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문제 정의
- 이러한 연구 결과는 levodopa의 이온토포레시스는 한 가지 전하만을 가진 물질의 경우에 비해 매우 복잡하며 pH에 따라 electoosmosis와 electrorepulsion의 역할 및 그 크기가 변화되어 투과에 영향을 미침을 알려주었다.5) 이에 본 연구에서는 pH를 더 낮추어 levodopa가 100% 양이온 상태가 될 수 있는 pH 1.0의 인산 완충액 및 이 용액을 이용해 제조한 하이드로겔을 만들고 이들로부터의 약물의 피부투과를 연구하였다. Levodopa 투과에 영향을 미치는 여러 인자들 중 극성(anodal, cathodal), 전류세기, 전류적용 시간 및 전류적용패턴의 영향에 대하여 연구하였고 이들 결과를 바탕으로 electrorepulsion 및 electroosmosis의 역할에 대해 조사하였다.
- 0의 인산 완충액 및 이 용액을 이용해 제조한 하이드로겔을 만들고 이들로부터의 약물의 피부투과를 연구하였다. Levodopa 투과에 영향을 미치는 여러 인자들 중 극성 (anodal, cathodal), 전류세기, 전류적용패턴 및 약물의 농도의 영향에 대하여 연구하였고 이들 결과를 바탕으로 electrorepulsion 및 electroosmosis의 역할에 대해 조사하였다. 양이온 (pH 1.
- 0의 인산 완충액 및 이 용액을 이용해 제조한 하이드로겔을 만들고 이들로부터의 약물의 피부투과를 연구하였다. Levodopa 투과에 영향을 미치는 여러 인자들 중 극성(anodal, cathodal), 전류세기, 전류적용 시간 및 전류적용패턴의 영향에 대하여 연구하였고 이들 결과를 바탕으로 electrorepulsion 및 electroosmosis의 역할에 대해 조사하였다.
- 본 연구에서는 levodopa가 100 % 양이온 상태가 될 수 있는 pH 1.0의 인산 완충액 및 이 용액을 이용해 제조한 하이드로겔을 만들고 이들로부터의 약물의 피부투과를 연구하였다. Levodopa 투과에 영향을 미치는 여러 인자들 중 극성 (anodal, cathodal), 전류세기, 전류적용패턴 및 약물의 농도의 영향에 대하여 연구하였고 이들 결과를 바탕으로 electrorepulsion 및 electroosmosis의 역할에 대해 조사하였다.
제안 방법
- 0.2, 0.4 및 0.6 mA/ cm2의 전류를 6 시간 적용한 후 4 시간 동안 단순확산에 의한 투과를 더 하였을 때 각각 47 µg/ cm2, 78 µg/ cm2 및145 µg/ cm2의 levodopa가 투과되었다.
- 4)을 채운 다음 Ag/AgCl 전극과 spin bar를 각 cell에 넣어 실험을 실시하였다. 1 시간마다 receptor cell의 용액을 각각 모두 취해 검액으로 사용하였고, 즉시 새로운 인산완충액 용액을 receptor cell 에 채워 넣었다. Flux에 영향을 미치는 극성 (anodal, cathodal)의 영향을 조사하여 passive delivery와 비교하였고 전류세기, 전류적용패턴 및 약물 농도가 피부투과에 미치는 영향을 조사하였다.
- Levodopa의 안정화를 위해 산성 pH에서 이온교환수지에 결합시키는 방법이 보고되었으며14) 또한 dextrose를 levodopa 수용액에 첨가하는 방법도 보고되었다.15) 본 저자들도 levodopa의 안정성에 대해 지난 연구에서 이미 실시하였으며 세 가지 pH (2.5, 4.5, 9.5)에서 levodopa의 시간에 따른 안정성 및 dextrose의 첨가 시 안정화 효과를 조사하였다.4) 그 결과를 보면 pH 2.
- 8 주령의 무모생쥐의 full-thickness 피부와 내용량 1 mL, 투과면적 0.79 cm2의 side-by-side diffusion cell을 사용하여 33℃ incubator에서 실시하였다. Side-by-side diffusion cell 사이에 무모생쥐 피부를 clamp로 고정시킨 후 donor cell에는 약물용액(pH 1.
- 1 시간마다 receptor cell의 용액을 각각 모두 취해 검액으로 사용하였고, 즉시 새로운 인산완충액 용액을 receptor cell 에 채워 넣었다. Flux에 영향을 미치는 극성 (anodal, cathodal)의 영향을 조사하여 passive delivery와 비교하였고 전류세기, 전류적용패턴 및 약물 농도가 피부투과에 미치는 영향을 조사하였다.
- 피부투과 중 약물의 대사 또는 축적의 가능성을 조사하기 위하여 투과실험을 실시하였고 donor 및 receptor cell, 그리고 피부 내에 있는 levodopa의 양을 조사하였다. Levodopa 용액(10 mg/mL)을 donor cell에 phosphate buffer를 receptor cell에 넣은 후 0.4 mA/ cm2 또는 0.6 mA/ cm2의 전류를 120, 240 또는 300 분 동안 적용하였다. 그 후 receptor와 donor 용액으로부터 검액을 취하여 각각 정량하였다.
- 2,3) 하지만 levodopa를 transdermal route로 전달할 경우 상기된 경구투여의 여러 문제점을 피할 수 있다. Passive transport로 levodopa와 같은 전하를 띈 물질을 투과 시키는 것은 stratum corneum (SC)이라는 피부 장벽이 존재하기 때문에 효과적이지 못하기 때문에 본 저자들의 지난 연구에서는 피부를 투과하는 약물의 양을 증가시키기 위해 iontophoresis를 적용하였다.4) Iontophoresis는 약한 전류를 흘려주어 스킨을 통하여 이동하는 ion의 양을 증가시켜주는 방법이다.
- 6에 전류의 흐름을 규칙적으로 끊어주는 pulse type의 anodal current를 적용시키고 피부투과량의 변화를 조사한 결과가 나타나 있다. Passive를 제외한 3 가지 경우 총 전류 적용 시간을 4 시간으로 같게 하였으며 전류 적용 후 단순확산에 의한 투과가 계속 일어나도록 하였고 전체 투과실험 시간은 10 시간으로 하였다. 1 시간 동안 전류를 적용하고 1 시간 동안 전류를 끊는 cycle을 4번 반복한 경우 (1 hr on/off) 10 시간 후의 총 피부투과량은 49 µg/ cm2으로 나타나 단순확산인 경우에 비해 약 9 µg/ cm2정도 크게 나타났다.
- 79 cm2의 side-by-side diffusion cell을 사용하여 33℃ incubator에서 실시하였다. Side-by-side diffusion cell 사이에 무모생쥐 피부를 clamp로 고정시킨 후 donor cell에는 약물용액(pH 1.0 또는 2.5)을 receptor cell에는 70 mM 인산완충액 용액(pH 7.4)을 채운 다음 Ag/AgCl 전극과 spin bar를 각 cell에 넣어 실험을 실시하였다. 1 시간마다 receptor cell의 용액을 각각 모두 취해 검액으로 사용하였고, 즉시 새로운 인산완충액 용액을 receptor cell 에 채워 넣었다.
- 그 후 receptor와 donor 용액으로부터 검액을 취하여 각각 정량하였다. 또 피부 내 levodopa의 양을 알아보기 위하여 피부투과실험이 끝난 피부를 취하여 피부 표면에 남은 약물을 에탄올과 완충용액으로 씻어낸 다음 약물 용액과 접촉했던 피부 부분을 적출하였다. 피부를 잘게 잘라 에탄올 5 mL를 가하고 homogenizer로 5 분 간 분쇄하고 이를 1000 rpm으로 5분간 원심 분리한 후 상층액을 여과한 여액을 인산완충용액으로 희석하여 HPLC로 정량하였다.
- 무모생쥐 피부에 levodopa를 함유하는 8% HPC 하이드로겔(pH 1.0 또는 2.5) 100 µL를 점적하고 판상전극 (Sn/ SnCl2)를 얹은 후 Anodal 전류를 0.2/ 0.4/ 0.6 mA/ cm2의세기로 적용하여 투과실험을 실시하였다.
- 5 에서는 dextrose를 첨가한 경우에도 24 시간 후에 약물이 30%이상 분해된 것으로 나타나 높은 pH 조건에서는 dextrose의 안정화 효과가 없는 것을 알 수 있었다. 본 연구에서는 pH 1.0의 낮은 pH 조건에서 연구하므로 dextrose의 첨가 없이도 levodopa가 안정하다고 생각되지만 추가로 인산완충액에 dextrose를 첨가하여 보다 확실히 levodopa의 안정성을 확보하여 실험에 사용하였다. pH 1.
- 24-26) 본 실험에서는 HPC (hydroxypropyl Cellulose)를 사용하였다. 인산완충액 (pH 1.0)에 약물을 용해시킨 후 (10 mg/mL) HPC 8% (w/w)를 녹여 실험을 실시하였다. 하이드로겔을 이용한 실험에서도 용액의 경우에서와 마찬가지로 pH가 1.
- 전극의 극성이 피부투과량에 미치는 영향을 조사하기 위해 donor cell에 농도 5 mg/mL 인 수용액 상태의 약물을 넣고 0.4 mA/ cm2의 전류를 6 시간 적용 하였으며 그 후 확산에 의한 passive delivery를 4 시간 동안 더 관찰하였는데 그 결과가 Fig. 3 (pH 1.0) 및 Fig. 4 (pH 2.5)에 나타나 있다. Fig.
- 피부투과 중 약물의 대사 또는 축적의 가능성을 조사하기 위하여 투과실험을 실시하였고 donor 및 receptor cell, 그리고 피부 내에 있는 levodopa의 양을 조사하였다. Levodopa 용액(10 mg/mL)을 donor cell에 phosphate buffer를 receptor cell에 넣은 후 0.
대상 데이터
- In vitro flux 실험에는 유일과학(Pusan, Korea)에서 제조한 side by side diffusion cell, Variamag사(Mnchen, Germany)의 multistirrer (Electronicruhrer Poly 15), 항온조절이 가능한 Jeio Tech. (Ansan, Korea)의 incubator (SI-900)를 사용하였다. DC power supply로는 Power Tech (Ansan, Korea)의 model number PT 70-10MDC를 사용하였다.
- 특히 iontophoretic delivery에 사용할 경우 하이드로겔의 높은 함수율로 전도성이 증가하여 iontophoresis의 효과가 상승하게 된다.24-26) 본 실험에서는 HPC (hydroxypropyl Cellulose)를 사용하였다. 인산완충액 (pH 1.
- (Ansan, Korea)의 incubator (SI-900)를 사용하였다. DC power supply로는 Power Tech (Ansan, Korea)의 model number PT 70-10MDC를 사용하였다. Homogenizer는 IKA Works (Germany)T 25 digital ULTRA-TURRAX를 사용하였다.
- 0 mL/min을 유지하였으며 injection volume은 30 µL였다. Detector로는 UV를 사용하였으며 280 nm 에서의 흡광도를 측정하여 정량하였다.
- Electrode로는 막대기형 Ag/AgCl 전극과 판상의 Sn/SnCl2전극을 제작하여 사용하였으며 막대기형 전극은 Aldrich사 (Milwaukee, WI, U.S.A.)의 Ag wire (99.9%, 직경 1 mm) 한쪽 끝 부분을 AgCl (Aldrich사) 용융액에 수회 침적시켜 제조하였다. 판상의 Sn/SnCl2전극은 polyester film 위에 30 µm 두께로 Sn 입자(덕산이화학, Seoul, Korea)를 입힌 다음 이를 산화시켜 제조하였다.
- HPLC system으로 Shimadzu사 (Tokyo, Japan)의 CBM-10A system과 SIL-10A auto injector가 사용 되었고, 칼럼으로는 Waters사(Milford, USA)의 Atlantis 5 µm dc18 (4.6 × 150 mm)을 사용하였으며 oven의 온도는 33℃를 유지하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며, sodium chloride는 덕산이화학(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용된 증류수는 Barnstead사(Dubuque, Iowa, USA)의 Nanopure ultrapure water system (D11921)을 사용하여 제조하였으며, HPLC에서 mobile phase를 만드는데 사용한 acetonitrile(HPLC grade)는 덕산이화학(Seoul, Korea)에서 ammonium formate는 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 하이드로겔을 만드는데 사용한 HPC (hydroxypropyl cellulose)는 Sigma사 (St.
- Levodopa 는 ㈜한국유나이티드 제약(Seoul, Korea)에서 제공받았다. 완충액의 제조에 사용된 sodium phosphate monobasic 및 dextrose는 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며, sodium chloride는 덕산이화학(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용된 증류수는 Barnstead사(Dubuque, Iowa, USA)의 Nanopure ultrapure water system (D11921)을 사용하여 제조하였으며, HPLC에서 mobile phase를 만드는데 사용한 acetonitrile(HPLC grade)는 덕산이화학(Seoul, Korea)에서 ammonium formate는 Sigma사(St.
- 판상의 Sn/SnCl2전극은 polyester film 위에 30 µm 두께로 Sn 입자(덕산이화학, Seoul, Korea)를 입힌 다음 이를 산화시켜 제조하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 하이드로겔을 만드는데 사용한 HPC (hydroxypropyl cellulose)는 Sigma사 (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. In vitro flux 실험에는 유일과학(Pusan, Korea)에서 제조한 side by side diffusion cell, Variamag사(Mnchen, Germany)의 multistirrer (Electronicruhrer Poly 15), 항온조절이 가능한 Jeio Tech.
성능/효과
- 0.2 mA/ cm2의 전류를 적용하였을 경우 passive보다 약 7 µg/ cm2의 약물이 많이 투과되어 큰 효과가 없었지만, 0.4 및 0.6 mA/ cm2의 전류를 적용한 경우 단순 확산에 의한 약물 투과보다 약 2 배 및 3.5 배로 증가하였다.
- 1 시간 동안 전류를 적용하고 1 시간 동안 전류를 끊는 cycle을 4번 반복한 경우 (1 hr on/off) 10 시간 후의 총 피부투과량은 49 µg/ cm2으로 나타나 단순확산인 경우에 비해 약 9 µg/ cm2정도 크게 나타났다.
- 1)는 Parkinson’s disease의 치료에 이용되는 효과적인 약물이다.1) 분자량이 197 g/mol로 비교적 작고, zwitterion으로 낮은 pH에서 양하전, 높은 pH에서 음하전을 나타낸다. Dopamine 자체는 blood-brain-barrier (BBB)를 통과하지 못하지만 levodopa는 dopamine의 전구물질로 BBB를 통과할 수 있으며, 통과 후 뇌에서 decarboxylation되어 dopamine으로 전환된다.
- 10 시간 동안의 총 약물 투과량이 anodal delivery에서는 57 µg/ cm2, cathodal delivery에서는 45 µg/ cm2로 passive에 의한 약물의 투과보다 각각 1.8 배 및 1.5 배 높은 투과를 보였다.
- 5)에서 levodopa의 시간에 따른 안정성 및 dextrose의 첨가 시 안정화 효과를 조사하였다.4) 그 결과를 보면 pH 2.5의 인산완충액에서는 24 시간 까지 약물의 분해가 거의 일어나지 않아 안정한 것으로 나타났으며 pH 4.5에서 5% dextrose를 첨가한 경우 levodopa의 안정성이 24 시간 까지 유지되어 dextrose의 안정화 효과를 확인할 수 있었으나 pH 9.5 에서는 dextrose를 첨가한 경우에도 24 시간 후에 약물이 30%이상 분해된 것으로 나타나 높은 pH 조건에서는 dextrose의 안정화 효과가 없는 것을 알 수 있었다. 본 연구에서는 pH 1.
- Levodopa가 약 50% 양전하를 가지고 있는 pH 2.5 에서의 지난 연구의 결과를 보면 passive delivery와 cathodal delivery는 미미하고 anodal delivery는 크게 나타날 것으로 예상되었으나 예상과는 달리 cathodal delivery가 anodal 및 passive delivery 보다 약간 우세한 것으로 나타났으며 예상 밖으로 매우 큰 passive flux가 관찰되었다 또한 pH (2.5 & 4.5)에 따라 electroosmosis의 방향이 변화되며 electrorepusion의 효과와 복합적으로 작용하여 투과도에 영향을 미침을 알았다.
- 피부투과 중 약물의 축적 또는 대사의 가능성을 조사하기 위하여 피부투과 실험을 120, 240, 300 분 동안 실시하였고 그 후 피부, donor 및 receptor 용액 내의 약물의 양을 조사한 결과가 Table I에 나타나 있다. Receptor, donor 및 skin에서 확인된 총 약물의 합이 donor쪽에 초기에 넣은 양과 거의 일치하는 값을 나타내 피부투과 실험 중 소실되는 약물은 미미함을 알았다. 120 분 동안 전류를 적용했을 때 피부 내의 약물의 양은 약 500 µg/mL 였는데 4 시간 전류 적용 후의 피부 내의 잔류량 (317 µg/mL)은 오히려 감소하였고 5 시간 후에는 198 µg/mL으로 더욱 감소하였다.
- 또한 이 실험은 피부에 적용된 하이드로겔 0.1 mL 내에 약물의 농도가 5 mg이 되게 하여 얻은 결과인데 10 시간 동안 누적투과량이 68 µg/ cm2를 나타내 하이드로겔 내에 10 mg을 함유시킨 경우에 얻은 값인 108 µg/ cm2에 비해 작은 값을 얻어 약물의 농도가 클수록 더 많은 양이 투과됨을 알았다.
- 5 에서의 결과와는 반대로 anodal delivery가 cathodal delivery에 비해 크게 나타났다고 판단된다. 본 연구에서 피부를 통한 levodopa의 투과를 보다 자세히 고찰해 보면 electrorepusion과 electroosmosis 간의 투과에 대한 역할의 크기가 pH의 변화에 의존함을 알 수 있다. 피부의 전기가 흐르는 통로의 등전점은 포유동물 피부의 경우 3.
- 이 같은 결과는 연속적으로 전류를 적용하는 것이 펄스 형태로 동일 시간 전류를 적용하는 경우보다 피부투과에 있어 더 유리함을 말해주고 있는데 이는 전류의 연속적용에 따른 피부의 투과에 대한 저항이 크게 감소함에 기인된다고 사료된다. 피부의 전기저항은 피부의 손상 또는 투과도의 지표로 볼 수 있는데 Oh et al.
- 5 배 높은 투과를 보였다. 이 결과를 보면 전류의 적용에 의해 levodopa의 피부투과는 증가하였지만 총투과량 중 passive에 의한 투과비율이 50% 이상을 차지하고 있어 passive 투과가 큰 비중을 차지하고 있음을 알려주고 있다. 한편 pH 2.
- 5)에 따라 electroosmosis의 방향이 변화되며 electrorepusion의 효과와 복합적으로 작용하여 투과도에 영향을 미침을 알았다. 이러한 연구 결과는 levodopa의 이온토포레시스는 한 가지 전하만을 가진 물질의 경우에 비해 매우 복잡하며 pH에 따라 electoosmosis와 electrorepulsion의 역할 및 그 크기가 변화되어 투과에 영향을 미침을 알려주었다.5) 이에 본 연구에서는 pH를 더 낮추어 levodopa가 100% 양이온 상태가 될 수 있는 pH 1.
- 0 인 본 연구의 결과를 비교해 보면 보다 명확히 알 수 있다. 즉 본 연구의 결과는 pH 2.5 에서는 electro-attraction에 의한 투과억제효과보다 electroosmosis에 의한 투과증진효과가 더 크게 나타나서 cathodal delivery 가 anodal delivery 보다 크게 나타난 것이고 pH 1.0 에서는 그 경향이 역전되어 electroosmosis에 의한 투과어제효과 보다 electrepulsion에 의한 투과증진효과가 더 크게 나타남을 알려주고 있다. 약물의 농도와 pH를 고정한 상태로 전류의 세기에 따른 anodal delivery의 약물 투과량이 Fig.
- 보다 구체적인 이해를 하기 위해서는 향후 투과기전에 대한 보다 구체적인 연구가 더 진행 되어야 할 것으로 사료된다. 한편 본 실험에서의 passive 투과 결과를 보면 일반적인 단순확산의 경우와 달리 신속히 피부투과가 이루어 졌으며 이 같은 결과는 초기의 신속한 levodopa 피부 축적과 잘 일치함을 알 수 있다.
- 그러나 zwitterion 인 경우와는 달리 anodal delivery 가 cathodal delivery 보다 크게 나타났으며 이는 levodopa 의 투과에 있어 electroosmosis 보다 electrorepulsion 이 주된 역할을 하고 있음을 알려주고 있다. 한편 피부투과량은 용액이나 하이드로겔 모두에서 전류세기가 증가할수록 증가하였고 같은 양의 전류를 적용하였을 때 전류를 연속적으로 적용하는 것이 간헐적으로 적용하는 것보다 유리함을 알았다.
후속연구
- 10 시간 동안 누적투과량이 passive의 경우 83 µg/ cm2를 나타내었고 anodal delivery의 경우는 108 µg/ cm2 , cathodal delivery의 경우 99 µg/ cm2를 나타내 passive 인 경우 보다 각각 25 µg/ cm2 및 16 µg/ cm2 높은 값을 나타내었다. Donor 층으로 용액을 사용하였을 때에 비해 하이드로겔을 사용한 경우에 더 큰 총투과량을 보였는데 보다 자세한 이해를 위해서는 더 많은 연구가 필요하다고 생각된다. Fig.
- 양이온을 띄고 있는 levodopa가 단순확산에 의해서 피부 내로 침투하여 단시간 내에 이와 같이 다량이 피부에 존재한다고 보기는 힘들다고 판단되며 피부 내에 어떤 transport system 또는 결합부위가 존재하고 있을 가능성을 알려준다고 판단된다. 보다 구체적인 이해를 하기 위해서는 향후 투과기전에 대한 보다 구체적인 연구가 더 진행 되어야 할 것으로 사료된다. 한편 본 실험에서의 passive 투과 결과를 보면 일반적인 단순확산의 경우와 달리 신속히 피부투과가 이루어 졌으며 이 같은 결과는 초기의 신속한 levodopa 피부 축적과 잘 일치함을 알 수 있다.
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