Hydroxyl radical(·OH) 소거능은 2-deoxyribose oxidation method에 의해 측정하였다.
각 시료의 항산화 활성은 DPPH free radical 소거법에 의한 전자공여능(EDA)으로 측정하였다(Marklund & Marklund 1974).
일정량의 lecithin을 chloroform에 녹인 후 질소가스를 이용하여 용매를 완전히 제거한 추출물, 2 mM FeSO₄, 2 mM asocorbic acid를 첨가하여 혼합하고 37℃에서 30분간 incubating 후 과산화 지질을 TBARS법(2-thiobarbutric acid relative substance)으로 측정하였다(Muller HE 1985).

성능/효과

DPPH와 활나물 잎 추출물의 분획물을 반응시켜 DPPH scavenger 활성을 측정한 결과(Fig. 4), Fr4(69.15%) > Fr1(31.56%) > Fr10(31.33%) > Fr3(26.96%) > Fr5(25.67%) > Fr8(22.25%) > Fr6(20.73%) > Fr7(19.67%) > Fr9(18.42%) > Fr2(12.88%) > 순으로 Fr4에서 가장 높게 나타났다.
Hydrogen radical 소거활성은 SOD에 의해 생성된 과산화수소를 peroxidase를 첨가하여 물과 산소분자로 환원시켜 최종적으로 산패를 억제시켜주는 능력을 측정하는 것으로 본 실험 결과(Fig. 7), Fr6(63.51%) > Fr5(60.71%) > Fr4(57.82%)> Fr10(54.93%) > Fr3(49.74%) > Fr8(42.60%) > Fr9(42%) > Fr7(41.32%) > Fr2(41.23%) > Fr1(37.58%) 순으로 Fr6 분획물이 대조군인 sesamol(65.73%)보다는 낮은 활성을 나타내었으나, tocopherol(63.26%)과 유사한 hydrogen radical 소거능을 가지고 있음을 확인하였다.
Jang & Han(2002) 등의 한국산 약초 잎에 대한 연구 결과와 Yoo et al (2004)의 포도 부산물 결과와 비교하여 볼 때 활나물 잎 추출물의 분획물이 높은 수준의 hydroxy radical 소거 활성을 보이는 것으로 보아 활나물에는 항산화 활성이 높은 물질이 다량 함유되어 있을 것으로 사료된다.
Superoxide anion의 활성을 억제시킬 수 있는 유사 물질의 활성능을 측정한 결과 silica gel 분획물의 SOD 유사 활성 측정 결과(Fig. 5), Fr4(94.18%) > Fr1(92.79%) > Fr2(87.30%) > Fr8(79.34%) > Fr10(79.33%) > Fr3(78.44%) > Fr5(72.22%) > Fr7(70.93%) > Fr6(65.76%) > Fr9(64.76%) > 순으로 총 페놀 함량과 전자 공여능이 높았던 Fr4에서 높은 SOD 유사 활성을 보였다.
88%) > 순으로 Fr4에서 가장 높게 나타났다. 대조군인 sesamol(39.71%), tocopherol(32.83%)보다 유의적으로 높은 활성을 나타내었다. Kang et al (2007)은 보리잎 차와 녹차 침출액의 DPPH 라디칼 소거능을 비교한 결과 녹차는 50.
76%) > 순으로 총 페놀 함량과 전자 공여능이 높았던 Fr4에서 높은 SOD 유사 활성을 보였다. 대조군인 tocopherol(97.34%)보다는 낮은 활성을 나타내었으나, sesamol(24.26%)보다는 활나물의 모든 분획물이 매우 높게 측정되었다. Kim & Chung (2002)은 녹차 열수 추출물이 85.
분획물의 각종 항산화 활성 결과 Fr1, Fr4, Fr6에서 높은 항산화 활성을 나타내었다(p<0.05).
3%로 팽이버섯, 마늘, 하수오, 오미자, 행인 및 솔 잎 추출물에 비해 높다고 하였다. 이러한 결과와 비교할 때 할 때 활나물 분획물은 아주 높은 전자공여능을 나타냈고, superoxide anion 제거능이 높은 물질을 함유하고 있음을 예상할 수 있다.
페놀성 화합물 측정 결과(Fig. 3), Fr4(2.98 mg/mL) > Fr1(1.34 mg/mL) > Fr5(1.07 mg/mL) > Fr10(1.00 mg/mL) > Fr3 (0.97 mg/mL) > Fr7(0.93 mg/mL) > Fr8(0.91 mg/mL) > Fr6(0.86 mg/mL) > Fr9(0.74 mg/mL) > Fr2(0.68 mg/mL)의 함량을 보였다.
활나물 잎 추출물을 Sephadex LH-20에 의해 분리한 분획물의 hydroxyl radical 소거 활성을 측정한 결과(Fig. 6), Fr6(94.08%) > Fr8(93.99%) > Fr7(93.90%) > Fr10 (93.77%) > Fr9, Fr5(93.70%) > Fr3(93.66%) > Fr2(93.04%) > Fr1(92.97%) > Fr4(92.15%) 순으로 대조군인 tocopherol(94.12%), sesamol(92.19%)과 비교하여 유의적으로 비슷하거나 높은 활성을 나타내었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	활나물는 무엇에 이용되고 있는가?	일년생 초본으로 높이 20～70 cm이고, 표면을 제외한 전체에 긴 갈색 털이 나 있고 황무지의 잡초 밭에서 자생하며, 우리나라 전국에 널리 분포한다(Shin et al 1999). 활나물은 pyrrolizidine alkaloids(PAS)계인 monocrotaline을 생합성하며(Anon R 1975), PAS는 마우스육종 180, 백혈병 L615, Walker 암 256 등의 치료에 외용, 내복 및 주사제로 이용되며, 중국에서는 민간약으로써 피부암, 자궁경부암, 음경암, 유선암, 위암, 간암, 식도암, 폐암, 만성기관지염 등의 치료에 이용되고 있다(Atal & Sawhney 1973, Scbaeffer et al 1989). 활나물에는 monocrotaline이라는 특정 성분이 항암 효과를 나타내는 것으로 알려지면서, monocrotaline 성분의 항암 효과에 대한 연구가 시작되었으나 아직 초기 단계에 불과하다(Lee & Lin 1988).
	활나물에서 무슨 성분이 항암 효과를 나타내는가?	활나물은 pyrrolizidine alkaloids(PAS)계인 monocrotaline을 생합성하며(Anon R 1975), PAS는 마우스육종 180, 백혈병 L615, Walker 암 256 등의 치료에 외용, 내복 및 주사제로 이용되며, 중국에서는 민간약으로써 피부암, 자궁경부암, 음경암, 유선암, 위암, 간암, 식도암, 폐암, 만성기관지염 등의 치료에 이용되고 있다(Atal & Sawhney 1973, Scbaeffer et al 1989). 활나물에는 monocrotaline이라는 특정 성분이 항암 효과를 나타내는 것으로 알려지면서, monocrotaline 성분의 항암 효과에 대한 연구가 시작되었으나 아직 초기 단계에 불과하다(Lee & Lin 1988). 활나물에는 monocrotaline이 전초에 0.
	활나물(Crotalaria sessiliflora L.)은 두과식물인데 이는 종자 발아율이 매우 부진하고 타 작물의 발아를 억제하는 것으로 알려져 자원화하기 어려웠는데 무슨 방법으로 해결되었는가?	4%가 함유되어 있고, 또 다른 alkaloid 계통의 물질이 함유되어 있어 이들 성분들에 의해 다양한 생리활성 효과가 나타난다고 한다(Kang et al 2001). 그러나 활나물은 종자발아율이 매우 부진하고 타 작물의 발아를 억제하는 것으로 알려져 자원화 하기에 상당한 어려움이 있었으나, 최근 활나물 종자의 휴면 타파를 위해 저온 처리 방법, 저온 대체 효과가 있는 것으로 알려진 gibberellin(GA3)이 종자의 수분 상태를 조절하는 KNO3와 경실종자의 종실 연화 처리가 휴면을 타파하여 발아율을 높이는 방법이 개발되어 활나물의 대량 증식이 가능하게 되었다(Kang et al 2001).

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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