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문제 정의
- 본 시험은 이러한 섬오갈피 (A. koreanum Nakai) 뿌리의 효능과 약리적 성분을 토대로 복귀돌연변이 시험과 항돌연변이 원 시험의 돌연변이원 억제를 살펴보았다.
- 본 연구는 섬오갈피 뿌리 추출물을 이용하여 돌연변이 유발을 관찰하기 위해 S. typhimurium TA100, TA98, TA1535, TA1537과 E. coli WP2 uvr A를 이용해 Ames test을 하였고 또한 S. typhimurium TA 100, TA98을 이용한 항돌연변이 원 억제 시험을 시행하였다. Ames test 에 필요한 시험물질들은 최 고농도 결정 을 통해 5000 μg/plate, 2500 μg/plate, 600 μg/plate의 시험물질을 양성대조군, 실험군, 음성대조군을 비대사활성계와 대사활성계로 나누어 시험을 시행하였다.
제안 방법
- 15 ml tube에 S. typhimurium TA98, TA100 균주를 100 ml씩 넣은 후 시험물질 부위별 돌연변이 유발물질 50 μl과 양성물질 50 pl 씩 농도 별로 넣은 후 각각 5% S9 mix 또는 PBS을 500 pl 씩 넣고 손으로 shaking한 후 shaking incubator에 20분 간 진탕배양 (37oC, 201 rpm)한 후 45oC의 water bath에 보관 중이던 histidine top agar 2 ml씩을 넣고 glucose minimal agar plate (GM agar plate)에 도말한 후 incubator에 37oC로 48시간 배양한 후 revertant 수를 계수한 것을 확인하고 항돌연변이원성을 판정하였다. 돌연변이 억제 효과는 다음의 inhibition rate13)공식에 의했다.
- A. koreanum Nakai의 부위별 추출물을 항돌연변이원 시험에 사용되는 농도를 결정하기 위하여 예비독성 시험으로 형질 확인 및 최고농도결정 시험을 실시하였다. 형질 확인 시험에서는 TA98과 TA100에 대한 균주를 확인하였다.
- typhimurium TA 100, TA98을 이용한 항돌연변이 원 억제 시험을 시행하였다. Ames test 에 필요한 시험물질들은 최 고농도 결정 을 통해 5000 μg/plate, 2500 μg/plate, 600 μg/plate의 시험물질을 양성대조군, 실험군, 음성대조군을 비대사활성계와 대사활성계로 나누어 시험을 시행하였다. 시험 결과 모든 농도에서는 집락군의 일관성 있는 증가는 보이지 않았고 이 점으로 미루어 보아 복귀돌연변이는 일어나지 않았고 음성으로 판정하였다.
- water bath (48oC, DAIHAN Scientific Co Ltd, Korea) 에 보관한다. 그 다음에 S9 mix 또는 PBS을 500 μ씩 넣은 후 섬오갈피 뿌리를 농도 별로 100 μ씩 넣은 후 각각 3초 간 약하게 vortex하여 각각 S. typhimurium TA98, TA100, TA1535, TA1537 균주를 100 μl씩 넣고 손으로 shaking하여 glucose minim이 agar plate (GM agar plate)에 도말한 후 incubator에 37oC로 48시간 배양한 후 revertant 수를 계수한 것을 확인하였다. E.
- 4, Sigma) 을 사용한다. 그리고 master plate 에서 배양시킨 균주 TA98, TA100를 nutrient broth에 접종 한 후, shaking incubator (37oC, 201 rpm, Vision Scientifics Co Ltd.) 에서 으약 8~12시간 동안 배양된 균주 TA98, TA100 (1~2 x 108cells/ ml)를 사용하였고 -20oC에 냉동 보관중인 A. koreanum Nakai의 뿌리 추출물을 5000 μg/plate, 2500 μg/plate, 1250 μ g/plate 농도로 시험(2)하였다.
- 다음과 같이 실시하였다. 돌연변이원성의 검사를 위해서 S9 mix 오 phosphate buffer saline (PBS, pH 7.4, Sigma) 을 사용하며, shaking incubator (37oC, 201 rpm, Vision Sci- entifics Co Ltd, Korea) 8~12시간 배양된 S. typhimurium TA98, TA100, TA1535, TA1537 그리고 E. coli WP2 uvr A과 -20oC에 냉동 보관중인 A. koreanum Nakai의 뿌리 추출물을 5000 μg/plate, 2500 μg/plate, 600 μg/plate 농도로 시험하였다. 이 시험에 쓰인 A.
- 하지만 돌연변이의 억제는 시험법, 변이원, 균 농도 및 균의 종류에 따라 경향이 다르게 나타날 수 있음은 물론 억제의 유-무까지도 다르게 나타날 수 있기 때문에 3번의 시험을 걸쳐 결과를 도출하였다. 또한, 섬오갈피의 뿌리에서 나타나는 약용성분 중 항균, 항스트레스의 생리활성을 항돌연변이 시험을 통해 결과를 도출하였다.
- μg/plate, 312 μg/plate, 150 μg/plate, 80 μg/plate의 8개 농도 중 3개 (최대, 중간, 최소) 농도로 결정하였다. 뿌리 추출물 50 mg/ml 중에서 0.1 ml를 dimethyl sulfoxide (DMSO, Generay biotech, Shanghai, China) 0.9 ml에 넣어 농도 5000μ g/plate 을 조제 한 후 최대농도결정 시험을 시행하였다.
- coli WP2 uvr A에 대한 Ames test 결과 Table 1 에 나타나있다. 생육억제가 나타나지 않은 최고농도 5000 μg/plate, 중간농도 2500 μg/plate, 최 소농도 600 μg/plate로 Ames test롤 시 행하였다.
- 섬오갈피 뿌리 추출물을 각각 5000 μg/plate, 2500 μg/plate, 1250 μg/plate 농도로 돌연변이원 억제효과를 시험하였고, 돌연변이원으로 양성물질 SA, AF-2, 2-AA를 사용하였다. 결과로 inhibition rate와 revertant 수를 계수한 것은 각각 Table 2과 Table 3에 나타나 있다.
- 말한다. 하지만 돌연변이의 억제는 시험법, 변이원, 균 농도 및 균의 종류에 따라 경향이 다르게 나타날 수 있음은 물론 억제의 유-무까지도 다르게 나타날 수 있기 때문에 3번의 시험을 걸쳐 결과를 도출하였다. 또한, 섬오갈피의 뿌리에서 나타나는 약용성분 중 항균, 항스트레스의 생리활성을 항돌연변이 시험을 통해 결과를 도출하였다.
- 항돌연변이원 시험에 들어 갈 양성물질 농도 결정을 위해 예비 양성물질 농도 시험을 시행하였다. 양성물질 SA, AF-2, 2-AA 농도 3개를 각각 농도결정시험을 통해 각 2개의 농도로 결정하였으며 시험은 preincubation10-11) 법에 준하여 시행하였다.
- koreanum Nakai의 부위별 추출물을 항돌연변이원 시험에 사용되는 농도를 결정하기 위하여 예비독성 시험으로 형질 확인 및 최고농도결정 시험을 실시하였다. 형질 확인 시험에서는 TA98과 TA100에 대한 균주를 확인하였다.
- 형질확인 및 최고농도결정 시험에서는 뿌리 추출물 50 mg/ml 에 대한 농도를 5000 μ g/plate, 2500 μ g/plate, 1250 μ g/plate, 625 μg/plate, 312 μg/plate, 150 μg/plate, 80 μg/plate의 8개 농도 중 3개 (최대, 중간, 최소) 농도로 결정하였다. 뿌리 추출물 50 mg/ml 중에서 0.
대상 데이터
- coli WP2 uvr Ae 한국 생명공학연구원 생명자원센터 (The Korea collection for type cultures, KCTC, Korea) 에서 분양한 것을 제공 받았고, TA1537 균주는 Moltox (Boone, NC, USA)에서 분양 받았다. 그리고 돌연변이 유발원인 양성물질로 9-aminoacridine (9AA, Sigma, St. Louis, MO, USA), sodium azide (SA, Sigma) 와 2-amino- anthracene (2-AA, Sigma)와 2-(2-furyl)-3-(5-nitro-2-furyl) - acrylamide (AF-2, Wako, Japan)를 구입하였으며, 대사 활성 물질 인 S9 (2 ml x 10, Wako) 과 S9-cofactor (9 ml x 10, Wako)를 구입하여 사용하였다.
- 본 시험에 사용한 Acanthopanax koreanum Nakai의 뿌리추출물은 서울여자대학교 화학과 박원봉 교수에게 섬오갈피 뿌리 추출물 50g을 제공받았다. 항돌연변이원 시험에 사용된 균주인 S.
- 뿌리 추출물 50g을 제공받았다. 항돌연변이원 시험에 사용된 균주인 S. typhimurium 구조이동형 (frame shift) 변이 균주인 TA98과 염기치환형 (base-pair substituent) 변이 균주인 TA1009), TA1535, E. coli WP2 uvr Ae 한국 생명공학연구원 생명자원센터 (The Korea collection for type cultures, KCTC, Korea) 에서 분양한 것을 제공 받았고, TA1537 균주는 Moltox (Boone, NC, USA)에서 분양 받았다. 그리고 돌연변이 유발원인 양성물질로 9-aminoacridine (9AA, Sigma, St.
이론/모형
- 복귀돌연변이시험은 Ames test10-11)에 준하여 incorpration10-11) 법으로 다음과 같이 실시하였다. 돌연변이원성의 검사를 위해서 S9 mix 오 phosphate buffer saline (PBS, pH 7.
- 예비 양성물질 농도 시험을 시행하였다. 양성물질 SA, AF-2, 2-AA 농도 3개를 각각 농도결정시험을 통해 각 2개의 농도로 결정하였으며 시험은 preincubation10-11) 법에 준하여 시행하였다.
- 항돌연변이원 시험은 Ames test을 개량한 preincubation11) 법으로 다음과 같이 실시하였다. 항돌연변이 원성의 검사를 위해서 S9 mix 오 phosphate buffered saline (PBS, pH 7.
성능/효과
- S. typhimurium TA100에서 항돌연변이 효과는 Table 3와 같이 대사활성계가 포함된 2AA의 농도 1 μg/plate 양성물질 일 때 각 86%, 75%, 91%의 높은 억제율이 나타났다. SA의 양성물질 일 때는 각 농도 별로 1 μ g/plate 일 때 13%, 41%, 30%의 억제율인데 반해 0.
- S. typhimurium TA98에서 항돌연변이 효과는 2AA의 양성물질일 때 Table 2에 나타나 있는 거와 같이 농도 0.5 μg/plate 대사활성계 S-9을 넣었을 때 각 90%, 88%, 91%의 억제률의 높은 억제율을 보여주고 있고 1 μ g/plate 대사활성계 S-9 을 넣었을 때 각 76%, 80%, 85%의 높은 억제율을 보이고 있다. 반면 농도 0.
- typhimurium TA100에서 항돌연변이 효과는 Table 3와 같이 대사활성계가 포함된 2AA의 농도 1 μg/plate 양성물질 일 때 각 86%, 75%, 91%의 높은 억제율이 나타났다. SA의 양성물질 일 때는 각 농도 별로 1 μ g/plate 일 때 13%, 41%, 30%의 억제율인데 반해 0.5 μg/plate일 때 58%, 57%, 45%의 좀 더 높은 억제율을 보였다 (p <0.05).
- Ames test 에 필요한 시험물질들은 최 고농도 결정 을 통해 5000 μg/plate, 2500 μg/plate, 600 μg/plate의 시험물질을 양성대조군, 실험군, 음성대조군을 비대사활성계와 대사활성계로 나누어 시험을 시행하였다. 시험 결과 모든 농도에서는 집락군의 일관성 있는 증가는 보이지 않았고 이 점으로 미루어 보아 복귀돌연변이는 일어나지 않았고 음성으로 판정하였다. 항돌연변이원 시험에서는 양성물질의 농도결정과 시험물질의 최고농도 결을 통해 양성대조군, 실험군, 음성대조군을 비대사활성계와대사활성계로 시험을 하였고 시험결과 S.
- typhimurium TA100, TA98 두 균주 돌연변이 억제를 보였으며 TA98에서 더 높은 억제율을 보였다. 시험결과로 섬오갈피의 뿌리는 항돌연변이 억제효과에 탁월한 효과가 있음을 시사하였다.
- 이런 결과를 통해 섬오갈피 뿌리의 돌연변이원이 억제의 탁월한 효과를 갖고 있다는 것을 시사하였으며 S. typhimurium TA100보다 S. typhimurium TA98에서 더 강한 항돌연변이효과가 있는 것을 도출하였다. 하지만 TA100 2AA의 농도 1 μ g/plate 양성물질 일 때는 높은 억제율을 보여주고 있다.
- 시험 결과 모든 농도에서는 집락군의 일관성 있는 증가는 보이지 않았고 이 점으로 미루어 보아 복귀돌연변이는 일어나지 않았고 음성으로 판정하였다. 항돌연변이원 시험에서는 양성물질의 농도결정과 시험물질의 최고농도 결을 통해 양성대조군, 실험군, 음성대조군을 비대사활성계와대사활성계로 시험을 하였고 시험결과 S. typhimurium TA100, TA98 두 균주 돌연변이 억제를 보였으며 TA98에서 더 높은 억제율을 보였다. 시험결과로 섬오갈피의 뿌리는 항돌연변이 억제효과에 탁월한 효과가 있음을 시사하였다.
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