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문제 정의
- 본 연구는 고지방식이에 의해 유도된 비만 마우스를 이용하여 회향종자 물 추출물을 급여한 후 체중, 간과 부고환 지방조직 무게, 혈중 지질 함량, 부고환 지방세포 크기 및 지방대사 관련 효소 활성의 변화를 측정하여 항비만 기능성 소재로서의 가능성 여부를 조사하였다. 실험군은 일반식이군(ND), 고지방식이만을 섭취한 군(HFD), 고지방식이＋0.
제안 방법
- , Seoul, Korea) 수컷 32마리를 일주일간 적응시킨 후 일반식이군(normal diet, ND)을 제외하고 모두 고지방식이를 5주동안 섭취시켜 비만을 유도하였다. 5주후 난괴법에 의거하여 세 군으로 분류하였다. 즉 고지방식이만을 섭취한 군(high fat diet, HFD), 고지방식이에 orlistat 0.
- Positive control로 사용한 orlistat는 Xenical®(Roche Pharma Ltd., Reinach, Switzerland)이라는 의약품 한 캡슐을 개봉하여 고지방식이 1 kg에 0.5 g, 즉 0.05%가 되도록 혼합하였으며, 회향종자 추출물은 선행 연구된 한약재 추출물들의 농도와 용매를 고려하여 0.5%가 되도록 혼합 제조하였다(11,19,20).
- Reagent A(100 mM sodium phosphate buffer with 150 mM sodium chloride, 0.5% Triton X-100, pH 7.2) 900 μL 넣고 분획하여 얻은 LPL 효소용액 100 μL와 reagent C[50 mM p-nitrophenyl butyrate (PNPB) in reagent B] 10 μL로 발색시켜 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 균질액을 600 × g(MF600, Hanil, Seoul, Korea)에서 10분간 원심분리 하여 상등액을 취한 뒤 다시 8,000×g(JA-20, Beckman, Brea, CA, USA)에서 10분 동안 원심분리 하여 침전물을 제거한 후 상등액을 105,000 × g(70Ti, Beckman)에서 70분간 원심분리 하여 상등액을 취하여 사용하였다.
- 따라서 본 연구에서는 고지방식이로 비만이 유도된 C57BL/6J mice를 이용하여 회향종자 물 추출물을 급여한 후 체중, 간 및 부고환 지방함량, 혈중 지질 함량을 측정하였고, 부고환 지방세포의 크기 및 지방세포내로 지방산의 유입을 억제하는 효소 활성과 지방의 이용을 자극하는 효소 활성의 변화를 측정하여 항비만 기능성 소재로서의 가능성 여부를 조사하였다.
- 본 연구는 고지방식이에 의해 유도된 비만 마우스를 이용하여 회향종자 물 추출물을 급여한 후 체중, 간과 부고환 지방조직 무게, 혈중 지질 함량, 부고환 지방세포 크기 및 지방대사 관련 효소 활성의 변화를 측정하여 항비만 기능성 소재로서의 가능성 여부를 조사하였다. 실험군은 일반식이군(ND), 고지방식이만을 섭취한 군(HFD), 고지방식이＋0.05% orlistat군(HFDO), 고지방식이＋0.5% 회향종자 물 추출물 섭취군(HFDF)으로 분류하였다. 고지방식이만을 섭취한 군은 일반식이군과 비교하여 체중, 간 무게, 부고환 지방조직 무게, 혈장 지질 및 혈당 농도가 현저하게 증가하였다.
- 실험기간 동안 음수와 식이는 자유롭게 섭취하도록 하였고 체중과 식이섭취량은 3일 간격으로 측정하였으며, 사육장 온도는 21 ± 2℃, 습도 50 ± 10%에서 12시간 주기로 명암 조절하였다.
- 실험동물을 안락사 시킨 후 복부를 절개하여 간 조직 및 부고환 지방을 적출하여 생리식염수를 이용하여 혈액 및 이물질을 제거하여 무게를 측정하였으며, 부고환 지방조직 세포의 크기는 Seo 등(22)의 방법과 같이 부고환 지방조직을 일정 크기로 잘라 10% 포르말린으로 48시간 동안 고정하여 동결절편기로 18 μm으로 절편한 후 oil-red-o 지방 염색방법으로 지방세포를 염색하였다.
- 실험동물을 안락사 시킨 후 복부를 절개하여 간 조직 및 부고환 지방을 적출하여 생리식염수를 이용하여 혈액 및 이물질을 제거하여 무게를 측정하였으며, 부고환 지방조직 세포의 크기는 Seo 등(22)의 방법과 같이 부고환 지방조직을 일정 크기로 잘라 10% 포르말린으로 48시간 동안 고정하여 동결절편기로 18 μm으로 절편한 후 oil-red-o 지방 염색방법으로 지방세포를 염색하였다. 염색 후 60% 이소프로판올을 이용하여 탈색한 뒤 현미경(LHS-H100P-1, Nikon, Tokyo, Japan)에서 디지털카메라(E990, Nikon)를 이용하여 이미지를 측정하였다. 지방세포의 크기 분석을 위해 Fluor Chem 8900 image analysis program(Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA)을 이용하여 지방세포의 직경을 상대적 수치로 측정하였다.
- 7배 증류수를 가하고 60℃에서 24시간 동안 교반하면서 유효성분을 추출하였다. 이를 실온에서 방냉하고 여과한 다음 감압농축기(SB-1000, EYELA, Tokyo, Japan)로 농축하였고, 동결건조기(FD 8508, IlShin, Yangju, Korea)를 이용하여 11.48% 수율의 분말시료를 획득하였으며 -70℃에서 냉동보관하면서 적당한 농도로 희석하여 사용하였다.
- 5주후 난괴법에 의거하여 세 군으로 분류하였다. 즉 고지방식이만을 섭취한 군(high fat diet, HFD), 고지방식이에 orlistat 0.05%를 혼합하여 섭취한 군(HFDO), 고지방식이에 회향종자 물 추출물을 동결건조 하여 만든 분말을 0.5%를 투여한 군(HFDF)으로 분류하여 6주 동안 실험을 진행하였다.
- 염색 후 60% 이소프로판올을 이용하여 탈색한 뒤 현미경(LHS-H100P-1, Nikon, Tokyo, Japan)에서 디지털카메라(E990, Nikon)를 이용하여 이미지를 측정하였다. 지방세포의 크기 분석을 위해 Fluor Chem 8900 image analysis program(Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA)을 이용하여 지방세포의 직경을 상대적 수치로 측정하였다.
- 혈액은 실험이 종료되는 6주에 절식, 마취 후 심장 채혈하였다. 채혈된 혈액은 4℃에서 10,000 rpm으로 10분 동안 원심분리 하여 혈장을 얻어 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, 중성지방, 혈당 농도를 상업용 키트(Asanpharm, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다. LDL-콜레스테롤은 Friedewald 등(21)의 방법으로 다음과 같이 계산하였다.
대상 데이터
- 이러한 비만을 해결하기 위하여 비만 치료제의 개발과 연구는 계속되고 있지만 인공적으로 합성된 항비만 약물들은 대부분 부작용을 가지고 있으며 아직까지 부작용이 없는 완전한 치료제는 시판 되지 않고 있다(4,5). 본 연구에서 positive control로 사용된 orlistat의 화학식은 1-(3-hexyl-4-oxo-oxetan-2-yl)tride-can-2-yl2-formylamino-4-methyl-pentanoate로서 분자식은 C29H53N5이다. Orlistat는 Xenical(R)이라는 상품명으로 시판되는 장관 내 lipase 저해제로서 위장과 소장의 관강 내에서 위와 췌장의 지방분해효소의 활성부위인 serine과의 공유결합을 형성하여 lipase를 불활성화시킴으로써 항비만 약제 기능을 하는 것으로 알려져 있으며, 부작용은 주로 지방변과 같은 소화기계 증상이 나타난다(6).
- 실험동물은 7주령의 C57BL/6J(Central Lab. Animal Inc., Seoul, Korea) 수컷 32마리를 일주일간 적응시킨 후 일반식이군(normal diet, ND)을 제외하고 모두 고지방식이를 5주동안 섭취시켜 비만을 유도하였다. 5주후 난괴법에 의거하여 세 군으로 분류하였다.
- 회향종자는 2009년 6월 춘천시 소재의 건재상에서 구입하여 냉장보관하면서 사용하였다. 시료의 추출은 Choe 등(18) 의 방법에 따라 양질의 것을 엄선하고 완전히 건조하여 분쇄한 후 무게 당 10.
데이터처리
- Means with different letters differ significantly from each other (p<0.05), as determined by Duncan's multiple range test.
- Values with different letters within a column are significantly different from each other at α=0.05 as determined by Duncan's multiple range test.
- 분석 결과는 평균값과 표준편차로 표기하였고, 통계처리는 SPSS(Version 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 one-way ANOVA 분석을 실시한 후 Duncan's multiple range test로 유의성(p<0.05)을 검증하였다.
이론/모형
- ACS 효소의 활성측정은 Shimizu 등(27)의 방법으로 측정하였다. E-tube에 reagent A(200 mM Tris buffer with 20 mM MgCl2, 2 mM EDTA, 0.
- 채혈된 혈액은 4℃에서 10,000 rpm으로 10분 동안 원심분리 하여 혈장을 얻어 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, 중성지방, 혈당 농도를 상업용 키트(Asanpharm, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다. LDL-콜레스테롤은 Friedewald 등(21)의 방법으로 다음과 같이 계산하였다.
- LPL 효소의 활성 측정은 Quinn 등(25)과 Shirai와 Jackson (26)의 방법으로 측정하였다. Reagent A(100 mM sodium phosphate buffer with 150 mM sodium chloride, 0.
- 회향종자는 2009년 6월 춘천시 소재의 건재상에서 구입하여 냉장보관하면서 사용하였다. 시료의 추출은 Choe 등(18) 의 방법에 따라 양질의 것을 엄선하고 완전히 건조하여 분쇄한 후 무게 당 10.7배 증류수를 가하고 60℃에서 24시간 동안 교반하면서 유효성분을 추출하였다. 이를 실온에서 방냉하고 여과한 다음 감압농축기(SB-1000, EYELA, Tokyo, Japan)로 농축하였고, 동결건조기(FD 8508, IlShin, Yangju, Korea)를 이용하여 11.
성능/효과
- ACS 활성은 HFD군(0.09 ± 0.01 Units/mg protein)과 비교하여 ND군 330.99%, HFDO군 232.14%, 회향종자 물 추출물을 섭취한 HFDF군은 187.39%로 모든 군에서 유의적으로 현저히 증가하였다.
- LPL 활성은 HFD군 1140.12±14.72 units/mg protein과 비교하여 ND군은 27.27%, HFDO군은 44.12%, 회향종자 물 추출물을 섭취한 HFDF군은 33.41%로 유의적으로 억제되었다.
- 56% 체중 감소를 나타내었다. 간 무게는 HFD군과 비교하여 고지방식이와 함께 orlistat 섭취는 32.93%, 회향종자 물 추출물은 22.56% 유의적으로 감소시켰다. 부고환 지방 무게는 고지방식이군 1.
- 39%로 현저하게 증가하였다. 결과적으로 회향종자 물 추출물 섭취는 체중 증가, 지방세포 형성및 지방세포 크기, LPL 효소의 활성을 저해하고, ACS 효소의 활성을 증가시킴으로써 항비만 효과가 있을 것으로 사료된다.
- 부고환 지방조직의 지방세포 크기가 고지방식이만을 섭취한 HFD군에서 일반 식이를 섭취한 ND군과 비교하여 현저히 증가하였고, 고지방식이에 의한 지방세포 크기 증가는 orlistat와 회향종자 물 추출물 섭취에 의해 억제되었다. 고지방식이군의 지방세포 크기가 1.0배일 때 orlistat를 섭취한 HFDO군과 회향종자 물 추출물을 섭취한 HFDF군의 지방 세포 크기는 고지방식이군의 지방세포 크기의 0.42배와 0.21배로 감소하였다. 이는 고지방식이의 섭취가 지방세포의 중성지방의 축적을 증가시켰음을 의미하며, 회향종자 물 추출물 섭취가 이러한 중성지방의 축적을 억제한 것으로 사료된다.
- 5% 회향종자 물 추출물 섭취군(HFDF)으로 분류하였다. 고지방식이만을 섭취한 군은 일반식이군과 비교하여 체중, 간 무게, 부고환 지방조직 무게, 혈장 지질 및 혈당 농도가 현저하게 증가하였다. 회향 종자 물 추출물을 함유하고 있는 식이는 고지방식이만을 섭취한 군과 비교하여 체중 26.
- 체중 변화량은 실험 시작부터 종결까지의 무게 변화량을 총 식이섭취량으로 나누어 나타내었다. 그 결과 고지방식이만을 섭취한 HFD군과 비교하여 모든 군에서 유의적으로 감소하였다. 항비만 치료제인 orlistat 섭취군 (HFDO)은 회향종자 물 추출물 섭취군(HFDF)과 일반식이 섭취군(ND)보다 더 체중이 감소되었고 HFDF군은 HFD과 비교하여 26.
- 그 결과 항비만 의약품인 orlistat를 섭취한 HFDO군에서 0.30±0.03 mg/dL로 가장 낮은 HDL-콜레스테롤 비율을 나타내었으며 LDL-콜레스테롤 함량 또한 HFD군 93.16 ± 5.08 mg/dL와 비교하여 11.76% 증가한 104.11±4.79 mg/dL를 나타내었다.
- 글루코오스 함량은 회향종자를 섭취한 HFDF군 (231.32 ± 10.43 mg/dL)은 HFD군(277.31 ± 13.42 mg/dL)에비해 16.58% 감소한 결과를 나타내었다.
- Lee 등(29)의 고지방식이를 급여한 흰쥐에게 브로콜리 싹 에탄올 추출물을 병합 투여한 경우 부고환 지방조직 중의 LPL 활성은 고지방식이군에 비하여 감소하였고, 추출물을 고용량 투여한 군에서 유의한 감소효과를 보여 정상식이군과 활성이 비슷한 수준이었다는 결과는 본 연구와 일치하는 경향을 보였다. 따라서 본 연구 결과 회향종자 물 추출물을 섭취하면 LPL 활성은 일반 식이를 섭취한 군과 유사한 활성을 나타내어 비만을 개선할 수 있을 것이라 사료된다.
- 이로써 회향종자물 추출물 섭취는 비만에 의해 유발되는 심혈관계 질환의 위험성을 줄여 줄 것으로 추정된다. 또한 부고환 지방세포 크기는 고지방식이만을 섭취한 군에서 일반식이군과 비교하여 현저히 증가하였고, 고지방식이에 의한 지방세포 크기 증가는 orlistat와 회향종자 물 추출물 섭취에 의해 억제되었다. 지방세포내로 지방산의 유입을 억제하는 LPD 효소 활성은 고지방식이만을 섭취한 군과 비교하여 일반식이군은 27.
- 본 연구에서 회향종자 섭취군은 고지방식이 섭취군에 비해 16.58% 낮은 혈당 수치를 보였다. 한편 Park 등(38)은 백강잠, 산약, 쥐눈이콩, 청국장가루로 구성된 생약복합제를 고지방식이로 대사성 증후군을 유발시킨 동물모델에게 섭취시킨 결과 각종 생약제로부터 유래된 화합물들이 여러가지 혈당을 조절하는 메커니즘 중에서 α-glucosidase 및 PTP1β(protein tyrosinase phosphatase)의 억제 효능이 여러 가지 원인 중에 하나로 작용하여 대사성증후군 및 당뇨병 환자들에게 도움을 줄 수 있다는 것을 확인하였다.
- 1과 같다. 부고환 지방조직의 지방세포 크기가 고지방식이만을 섭취한 HFD군에서 일반 식이를 섭취한 ND군과 비교하여 현저히 증가하였고, 고지방식이에 의한 지방세포 크기 증가는 orlistat와 회향종자 물 추출물 섭취에 의해 억제되었다. 고지방식이군의 지방세포 크기가 1.
- 또한 부고환 지방세포 크기는 고지방식이만을 섭취한 군에서 일반식이군과 비교하여 현저히 증가하였고, 고지방식이에 의한 지방세포 크기 증가는 orlistat와 회향종자 물 추출물 섭취에 의해 억제되었다. 지방세포내로 지방산의 유입을 억제하는 LPD 효소 활성은 고지방식이만을 섭취한 군과 비교하여 일반식이군은 27.27%, orlistat 섭취군은 44.12%, 회향종자 물 추출물 섭취군은 33.41%로 억제되었으며, 지방이용을 자극하는 ACS 효소 활성은 일반식이군 330.99%, HFDO군 232.14%, 회향종자 물 추출물 섭취군 187.39%로 현저하게 증가하였다. 결과적으로 회향종자 물 추출물 섭취는 체중 증가, 지방세포 형성및 지방세포 크기, LPL 효소의 활성을 저해하고, ACS 효소의 활성을 증가시킴으로써 항비만 효과가 있을 것으로 사료된다.
- 총콜레스테롤은 고지방식이군(HFD, 170.88±5.64 mg/dL)에서 가장 높게 나타났으며, 고지방식이에 orlistat 섭취군(HFDO, 158.15±5.26 mg/dL)과 고지방식이에 회향종자 물 추출물 섭취군 (HFDF, 161.88±6.40 mg/dL)에서 약간 감소하였으나 유의성은 없었다.
- 그 결과 고지방식이만을 섭취한 HFD군과 비교하여 모든 군에서 유의적으로 감소하였다. 항비만 치료제인 orlistat 섭취군 (HFDO)은 회향종자 물 추출물 섭취군(HFDF)과 일반식이 섭취군(ND)보다 더 체중이 감소되었고 HFDF군은 HFD과 비교하여 26.56% 체중 감소를 나타내었다. 간 무게는 HFD군과 비교하여 고지방식이와 함께 orlistat 섭취는 32.
- 혈장 중성지방 함량은 HFD군의 56.00±3.89 mg/dL와 비교하여 다른 세군에서 모두 유의적으로 감소하였으며, 회향종자 물 추출물 섭취군은 44.30±0.97 mg/dL로 HFD군에 비해 20.89% 감소하였다.
후속연구
- 지방세포 크기의 측정은 항비만 효능을 입증할 수 있는 효과적인 방법으로 잘 알려져 있다(36). 따라서 지방세포의 조직학적 실험 결과는 본 실험에 사용된 회향종자 물 추출물이 새로운 천연 소재로의 개발이 가능할 것으로 사료된다.
- 회향종자 물 추출물 섭취에 의해 체중 감소, 간 무게 감소 및 부고환 지방 조직량 감소를 나타낸 본 연구 결과는 Lee 등(29)과 Park 등(30)이 브로콜리 싹 에탄올 추출물과 도라지 물 추출물을 고지방식이와 함께 섭취시킨 결과 흰쥐의 체중증가량이 현저히 감소하였으므로 비만 억제효과가 있었고, 고지방식이에 의해 증가된 간 조직과 지방 무게도 이들 추출물들 투여에 의해 감소하였다는 보고와 유사하였다. 또한 본 연구에 사용된 회향종자 물 추출물 섭취에 의한 부고환 지방량 감소는 비만에 있어서 체중의 증가보다는 체지방량의 증가가 건강을 해친다는 Kim 등(31)의 연구 결과에 근거한다면 회향종자 물 추출물은 비만한 사람에게 건강 개선과 함께 체중감소 효과를 나타낼 수 있는 천연 소재일 것이라는 것을 시사하고 있다.
- ACS는 세포내로 유입된 지방산을 acyl-CoA로 전환시키는 중추적인 역할을 하는데(42,43), 형성된 acyl-CoA는 carnitine acetyl transferase에 의해 미토콘드리아로 유입되어 이화경로인 β-oxidation을 거쳐 분해된다. 본 연구 결과 회향종자 물 추출물의 섭취는 ACS 효소의 활성을 증가시킴으로써 항비만 개선용 소재로 이상적이라 사료된다.
- 한편 Park 등(38)은 백강잠, 산약, 쥐눈이콩, 청국장가루로 구성된 생약복합제를 고지방식이로 대사성 증후군을 유발시킨 동물모델에게 섭취시킨 결과 각종 생약제로부터 유래된 화합물들이 여러가지 혈당을 조절하는 메커니즘 중에서 α-glucosidase 및 PTP1β(protein tyrosinase phosphatase)의 억제 효능이 여러 가지 원인 중에 하나로 작용하여 대사성증후군 및 당뇨병 환자들에게 도움을 줄 수 있다는 것을 확인하였다. 앞으로 본 연구에 사용된 회향종자의 각 성분과 그 기능성에 대한 연구가 더 이루어져야 할 것으로 판단된다.
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