폐 대식세포주에서 벤젠에 의한 세포 사멸 효과와 산화성 스트레스 관련성 Relationship between Cell Death and Oxidative Stress in the effect of benzene in Cultured Lung Epithelial Cells원문보기
벤젠은 농약 노출 및 새집 증후군시에 나타나는 중요한 물질로 천식 및 알러지 등의 호흡 질환을 일으키는 물질로 알려져 있으나 폐 상피세포에 대한 자세한 효과는 알려져 있지 않고 있다. 본 실험에서는 폐 상피세포인 A549 세포를 이용하여 벤젠에 대한 효과를 알아보았다. 실험 결과 벤젠은 세포 생존율을 감소 시켰으며, 이러한 반응은 항산화제인 vitamin C 및 NAC 처리 시 차단되었다. 실제로 벤젠 처리시 산화성 스트레스 지표인 lipid peroxide 형성이 증가하였으며 이들 반응 역시 항산화제들에 의해 차단되었다. 한편 벤젠 처리시 세포 사멸 촉진 단백질인 Bax 발현은 증가하였으며 세포 사멸 억제 단백질인 Bcl-2의 발현은 억제 되었으며 세포 사멸 실행 단백질인 casapse-3의 활성형 역시 증가하였다. 결론적으로 벤젠은 폐 상피세포에서 산화성 스트레스 증가를 통해 세포 사멸을 일으키는 것으로 나타났다.
벤젠은 농약 노출 및 새집 증후군시에 나타나는 중요한 물질로 천식 및 알러지 등의 호흡 질환을 일으키는 물질로 알려져 있으나 폐 상피세포에 대한 자세한 효과는 알려져 있지 않고 있다. 본 실험에서는 폐 상피세포인 A549 세포를 이용하여 벤젠에 대한 효과를 알아보았다. 실험 결과 벤젠은 세포 생존율을 감소 시켰으며, 이러한 반응은 항산화제인 vitamin C 및 NAC 처리 시 차단되었다. 실제로 벤젠 처리시 산화성 스트레스 지표인 lipid peroxide 형성이 증가하였으며 이들 반응 역시 항산화제들에 의해 차단되었다. 한편 벤젠 처리시 세포 사멸 촉진 단백질인 Bax 발현은 증가하였으며 세포 사멸 억제 단백질인 Bcl-2의 발현은 억제 되었으며 세포 사멸 실행 단백질인 casapse-3의 활성형 역시 증가하였다. 결론적으로 벤젠은 폐 상피세포에서 산화성 스트레스 증가를 통해 세포 사멸을 일으키는 것으로 나타났다.
Benzene is one of volatile environmental pollutants to induce asthma and allergy in respiratory system. The airway epithelium is a physical barrier to inhaled toxicants and particulates. However, the effect of benzene in lung epithelial cell viability has not been elucidated. Thus, this study was co...
Benzene is one of volatile environmental pollutants to induce asthma and allergy in respiratory system. The airway epithelium is a physical barrier to inhaled toxicants and particulates. However, the effect of benzene in lung epithelial cell viability has not been elucidated. Thus, this study was conducted to investigate the effect of benzene on apoptosis in A549 cells, lung epithelial cell line. In this study, benzene decreased cell viability of A549 cells in a dose-dependent manner (> $10{\mu}M$). Benzene-induced decrease of cell viability was blocked by the treatment of antioxidants (vitamin C and NAC). Indeed, benzene induced lipid peroxide formation in A549 cells. Benzene decreased Bcl-2 expression but increased Bax expression in A549 cells. In addition, benzene also increased the cleaved form of caspase-3. In conclusion, benzene induced apoptosis via oxidative stress in cultured epithelial cells.
Benzene is one of volatile environmental pollutants to induce asthma and allergy in respiratory system. The airway epithelium is a physical barrier to inhaled toxicants and particulates. However, the effect of benzene in lung epithelial cell viability has not been elucidated. Thus, this study was conducted to investigate the effect of benzene on apoptosis in A549 cells, lung epithelial cell line. In this study, benzene decreased cell viability of A549 cells in a dose-dependent manner (> $10{\mu}M$). Benzene-induced decrease of cell viability was blocked by the treatment of antioxidants (vitamin C and NAC). Indeed, benzene induced lipid peroxide formation in A549 cells. Benzene decreased Bcl-2 expression but increased Bax expression in A549 cells. In addition, benzene also increased the cleaved form of caspase-3. In conclusion, benzene induced apoptosis via oxidative stress in cultured epithelial cells.
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문제 정의
그럼에도 불구하고 benzene에 의한 이들 단백질들의 조절 기전은 아직까지 알려져 있지 않고 있다. 따라서 본 실험에서는 폐 상피세포주를 이용하여 새집증후군의 원인물질인 benzene이 폐포의 상피세포 사멸에 미치는 효과와 이와 관련된 신호전달계중 산화성 스트레스 및 관련 단백질 발현 관련성에 대해 알아보았다.
제안 방법
반응이 끝나면 반응 정지액을 넣은 뒤, 각각을 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. LDH에 의한 세포 독성의 백분율은 배양액과 살아있는 세포에서 유리된 총 LDH에 대한 배양액으로부터 유리된 LDH의 값으로 계산하여 무처리 대조구와 비교한 값을 나타내었다.
그 후, membrane을 0.1% Tween-20/1×TBS에 10분 간격으로 3번 세척 하였고, membrane을 1% skim milk에 5,000배 희석된 horseradish-peroxidase labeled 2차 항체에 1시간 동안 배양한 후, 3번 세척을 거쳐서 Enhanced Chemiluminoscent (ECL) 시약을 1분간 처리한 다음 X-ray 필름에 30초간 노출시켜 현상하였다.
반응 후 well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO 100 µL 첨가하여 ELISA reader(Model 680, BioRad, Hercules, CA, USA) 로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구 세포수를 100%로 하여 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.
따라서 본 실험에서는 아치사 농도인 벤젠 50 µM을 24 시간 처리하였다.
벤젠에 대한 시간 의존성 효과를 알아보기 위하여 50 µM 벤젠을 시간별로 처리하였다.
벤젠에 의한 폐 상피세포 사멸이 세포 사멸 관련 단백질인 Bax, Bcl-2 및 caspase-3의 발현을 살펴보았다. 실험결과 벤젠은 세포 사멸 촉진 단백질인 Bax의 발현을 증가하였으며 이에 반해 세포사멸 억제 단백질인 Bcl-2 발현은 감소시키는 것으로 나타났다.
벤젠의 폐 상피세포 사멸 효과를 측정하기 위하여 LDH 방출측정 kit를 이용하여 실시하였다. A549 세포주를 1 ×105 cells/mL로 맞춘 후, 100 µL씩 96 well plate에 분주하여 CO2 incubator에서 24시간 동안 배양하였다.
벤젠의 폐 상피세포 사멸 효과를 측정하기 위하여 MTT 환원 실험을 실시하였다. 세포주를 96-well plate에 1 × 105 cells/mL의 농도로 100 µL씩 분주하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후 벤젠을 처리하여 24시간 배양하였다.
산화성 스트레스와의 관련성을 알아보기 위하여 lipid peroxide (LPO) 형성을 측정하였다. 실험결과 벤젠은 산화성 스트레스를 증가시켰으며 이러한 작용은 항산화제인 vitamin C (1 mM) 및 NAC (100 µM)에 의해 차단되는 것으로 나타났다 (Fig.
이들 세포들은 5% Fetal bovine Serum (FBS)를 함유한 Dulbecco's modified Eagle's 배지(Life Technologies, Grand Island, NY)에 배양하였다. 이들 세포들이 70% confluence되었을 때 세포성장을 정지시키기 위해 무혈청 배지에서 이틀을 배양하여 세포의 성장을 동기화 시켜서 실험에 이용하였다.
폐 상피 세포 사멸에 대한 벤젠의 농도별 효과를 알아보기 위하여, 벤젠을 농도별(1~100 µM)로 처리 후 MTT assay를 실시하였다.
대상 데이터
A549 세포는 American Type Culture Collection (ATCC) 에서 구입하였다. 이들 세포들은 5% Fetal bovine Serum (FBS)를 함유한 Dulbecco's modified Eagle's 배지(Life Technologies, Grand Island, NY)에 배양하였다.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(D-MEM)-nutrient mixture F-12(D-MEM/F-12) 와 Class IV collagenase은 Life Technologies(Grand Island, NY, USA)로부터 구입하였다.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(D-MEM)-nutrient mixture F-12(D-MEM/F-12) 와 Class IV collagenase은 Life Technologies(Grand Island, NY, USA)로부터 구입하였다. MTT assay kit, penicillin 및 streptomycin는 Sigma Chemical Company(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. Bax, Bcl-2, caspase-3, 및 beta actin 항체는 Cell Signaling technology (Herts, UK)에서 구입하였다.
벤젠은 농약 노출 및 새집 증후군시에 나타나는 중요한 물질로 천식 및 알러지 등의 호흡 질환을 일으키는 물질로 알려져 있으나 폐 상피세포에 대한 자세한 효과는 알려져 있지 않고 있다. 본 실험에서는 폐 상피세포인 A549 세포를 이용하여 벤젠에 대한 효과를 알아보았다. 실험 결과 벤젠은 세포 생존율을 감소 시켰으며, 이러한 반응은 항산화제인 vitamin C 및 NAC 처리 시 차단되었다.
데이터처리
실험 결과의 통계적 처리는 Student's t test 및 Analysis of Variance (ANOVA)로 하였으며, P 값 < 0.05 을 유의한 차이의 한계로 하였고, 실험결과의 표현은 means± S.E 로 하였다.
이론/모형
균질화된 세포를 tube에 옮긴 후, 15,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 상층액을 새로운 tube에 저장하였다. Bradford 단백질 정량법 (Bradford, 1976)을 이용하여 각각 60 ㎍의 sample들을 8% SDS-PAGE 전기영동을 시킨 후, polyvinylidine difluoride membrane에 transfer하였다. Membrane은 5% skim milk에 1시간 동안 차단시켰고, 각각의 항체 (Bcl-2, Bax, caspase-3, beta actin)를 1% skim milk에 1,000배 희석하여 4℃에서 18시간 이상 배양하였다.
LPO 형성은 Ohkawa et al (1979)의 방법에 따라 malondealdehyde의 양으로 측정하였으며, 간략히 요약하면 다음과 같다. 세포들을 수확한 후 초음파로 세포를 분쇄한 후, 반응용액 [8% SDS 100 µl, 0.
성능/효과
50 µM 벤젠 처리 시 1시간에서는 대조군과 유의성 있는 차이가 인정이 되지 않았으나 4시간 이상에서 유의성 있게 세포생존율은 감소하였으며 24시간 이상에서 현저하게 억제되었다(Fig. 2A).
한편 벤젠 처리시 세포 사멸 촉진 단백질인 Bax 발현은 증가하였으며 세포 사멸 억제 단백질인 Bcl-2의 발현은 억제 되었으며 세포 사멸 실행 단백질인 casapse-3의 활성형 역시 증가하였다. 결론적으로 벤젠은 폐 상피세포에서 산화성 스트레스 증가를 통해 세포 사멸을 일으키는 것으로 나타났다.
본 실험에서는 벤젠 처리 시 산화성 스트레스를 의미하는 LPO 형성은 증가하였다. 이러한 결과는 벤젠 노출 시 랫트에서 폐의 항산화 효소 활성이 감소하였다는 보고와 일맥 상통하다고 할 수 있다 (Verma and Rana, 2004).
본 실험에서는 벤젠에 의한 산화성 스트레스 발생이 세포 사멸 억제 단백질인 Bcl-2 발현 및 Bax 활성에 직접적으로 미치는 영향을 조사하지 않았지만 벤젠에 의한 Bax, Bcl-2 발현 및 caspase-3의 활성형 증가 작용과 항화제인 vitamin C 및 NAC에 의한 세포 사멸 차단 작용의 결과로 보아 이들의 활성이 Bcl-2를 억제하고 세포 사멸 촉진 단백질인 Bax 활성을 증가할 것으로 추측 해주고 있다. 이러한 결과는 산화성 스트레스가 Bax, Bcl-2 발현 및 caspase-3 발현을 조절함으로써 세포 사멸에 깊숙이 관여하는 것으로 판단된다.
특히 Bax/Bcl-2 비율은 미토콘드리아 경로에 의한 세포 사멸의 주요한 표지 인자로 인식이 되고 있다 (Tong et al, 2007). 본 실험에서도 벤젠 처리 시 폐 상피 세포 사멸 억제를 담당하는 Bcl-2의 발현은 감소하였고 폐 상피세포사멸 촉진을 담당하는 Bax의 발현이 증가하여 Bax/Bcl-2의 비율은 증가하였다. 이러한 결과는 최근에 랫트에 벤젠 흡입시에 Bax의 발현 증가 및 Bcl-2의 발현 감소가 폐 상피에 관찰된다는 보고 (Weaver and Liu, 2008)에 비추어 볼 때 본 연구결과가 직접적으로 생체에서도 이루어질 수 있음을 시사해주고 있다.
실험 결과 Fig. 1A에서 보이듯이 1 µM 벤젠 처리 시에는 세포 생존율에는 영향을 미치지 않았으며 10 µM 이상에서 폐 세포 사멸을 유발하는 것으로 나타났으며 50 µM이상에서 이러한 현상은 더욱 현저하게 나타났다.
본 실험에서는 폐 상피세포인 A549 세포를 이용하여 벤젠에 대한 효과를 알아보았다. 실험 결과 벤젠은 세포 생존율을 감소 시켰으며, 이러한 반응은 항산화제인 vitamin C 및 NAC 처리 시 차단되었다. 실제로 벤젠 처리시 산화성 스트레스 지표인 lipid peroxide 형성이 증가하였으며 이들 반응 역시 항산화제들에 의해 차단되었다.
실험결과 벤젠은 산화성 스트레스를 증가시켰으며 이러한 작용은 항산화제인 vitamin C (1 mM) 및 NAC (100 µM)에 의해 차단되는 것으로 나타났다 (Fig. 3A).
벤젠에 의한 폐 상피세포 사멸이 세포 사멸 관련 단백질인 Bax, Bcl-2 및 caspase-3의 발현을 살펴보았다. 실험결과 벤젠은 세포 사멸 촉진 단백질인 Bax의 발현을 증가하였으며 이에 반해 세포사멸 억제 단백질인 Bcl-2 발현은 감소시키는 것으로 나타났다. 아울러 세포 사멸 실행자인 caspase-3의 활성형 form인 절단된 casapse-3의 form 역시 증가하는 것으로 나타났다 (Fig.
실험결과 벤젠은 세포 사멸 촉진 단백질인 Bax의 발현을 증가하였으며 이에 반해 세포사멸 억제 단백질인 Bcl-2 발현은 감소시키는 것으로 나타났다. 아울러 세포 사멸 실행자인 caspase-3의 활성형 form인 절단된 casapse-3의 form 역시 증가하는 것으로 나타났다 (Fig. 4).
본 실험에서는 벤젠에 의한 산화성 스트레스 발생이 세포 사멸 억제 단백질인 Bcl-2 발현 및 Bax 활성에 직접적으로 미치는 영향을 조사하지 않았지만 벤젠에 의한 Bax, Bcl-2 발현 및 caspase-3의 활성형 증가 작용과 항화제인 vitamin C 및 NAC에 의한 세포 사멸 차단 작용의 결과로 보아 이들의 활성이 Bcl-2를 억제하고 세포 사멸 촉진 단백질인 Bax 활성을 증가할 것으로 추측 해주고 있다. 이러한 결과는 산화성 스트레스가 Bax, Bcl-2 발현 및 caspase-3 발현을 조절함으로써 세포 사멸에 깊숙이 관여하는 것으로 판단된다. 이러한 연구는 벤젠에 대한 독성 기전 제시를 세포 수준에서 밝힐 수 있는 기회를 제공하였으며 이는 벤젠에 의한 다양한 질병 발병을 억제할 수 있는 물질들을 개발하는 연구에 기초적 자료로 사용 될 수 있을 것으로 판단이 된다.
(2010)은 본 실험에서 사용한 세포주에 silicon carbide 처리 시 산화성 스트레스가 증가하였으며 세포의 죽음이 야기된다고 하여 산화성 스트레스의 증가가 세포 사멸과 밀접한 관련이 있다는 것을 시사해 주고 있다. 특히 본 실험에서는 벤젠에 의한 산화성 스트레스가 항산화제인 vitamin C 및 NAC 처리 시 차단되었으며 실제 세포 생존율의 경우에서도 세포 죽음의 증가가 차단되어 산화성 스트레스가 세포 죽음에 강력히 관여하고 있음을 이야기 해주고 있다. 최근 Yang과 Zhou (2010)는 폐의 과도한 반응기 산소의 증가가 벤젠의 유도체중 하나인 benzoquinone 에 의한 햄스터의 폐 세포 사멸 및 DNA 손상에 관여한다고 하여 본 결과와 비슷하다고 할 수 있다.
실제로 벤젠 처리시 산화성 스트레스 지표인 lipid peroxide 형성이 증가하였으며 이들 반응 역시 항산화제들에 의해 차단되었다. 한편 벤젠 처리시 세포 사멸 촉진 단백질인 Bax 발현은 증가하였으며 세포 사멸 억제 단백질인 Bcl-2의 발현은 억제 되었으며 세포 사멸 실행 단백질인 casapse-3의 활성형 역시 증가하였다. 결론적으로 벤젠은 폐 상피세포에서 산화성 스트레스 증가를 통해 세포 사멸을 일으키는 것으로 나타났다.
후속연구
이러한 결과는 산화성 스트레스가 Bax, Bcl-2 발현 및 caspase-3 발현을 조절함으로써 세포 사멸에 깊숙이 관여하는 것으로 판단된다. 이러한 연구는 벤젠에 대한 독성 기전 제시를 세포 수준에서 밝힐 수 있는 기회를 제공하였으며 이는 벤젠에 의한 다양한 질병 발병을 억제할 수 있는 물질들을 개발하는 연구에 기초적 자료로 사용 될 수 있을 것으로 판단이 된다.
랫트의 sertoli 세포에 benzene hexacholoride 노출시 세포 사멸이 일어났는데 이는 산화성 스트레스의 증가에 기인한 것이라고 하였다 . 이에 대한 생체 실험은 향후 연구에서 밝혀져야 할 사항으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
휘발성유기화합물이란?
휘발성유기화합물(volatile organic compounds)은 대기 중에 휘발돼 악취나 오존을 발생시키는 탄화수소화합물을 일컫는 말로 피부접촉이나 호흡기를 통한 흡입에 의해 다양한 질병을 일으키는 발암물질로 알려져 있다 (Kampa and Castanas, 2008). 휘발성유기화합물중의 대표적 오염물질인 벤젠은 주로 방향족 화합물 생산의 주원료로 살충제, 건축재료, 세탁용제 및 페인트 등에 의해서 노출되게 된다.
벤젠의 위험성은?
벤젠은 농약 노출 및 새집 증후군시에 나타나는 중요한 물질로 천식 및 알러지 등의 호흡 질환을 일으키는 물질로 알려져 있으나 폐 상피세포에 대한 자세한 효과는 알려져 있지 않고 있다. 본 실험에서는 폐 상피세포인 A549 세포를 이용하여 벤젠에 대한 효과를 알아보았다.
폐 상피세포인 A549 세포를 이용하여 벤젠의 영향을 알아본 결과는?
본 실험에서는 폐 상피세포인 A549 세포를 이용하여 벤젠에 대한 효과를 알아보았다. 실험 결과 벤젠은 세포 생존율을 감소 시켰으며, 이러한 반응은 항산화제인 vitamin C 및 NAC 처리 시 차단되었다. 실제로 벤젠 처리시 산화성 스트레스 지표인 lipid peroxide 형성이 증가하였으며 이들 반응 역시 항산화제들에 의해 차단되었다. 한편 벤젠 처리시 세포 사멸 촉진 단백질인 Bax 발현은 증가하였으며 세포 사멸 억제 단백질인 Bcl-2의 발현은 억제 되었으며 세포 사멸 실행 단백질인 casapse-3의 활성형 역시 증가하였다. 결론적으로 벤젠은 폐 상피세포에서 산화성 스트레스 증가를 통해 세포 사멸을 일으키는 것으로 나타났다.
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