선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 또한, 현재 착상 전 돼지배아의 정상적인 발달 과정에서 세포자멸사에 대한 연구가 미비한 실정이다. 따라서 본 실험에서는 돼지 체외수정기법으로 생산된 착상 전 배아의 발달 과정에서 세포자멸사 유도 여부를 관찰하고, 자연발생적 세포자멸사와 actinomycin D를 이용한 인위적 세포자멸사 현상의 특징을 조사하였다. 돼지체외수정의 경우, 다정자수정되는 경우가 많기 때문에, 기본적인 돼지 체외수정의 수정율에 대한 고찰이 우선되어야 한다.
- 세포자멸사 기전 연구를 위하여, 마우스의 경우, 착상 전 배아 단계에서 actinomycin D 처리 또는 heat stress 처리를 통하여 인위적으로 세포자멸사를 유도한 바 있다(Isom 등, 2007; Fabian 등, 2007b). 따라서, 본 연구의 목적은 돼지의 착상 전 배아 단계에서 actinomycin D 처리를 통하여 인위적 세포자멸사 현상을 유도하여 자연적 인 배 아 발달에서 의 세포자멸사 현상과 비교하고자 한다.
- 본 실험에서는 체외수정 기법으로 생산한 정상적인 돼지 배아의 발달 과정에서 발생하는 세포자멸사를 관찰하기 위하여, 자연발생적 세포자멸사와 인위적으로 유도한 세포자멸사의 양상을 조사하였다. 세포자멸사를 유도하기 위해 수정 후22시간째 서로 다른 농도의 actinomycin D 를 처리하였다.
- 본 연구를 통해 정상적인 배아 발달 과정에서의 세포자멸사 현상과 자연발생적 세포자멸사 현상에 대한 비교분석도 세포자멸사의 발생 양상을 분석하는데 목적이 있다. 체외배양7일째, 배반포 형성 결과(Table 3.
제안 방법
- 배양 16시간 이후, 배양한 수정배 아를 수집하여, 옮긴 후 8시간 동안 CO2, 5%, 02 및 5% 배양기에서 추가 배양하였다. 8시간 이후, 3회 세정 후 각 그룹의 수정배아를 NCSU 배지로 옮긴 후 24시간 동안 배양한 후분할율을 검사하였다. 분할율은 그룹별로 1 cell, 2 cell, 4 cell, 8 cell, fragmentation으로 분류하여 2 cell, 4 cell, 8 cell 수를총수로 나누어 계산한다.
- Actinomycin D가 첨가되지 않은 NCSU 배양액과 Actinomycin D가 농도별로 첨가된 5 ng/ml, 50 ng/ml, 500 ng/ml 배양액을 준비하여 처리하였다. 배양 16시간 이후, 배양한 수정배 아를 수집하여, 옮긴 후 8시간 동안 CO2, 5%, 02 및 5% 배양기에서 추가 배양하였다.
- 도축장 유래의 미경산돼지의 난소를 채취하였으며, 멸균 생리식염수로 난소를 3회 세정한 후 난소의 피질에 존재하는 직경 3-8 mm의 난포로부터 18-guage 주사침이 연결된 주사기를 이용하여 난포액 및 미성숙 난모세포를 채취하였다. 세 층 이상의 난구세포와 결합된 난모세포만을 선별하여 체외성숙에 사용하였다.
- 0%)이 다른 처리군에 비하여 평균값이 낮음을 보였다. 따라서, 인위적 세포자멸사 유도 분석을 위하여, 500 ng/ml actinomycin D 처리군에서의 TUNEL 분석을 시도하였다(Fig. 1과 Table3).
- 배반포에서 세포자멸사 발현 정도를 검사하기 위한 전처리로 각 배반포를 0.1% BSA가 함유된 PBS로 3회 세정하였다. 상온에서 돼지 체외수정 배아를 3.
- D가 농도별로 첨가된 5 ng/ml, 50 ng/ml, 500 ng/ml 배양액을 준비하여 처리하였다. 배양 16시간 이후, 배양한 수정배 아를 수집하여, 옮긴 후 8시간 동안 CO2, 5%, 02 및 5% 배양기에서 추가 배양하였다. 8시간 이후, 3회 세정 후 각 그룹의 수정배아를 NCSU 배지로 옮긴 후 24시간 동안 배양한 후분할율을 검사하였다.
- 8시간 이후, 3회 세정 후 각 그룹의 수정배아를 NCSU 배지로 옮긴 후 24시간 동안 배양한 후분할율을 검사하였다. 분할율은 그룹별로 1 cell, 2 cell, 4 cell, 8 cell, fragmentation으로 분류하여 2 cell, 4 cell, 8 cell 수를총수로 나누어 계산한다. 체외배양 후 4일째에는 각 그룹에 FBS를 3 ul씩 첨가하였다.
- 1%(w/v) hya- luronidase으로 난구세포를 제거한 난모세포 중 제1극체가 보이는 성숙 난모세포를 선별하여 체외수정에 사용하였다. 사전처리된 정자를 50 ul인 수정-배양액 미소적에 20개의 난자를 넣고 39℃, 5% CO2 인큐베이터에서 6시간 동안 체외수정 하였다. 체외배양 배지는 North Carolina State University-23 (NCSU-23) 배지를 사용하였다.
- 1% BSA가 함유된 PBS로 3회 세정하였다. 상온에서 돼지 체외수정 배아를 3.7% paraformaldehyde(DC chemical CO. 010817) 포함된 PBS에서 30분간 고정처리 하였다. 배반포에서 세포자멸사 발현 정도는 TUNEL assay(insitu cell death detection kit, TMR red, Roche, 12156792910)를이용하여 분석하였다.
- 세 층 이상의 난구세포와 결합된 난모세포만을 선별하여 체외성숙에 사용하였다. 체외성숙배양 배지는 TCM199에 10%(v/v)돼지 난포액 (porcine follicular fluid, pFF), 15 ng/ml EGF, 5 lU/ml eCG, 5 lU/ml hCG, 0.
- 양상을 조사하였다. 세포자멸사를 유도하기 위해 수정 후22시간째 서로 다른 농도의 actinomycin D 를 처리하였다. 2일째 분할율과 7일째 배반포 형성율을 각각 관찰한 결과, 2일째에 500 ng/ml actinomycin D 처 리군이 다른 처 리군보다 분할율이 유의적으로 낮음을 보였다.
- 1C). 자연 상태에서 유발되는 세포자멸사의 양상과 비교하기 위하여, 착상 전 배아 발달 단계중 1세포기와 2세포기로 분화하는 초기 단계가 외부 자극에 민감하게 영향을 받을 것으로 사료되어, 수정 후 22시간째 8시간 동안 actionomycin D를 처리하였다. 수정 후 48시간째 분할율을 관찰한 결과, 500 ng/ml actinomycin D 처리군에서 분할율이 유의적으로 낮았는데, 이는 2세포기, 4세포기 및 8세포기로 분화한 배아들의 비율이 낮고, DNA 분열의 빈도가 증가하였음을 의미한다.
- 분할율은 그룹별로 1 cell, 2 cell, 4 cell, 8 cell, fragmentation으로 분류하여 2 cell, 4 cell, 8 cell 수를총수로 나누어 계산한다. 체외배양 후 4일째에는 각 그룹에 FBS를 3 ul씩 첨가하였다. 체외배양 7일째에는 배반포의 수를 총수로 나누어 배반포 형성율을 계산하였다.
- 세 층 이상의 난구세포와 결합된 난모세포만을 선별하여 체외성숙에 사용하였다. 체외성숙배양 배지는 TCM199에 10%(v/v)돼지 난포액 (porcine follicular fluid, pFF), 15 ng/ml EGF, 5 lU/ml eCG, 5 lU/ml hCG, 0.57 mM cysteine, 0.91 mM sodium pyruvate, 26.2 mM sodium bicarbonate 및 0.075 mg/mlkanamycin을 첨가하여 사용하였다. 성숙배양 배지 0.
대상 데이터
- 최종 정자 농도가 2><10' sperm/ml가 되도록 2 mM caffeine이 첨가된 mTBM으로 재부유하였다. 0.1%(w/v) hya- luronidase으로 난구세포를 제거한 난모세포 중 제1극체가 보이는 성숙 난모세포를 선별하여 체외수정에 사용하였다. 사전처리된 정자를 50 ul인 수정-배양액 미소적에 20개의 난자를 넣고 39℃, 5% CO2 인큐베이터에서 6시간 동안 체외수정 하였다.
- 사전처리된 정자를 50 ul인 수정-배양액 미소적에 20개의 난자를 넣고 39℃, 5% CO2 인큐베이터에서 6시간 동안 체외수정 하였다. 체외배양 배지는 North Carolina State University-23 (NCSU-23) 배지를 사용하였다. 체외수정 종료 후 25 ul 용량의 배 양액 미소적에 수정배 아 10개씩 넣어 5% CO2, 5% O2 및 .
데이터처리
- 본 연구의 각 실험군별 분할율, 배반포 형성율 및 세포자멸사 빈도율을 SPSS program의 ANOVA를 이용하여 통계학적 유의성(p<0.05)을 검정하였다.
이론/모형
- 010817) 포함된 PBS에서 30분간 고정처리 하였다. 배반포에서 세포자멸사 발현 정도는 TUNEL assay(insitu cell death detection kit, TMR red, Roche, 12156792910)를이용하여 분석하였다.
성능/효과
- 7일째 배반포 형성율에서는 500 ng/ml actinomycin D 처리군이 다른 처리군에 비하여, 배반포형성율이 저조한 결과로 평가되었다. 2 세포기, 4 세포기, 8 세포기 및 배반포 단계에서의 세포자멸사를 평가하기 위해 TUNEL assay을 시행하였으며, 0 ng/ml 처리군의 배반포에서도 최소한 하나 이상의 세포자멸사 세포를 보임으로 세포자멸사는 착상 전 배아의 단계에서 나타나는 정상적인 과정으로 이해할 수 있었다. 또한, 500 ng/ml actinomycin D 처리군의 배반포는 세포수의 감소와 세포자멸사 비율이 증가하였다.
- 세포자멸사를 유도하기 위해 수정 후22시간째 서로 다른 농도의 actinomycin D 를 처리하였다. 2일째 분할율과 7일째 배반포 형성율을 각각 관찰한 결과, 2일째에 500 ng/ml actinomycin D 처 리군이 다른 처 리군보다 분할율이 유의적으로 낮음을 보였다. 7일째 배반포 형성율에서는 500 ng/ml actinomycin D 처리군이 다른 처리군에 비하여, 배반포형성율이 저조한 결과로 평가되었다.
- 2일째 분할율과 7일째 배반포 형성율을 각각 관찰한 결과, 2일째에 500 ng/ml actinomycin D 처 리군이 다른 처 리군보다 분할율이 유의적으로 낮음을 보였다. 7일째 배반포 형성율에서는 500 ng/ml actinomycin D 처리군이 다른 처리군에 비하여, 배반포형성율이 저조한 결과로 평가되었다. 2 세포기, 4 세포기, 8 세포기 및 배반포 단계에서의 세포자멸사를 평가하기 위해 TUNEL assay을 시행하였으며, 0 ng/ml 처리군의 배반포에서도 최소한 하나 이상의 세포자멸사 세포를 보임으로 세포자멸사는 착상 전 배아의 단계에서 나타나는 정상적인 과정으로 이해할 수 있었다.
- 돼지체외수정의 경우, 다정자수정되는 경우가 많기 때문에, 기본적인 돼지 체외수정의 수정율에 대한 고찰이 우선되어야 한다. 따라서, 본 실험에 수행된 돼지체외수정의 수정 및 전핵형성 결과로서, 총수정율은 72.1%이며, 그 중 정상 수정유2PN)은 59%이며, 다정자수정율(3PN과 4PN)은 41%의 결과를 보였다(Table 1). 이러한 결과는 다른 연구자의 돼지체외수정배아의 수정율 보고 (Yamanaka 등, 2009)와 동일한 결과로서, 본 실험의 비교군으.
- 2 세포기, 4 세포기, 8 세포기 및 배반포 단계에서의 세포자멸사를 평가하기 위해 TUNEL assay을 시행하였으며, 0 ng/ml 처리군의 배반포에서도 최소한 하나 이상의 세포자멸사 세포를 보임으로 세포자멸사는 착상 전 배아의 단계에서 나타나는 정상적인 과정으로 이해할 수 있었다. 또한, 500 ng/ml actinomycin D 처리군의 배반포는 세포수의 감소와 세포자멸사 비율이 증가하였다. 위의 결과를 종합하여 보면 체외수정 기법으로 생산된 돼지 배아의 착상 전 발달 단계에서 세포자멸사는 정상적으로 발생하는 과정 중 하나이며, actinomycin D는 세포자멸사 현상을 연구하기 위한 유용한 도구임을 시사한다.
- 수정 후 48시간째 분할율을 관찰한 결과, 500 ng/ml actinomycin D 처리군에서 분할율이 유의적으로 낮았는데, 이는 2세포기, 4세포기 및 8세포기로 분화한 배아들의 비율이 낮고, DNA 분열의 빈도가 증가하였음을 의미한다. 수정 후 168시간째, 배반포 형성율을관찰한 결과, 4개의 그룹 간에 유의차는 없었지만, 500 ng/ml actinomycin D 처리군의 배반포의 형성 비율이 다른 처리 군에 비해 낮았다. TUNEL assay는 0 ng/ml actinomycin D 처리 군과 500 ng/ml actinomycin D 처리군의 2세포기, 4세포기, 8세포기 및 배반포 단계에서 실시하였으며, 2세포기, 4세포기 및 8세포기에서는 두 처리군, 모두 세포자멸사가 일어난 세포들이 관찰되지 않았다.
- 자연 상태에서 유발되는 세포자멸사의 양상과 비교하기 위하여, 착상 전 배아 발달 단계중 1세포기와 2세포기로 분화하는 초기 단계가 외부 자극에 민감하게 영향을 받을 것으로 사료되어, 수정 후 22시간째 8시간 동안 actionomycin D를 처리하였다. 수정 후 48시간째 분할율을 관찰한 결과, 500 ng/ml actinomycin D 처리군에서 분할율이 유의적으로 낮았는데, 이는 2세포기, 4세포기 및 8세포기로 분화한 배아들의 비율이 낮고, DNA 분열의 빈도가 증가하였음을 의미한다. 수정 후 168시간째, 배반포 형성율을관찰한 결과, 4개의 그룹 간에 유의차는 없었지만, 500 ng/ml actinomycin D 처리군의 배반포의 형성 비율이 다른 처리 군에 비해 낮았다.
- 또한, 500 ng/ml actinomycin D 처리군의 배반포는 세포수의 감소와 세포자멸사 비율이 증가하였다. 위의 결과를 종합하여 보면 체외수정 기법으로 생산된 돼지 배아의 착상 전 발달 단계에서 세포자멸사는 정상적으로 발생하는 과정 중 하나이며, actinomycin D는 세포자멸사 현상을 연구하기 위한 유용한 도구임을 시사한다.
- 위의 결과를 종합해 보면 actinomycin D는 돼지의 초기 배아 발달 과정에서 인위적으로 세포자멸사를 유발할 수 있으며, 배아의 분할이 정상적으로 일어나는 것을 방해하고 배반포 단계까지 발달하여도, 세포자멸사가 유발된 세포들이 보다 많이 포함되어, 착상 전 배아의 발달 단계에서의 세포자멸사 연구 모델로 가능함을 시사한다. 앞으로 보다 심도있는 세포자멸사 연구를 수행하기 위해서는 우수한 난자의 수를 보다 많이 확보하여 통계적 분석이 용이하도록 해야 하며, 더 나아가서는 세포자멸사의 발생 기전 관련 기초 기전 연구를 진행하여야 할 것이다.
- 이러한 기전으로, 마우스 및 소의 착상 전 배아에서 세포자멸사를 인위적으로 유도한 바 있다(Pivko 등, 2002; Fabian 등, 2007a). 인위적 세포자멸사 유도 실험을 위하여 actinomycin D가 첨가되지 않은 NCSU 배 양액과 actinomycin D가 농도별로 첨가된 5 ng/ml, 50 ng/ml 및 500 ng/ ml을 각 처리한 결과, 체외배양 48시간째, 500 ng/ml actinomycin D 처리군의 배아 분할율(27.8%)이 다른 처리군에 비하여 유의적(p<0.05)으로 낮은 결과를 보였다(Table 2). 체외배양 7일째, 배반포 형성율에서는 유의적 차이는 없었으나,500 ng/ml actinomycin D 처 리군에서의 배 반포 형성율(8.
- 05)으로 낮은 결과를 보였다(Table 2). 체외배양 7일째, 배반포 형성율에서는 유의적 차이는 없었으나,500 ng/ml actinomycin D 처 리군에서의 배 반포 형성율(8.0%)이 다른 처리군에 비하여 평균값이 낮음을 보였다. 따라서, 인위적 세포자멸사 유도 분석을 위하여, 500 ng/ml actinomycin D 처리군에서의 TUNEL 분석을 시도하였다(Fig.
- 발생 양상을 분석하는데 목적이 있다. 체외배양7일째, 배반포 형성 결과(Table 3.), 500 ng/ml actinomycin D처리군이 0 ng/ml 처리군보다 전체 세포수는 현저하게 적었고 세포자멸사 세포수는 비교적으로 증가하여 전체적으로 세포자멸사 비율이 높았다. 착상 전 배아 발달과정 중, 자연발생적으로 나타나는 세포자멸사는 배반포에서 쉽게 관찰할 수 있었으며 , 배 반포에서는 내세포괴로부터 영 양막세포를 포함하고 있는 일부 비정상적 세포를 제 거하는 과정 이 일어나므로TUNEL assay를 통해 세포자멸사를 관찰할 수 있었다(Pierce 등, 1989).
- 하나의 배반포에서 최소 하나의 세포자멸사 세포가 발견되었으며, 세포자멸성 할구에서는 핵이 분할되고 수축된 형태로, 핵막에서는 DNA가 분해된 물질들의 존재를 TUNEL assay를 통해 확인할 수 있었다(Fig. 1C). 자연 상태에서 유발되는 세포자멸사의 양상과 비교하기 위하여, 착상 전 배아 발달 단계중 1세포기와 2세포기로 분화하는 초기 단계가 외부 자극에 민감하게 영향을 받을 것으로 사료되어, 수정 후 22시간째 8시간 동안 actionomycin D를 처리하였다.
후속연구
- 모델로 가능함을 시사한다. 앞으로 보다 심도있는 세포자멸사 연구를 수행하기 위해서는 우수한 난자의 수를 보다 많이 확보하여 통계적 분석이 용이하도록 해야 하며, 더 나아가서는 세포자멸사의 발생 기전 관련 기초 기전 연구를 진행하여야 할 것이다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.