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문제 정의
- 본 연구에서는 오징어 내장의 대부분을 차지하고 있는 간을 원료로 하여 제조한 액젓의 ACE 저해효과를 숙성기간에 따라 비교하고 이로부터 ACE 저해 peptide를 한외여과, 겔크로마토그래피, 이온크로마토그래피로 분리하여 그 저해 효과를 검토하였다.
가설 설정
- 2)The numbers in the parenthesis are dry weight basis.
제안 방법
- ACE 저해 peptide와 관련하여 보고되는 많은 연구에서 고분자 peptide에 비해 저분자 peptide가 ACE 저해효과가 높은 것으로 보고(10,30)되고 있어 15개월째의 액젓을 molecular weight cut-off가 10,000 Da 이하인 한외여과막을 통과한 저분자 분획물을 Biogel P-2 column에 주입하여 겔크로마토그래피를 실시하였다. 분획 후, 각 용출획분의 280 nm에서의 흡광도 및 ACE 저해효과를 검토하여 활성획분인 A(tube No 44, 45), B(tube No 54, 55) 및 C(tube No 68, 69)를 분리하였다(Fig.
- 분해액을 감압 건조하여 HCl을 제거하고 여기에 증류수 10 mL를 가하여 다시 감압건조한 후, 구연산나트륨 완충용액(pH 2.2)으로 정용하고 0.45 μm membrane filter로 여과하여 일정량을 취하여 아미노산 자동분석기로 분석하였다.
- ACE 저해 peptide와 관련하여 보고되는 많은 연구에서 고분자 peptide에 비해 저분자 peptide가 ACE 저해효과가 높은 것으로 보고(10,30)되고 있어 15개월째의 액젓을 molecular weight cut-off가 10,000 Da 이하인 한외여과막을 통과한 저분자 분획물을 Biogel P-2 column에 주입하여 겔크로마토그래피를 실시하였다. 분획 후, 각 용출획분의 280 nm에서의 흡광도 및 ACE 저해효과를 검토하여 활성획분인 A(tube No 44, 45), B(tube No 54, 55) 및 C(tube No 68, 69)를 분리하였다(Fig. 1). 이들 각 획분의 ACE 저해효과(IC50)는 각각 4.
- 숙성 액젓 중 15개월째 액젓(IC50=29.66 μg)을 한외여과막으로 통과시켜 회수한 분자량 10,000 Da 이하의 저분자물질을 Bio-gel P-2 gel chromatography를 행하여 ACE 저해효과를 가지는 3개 획분을 분취하였다.
- 오징어 가공 부산물인 오징어 간의 효율적 이용을 위하여 오징어 간을 이용하여 액젓을 제조하고 이들 액젓의 ACE 저해효과를 살펴보았다. 액젓의 ACE 저해활성은 12개월까지는 점차적으로 증가하였으나 그 이후에는 저해활성이 둔화되어 거의 일정한 저해활성을 유지하였다.
- 오징어를 적출하여 꺼낸 간을 3%(w/w)의 천일염으로 제조한 염수에 3회씩 수세와 수절을 반복한 후 2℃ 이하에서 원심분리(4,000×g, 30 min)하여 지질층을 제거하였다.
- 이들 각 획분의 ACE 저해효과(IC50)는 각각 4.51 μg, 3.23 μg 및 19.6 μg이었으며(데이타 미제시), 이들 획분 중 ACE 저해능이 우수한 B 획분을 원심농축하고 SuperQ-Toypearl 650S column을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피를 행하여 B 획분으로부터 증류수 용출 획분인 B-1(tube No, 14, 15)을 분리하였다(Fig. 2).
- 이들 반응 용액 20 μL를 Zorbax 300SB C8 column(4.6×150 mm, Agilent Tech. Inc., Santa Clara, CA, USA)이 장착된 역상 HPLC(Thermo Separation Products Inc., San Jose, CA, USA)에 주입하여 분석하였다.
- 66 μg)을 한외여과막으로 통과시켜 회수한 분자량 10,000 Da 이하의 저분자물질을 Bio-gel P-2 gel chromatography를 행하여 ACE 저해효과를 가지는 3개 획분을 분취하였다. 이들 획분 중에서 ACE 저해효과가 가장 높은 B 획분을 SuperQ-Toyopearl 650S column을 이용한 음이온 교환크로마토그래피에 의해 B-1의 활성획분을 분리하였다. 획분 B-1의 아미노산 조성은 lysine, glycine 및 proline의 함량이 가장 많아 전체의 약 85%를 차지하였으며 IC50은 5.
- 지질이 제거된 오징어 간 20 kg에 대하여 25%(w/w)의 천일염을 가하고 잘 혼합하여 20 L 용량의 전통 옹기(∅×H, 20.5 cm×37.5 cm)에 담아 15～20℃의 암실에서 전통적인 방법으로 숙성 1개월부터 1주일에 2～3회씩 위, 아래로 휘저어주면서 18개월 동안 숙성하였다.
대상 데이터
- 숙성 2개월부터 1～3개월 간격으로 액화된 원액을 원심분리(4,000×g, 30 min)하고 감압 여과(buchner funnel ∅110 mm; pore size 1 μm) 하여 -20℃ 이하의 동결고에 보관하면서 시료로 사용하였다.
- 실험에 사용한 오징어 간은 2008년 9월 강원도 강릉시 주문진 근해에서 어획된 오징어(Todarodes pacificus)를 주문진 항에서 직접 구입하여 쇄빙으로 채워진 아이스박스에 담아 신선한 상태로 운반하여 실험에 사용하였다. 토끼 허파로부터의 ACE 정제효소와 기질(hippuryl-histidyl-leucine)은 Sigma-Aldrich사(St.
- 액젓을 한외여과막(PM-10, Amicon Co., Beverly, MA, USA)을 사용하여 분자량 10,000 Da 이하의 저분자물질을 회수하고 원심농축(CVE-100D, Eyela Co., Tokyo, Japan)한 것을 gel chromatography 시료액으로 사용하였다.
- 실험에 사용한 오징어 간은 2008년 9월 강원도 강릉시 주문진 근해에서 어획된 오징어(Todarodes pacificus)를 주문진 항에서 직접 구입하여 쇄빙으로 채워진 아이스박스에 담아 신선한 상태로 운반하여 실험에 사용하였다. 토끼 허파로부터의 ACE 정제효소와 기질(hippuryl-histidyl-leucine)은 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 2)Values with different superscript letters within a column are significantly different at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
이론/모형
- ACE 저해능은 Lee 등(26)의 방법으로 측정하였다. 15 μL의 시료용액에 ACE 정제효소(60 mU/mL) 50 μL를 가한 후, 37℃에서 5분간 preincubation시켰다.
- 오징어 간의 일반성분은 AOAC 방법(25)에 준하여 수분 정량은 105℃ 상압가열 건조법, 조단백질은 semi-micro Kjeldahl법, 조지방은 Soxhlet추출법, 조회분은 550℃에서 직접 회화법으로 측정하였다.
성능/효과
- 오징어 간의 일반성분을 분석하여 수분, 조단백질, 지방, 회분함량을 Table 1에 나타내었다. 그 결과 수분함량 64.0%, 조단백질 15.9%, 조지방 17.4% 및 회분이 1.4%로 나타났다. 이와 같은 결과는 Kim 등(27)의 원양산 오징어의 내장전체로 한 일반성분(수분 62.
- 분리된 획분 B-1의 주요 아미노산은 lysine(72.3%), glycine(8.2%) 및 proline(4.8%)으로 이들 3종류의 아미노산이 전체아미노산의 약 85%를 차지하였으며 ACE 저해효과는 IC50=5.46 μg이었다.
- 숙성기간에 따른 ACE 저해효과(Table 2)는 액젓을 담근 2개월째에 IC50 값이 67.56 μg이었으며 숙성이 진행됨에 따라 18개월까지 저해 효과가 감소됨이 없이 완만히 증가되었고, 12, 15 및 18개월째에는 IC50 값이 각각 30.46, 29.66 및 28.12 μg으로 거의 일정한 저해효과를 나타내었다.
- 오징어 가공 부산물인 오징어 간의 효율적 이용을 위하여 오징어 간을 이용하여 액젓을 제조하고 이들 액젓의 ACE 저해효과를 살펴보았다. 액젓의 ACE 저해활성은 12개월까지는 점차적으로 증가하였으나 그 이후에는 저해활성이 둔화되어 거의 일정한 저해활성을 유지하였다. 숙성 액젓 중 15개월째 액젓(IC50=29.
- 이러한 오징어 간 액젓의 숙성에 따른 ACE 저해효과는 오징어 간의 자가 소화효소 및 미생물이 분비하는 단백질 분해효소에 의해 액젓 단백질로부터 유리되는 peptide에 기인하는 것으로 예상된다. 한편, 이들 숙성 기간에 따른 ACE 저해효과를 peptide-nitrogen 함량과 비교해 볼 때 숙성 8개월경의 peptide nitrogen 함량이 1,135 mg/100 mL로 최대값을 나타내었다가 함량이 감소되는 12개월(1,111 mg/100 mL), 15개월(1,035 mg/100 mL) 및 18개월(908 mg/100 mL) 개월에도 ACE 저해효과는 감소되지 않고 일정하게 유지되어 ACE 저해효과와 peptide-nitrogen 함량 사이에는 뚜렷한 상관성을 나타내지 않았다. 이와 관련하여 Kim 등(28)과 Lee 등(29)의 담수어 효소 가수분해물 및 김 가수분해물에서도 ACE 저해능과 가수분해율 및 peptide-nitrogen 함량 사이에는 상관성이 없는 것으로 보고하고 있어 본 실험과 유사한 결과를 나타내었다.
- 이들 획분 중에서 ACE 저해효과가 가장 높은 B 획분을 SuperQ-Toyopearl 650S column을 이용한 음이온 교환크로마토그래피에 의해 B-1의 활성획분을 분리하였다. 획분 B-1의 아미노산 조성은 lysine, glycine 및 proline의 함량이 가장 많아 전체의 약 85%를 차지하였으며 IC50은 5.46 μg으로 나타났다.
후속연구
- 이상에서 살펴본 바와 같이 오징어 간 액젓에 존재하는 ACE 저해 peptide는 그 구성아미노산의 조성, 함량에도 영향을 미칠 것으로 예측되나 그 외에도 peptide의 아미노산 배열순서, 길이 등이 더 크게 저해활성에 영향요인이 될 수 있을 것으로 판단된다.
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