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문제 정의
- 또한 시료에 존재하는 미생물의 종류에 따라 결과가 달라지기 때문에, 실험의 재현성이 떨어지고, 표준화시키기 어려운 단점이 있어, 산업폐수 처리 방류수의 생태독성 측정법으로 적합하지 않았다. 따라서 본 연구에서는 탈수소효소를 이용한 생태 독성평가법의 단점을 보완하고 이를 폐수시설 방류수의 독성평가에 사용하기 위하여, 처리 시간, 완충용액의 조성 등 독성 평가에 필요한 조건을 최적화시켜 표준화된 평가법을 만들고자 하였다.
- 탈수소효소 활성 저해도를 이용하여 중금속의 생태 독성을 측정하는 방법을 표준화하기 위해 독성 측정을 위한 조건을 최적화하기 위한 실험을 수행하였다. 조건은 세균의 접종 농도, 반응 완충용액의 종류, 독성물질과 효소의 반응시간 및 효소와 기질의 반응시간이다.
제안 방법
- 효소 저해법은 측정 방법에 따라 크게 두 종류로 나뉜다. 첫 번째 방법은 정제된 효소를 사용하는 것으로 독성물질이 효소에 직접적으로 작용하여 효소 활성이 저해되는 정도를 측정하는 것이며(Hamers et al., 2000), 두 번째 방법은 생물체를 사용하는 것으로 독성물질에 의해 손상된 생물 체내에 포함된 특정 효소의 활성 저해도를 측정하는 것이다. (Caravelli et al.
- 탈수소효소 활성이 뛰어나고 중금속에 대해 민감하게 반응하는 세균을 선정하기 위하여, Escherichia coli HB101, Enterobacter asburiae KCAD-4와 Aeromonas media KCAD- 13를 사용하였다. KCAD-4와 KCAD-13은 산업 폐수 처리시설의 생물반응조에서 분리된 것이다(오경희 등, 2008).
- 0)로 2회 반복 세척하였다. 이를 증류수로 희석한 후, 분광광도계를 이용하여 600 nm에서 흡광도(optical density at 600 nm, OD600) 를 측정하여 세균을 정량하였다. 흡광도가 1.
- 탈수소효소를 이용한 독성 평가법을 최적화시키기 위하여 기질의 종류, 완충용액의 종류, 접종 세균의 농도, 독성물질과 세균의 접촉시간 및 세균과 기질의 반응시간을 변화시켰다. 기질은 INT(0.
- 접종 세균의 농도는 OD600 을 기준으로 최종농도 1~10의 범위로 사용하였다. 세균과 독성물질의 반응시간은 10~60분의 범위에서 평가하였으며, 손상된 세균과 기질의 접촉시간은 0~240 분의 범위로 변화시켰다. 효소의 활성도를 유지하는데 적합한 완충용액을 선정하기 위해 증류수, phosphate bufffer(0.
- 세균과 독성물질의 반응시간은 10~60분의 범위에서 평가하였으며, 손상된 세균과 기질의 접촉시간은 0~240 분의 범위로 변화시켰다. 효소의 활성도를 유지하는데 적합한 완충용액을 선정하기 위해 증류수, phosphate bufffer(0.1 M, pH 7.0)와 Tris-buffer(0.01 M, pH 7.0)를 각각 사용하였다.
- 원심 분리관에 완충용액(0.4 mL)과 세균 용액(0.1 mL)을넣고 섞어준 후, 독성물질이 포함된 용액(0.5 mL)을 넣고 항온 교반 수조(37℃, 150rpm)에서 일정시간(10~60분) 동안 접촉하였다. 반응 후 기질 용액(0.
- 흡광도이다. 각 조건에서 대사 저해율과 독성물질의 농도의 관계를 구한 후, 효소의 활성이 50% 저해되는 농도(Half maximal effective concentration, EC50)를 구하여, 각 조건에서 독성물질에 대한 탈수소효소의 민감도를 평가하였다. EC50이작을수록 독성물질에 대한 민감도가 높음을 의미한다.
- 탈수소효소의 기질로 INT 와 TTC 를 사용하여 효소의 활성도를 비교하였다. E.
- 접종 세균의 농도(OD600)를 1~10 범위로 변화시켰으며, 각 농도에서 독성물질에 대한 탈수소효소 활성 저해도를 측정하였다. 독성물질을 첨가하지 않았을 때, 세균의 농도와 formazan 의 생성 정도는 양의 상관관계를 나타내었다 (Fig.
- 독성물질에 의해 활성이 저해된 효소와 기질의 반응 시간을 최적화하기 위해 20분 동안 독성물질과 접촉시킨 후, 기질인 INT 를 첨가하여 10~240분까지 반응을 시켜 효소 활성도 변화를 측정하였다(Fig. 4(b)).
- 따라서 독성물질에 의한 효소의 저해도를 판단할 때, 손상된 효소와 기질의 반응 시간은 120분이 적합한 것으로 보인다. 본 연구에서는 이상의 결과로부터 세균과 독성물질의 반응 시간은 20분으로 설정하였으며, 손상된 효소와 기질의 반응시간은 120분으로 설정하였다.
- 먹는 물 수질환경기준에서 규정하고 있는 11종의 중금속에 대하여, 본 연구에서 개발된 방법을 사용하여 탈수소효소의 활성에 대한 저해도를 평가하였다. 평가 결과, 중금속의 종류에 따라 효소에 대한 반응 양상이 달랐으며, 크게 세 가지 양상으로 나눌 수 있었다(Fig.
대상 데이터
- 탈수소효소의 활성도를 측정하는데 사용한 기질 (INT 와 TTC)은 Sigma-Aldrich Co. (USA)에서 구매하였으며, 중금속이 포함된 화합물(Table 1)은 Wako Chemical Co. (Japan) 에서 순도 99% 이상인 것을 구매하여 사용하였다. 실험에 사용한 중금속은 먹는 물 수질환경기준의 건강상 유해영향 무기물질에 규정된 11종을 선정하였다(Table 1).
- (Japan) 에서 순도 99% 이상인 것을 구매하여 사용하였다. 실험에 사용한 중금속은 먹는 물 수질환경기준의 건강상 유해영향 무기물질에 규정된 11종을 선정하였다(Table 1). 중금속 용액은 중금속이 포함된 화합물을 증류수에 녹여 제조하였으며, 중금속의 농도는 0.
- 실험에 사용한 중금속은 먹는 물 수질환경기준의 건강상 유해영향 무기물질에 규정된 11종을 선정하였다(Table 1). 중금속 용액은 중금속이 포함된 화합물을 증류수에 녹여 제조하였으며, 중금속의 농도는 0.001~500 mg/L의 범위를 사용하였다.
- 기질은 INT(0.1%, w/v)와 TTC (1%, w/v)를 사용하였으며, 각각을 증류수에 녹여 제조하였다. 접종 세균의 농도는 OD600 을 기준으로 최종농도 1~10의 범위로 사용하였다.
- 세균의 종류에 따른 독성물질에 대한 민감도를 평가하기 위하여, E. coli HB101과 KCAD-4, KCAD-13을 사용하였고, 독성물질은 구리를 0~500 mg/L의 범위로 사용하였다. 탈수소효소의 활성이 완전히 저해되는 구리의 농도는 E.
성능/효과
- , 2004). 따라서, 탈수소효소의 활성도 변화를 측정하여 세포의 손상 여부를 확인할 수 있으며, 이를 통하여 시료 중 독성물질의 존재 여부를 확인할 수 있다. 탈수소효소의 활성도는 tetrazolium 염이 환원되는 정도로 측정할 수 있으며, 기질로는 INT(2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5- phenyl-tetrazolium chloride)와 TTC (2, 3, 5-triphenyl-tetrazo- lium chloride)가 가장 널리 사용된다(Gong et al.
- coli HB101의 경우, INT를 기질로 사용하여 formazan을 생성하였으나, TTC를 기질로 사용할 경우 6시간의 배양 후에도 TTC-formazan 이 생성되지 않았다. KCAD-4는 E. coli 와 달리 TTC를 기질로 사용할 수 있었으나, 시간당 기질의 전환율이 INT를 사용했을 때에 비해 매우 낮은 것으로 나타났다(Fig. 1). 또한, 기질로 사용한 TTC의 농도는 1.
- 1). 또한, 기질로 사용한 TTC의 농도는 1.0%(w/v)로 INT(0.1%, w/v)에 비해 10배가 높았으나 기질 전환율은 매우 낮았다. 이러한 결과는 INT 가 탈수소효소의 기질로 적합함을 의미한다.
- 이러한 차이는 본 연구의결과와 같이 미생물의 종류에 따라 INT 와 TTC 에 대한 기질 친화도가 다르기 때문에 일어나는 것으로 사료된다. 본 연구에 사용한 세균의 경우, TTC에 비해 INT의 기질 전환율이 높으며, INT를 사용할 경우 탈산소화와 같은 전처리가 필요 없기 때문에 이를 기질로 사용하는 것이 적합한 것으로 판단된다.
- coli 의 민감도가 가장 떨어짐을 의미한다. KCAD-13 이 KCAD-4에 비해 독성물질에 대한 민감도가 약간 높았으나, 독성물질을 첨가하지 않은 시료에서 두 세균에 대한 측정 조건이 동일할 때, KCAD-4 가 KCAD-13에 비해 formazan 의 생성량이 약 1.4 배 높았다(Fig. 2). 독성물질을 첨가하지 않았을 때 formazan 생성량이 많은 것은 탈수소효소 활성이 높음을 의미하며, 독성물질을 첨가할 때와 첨가하지 않았을 때 결과의 차이가 확실하게 나타나기 때문에, 독성물질에 의한 효소 활성 저해 정도를 쉽게 측정할 수 있다.
- 독성물질을 첨가하지 않았을 때 formazan 생성량이 많은 것은 탈수소효소 활성이 높음을 의미하며, 독성물질을 첨가할 때와 첨가하지 않았을 때 결과의 차이가 확실하게 나타나기 때문에, 독성물질에 의한 효소 활성 저해 정도를 쉽게 측정할 수 있다. 또한 KCAD-4와 KCAD-13 을 대상으로 세균의 성장 단계에 따른 독성물질에 대한 민감도를 측정한 결과, KCAD-13은 성장 단계에 따라 민감도의 변이가 큰 반면, KCAD-4는 거의 유사한 민감도를 나타내었다(결과 미제시). 따라서 탈수소효소를 이용한 독성 평가에 KCAD-4 가 가장 적합한 것으로 판단되었다.
- 또한 KCAD-4와 KCAD-13 을 대상으로 세균의 성장 단계에 따른 독성물질에 대한 민감도를 측정한 결과, KCAD-13은 성장 단계에 따라 민감도의 변이가 큰 반면, KCAD-4는 거의 유사한 민감도를 나타내었다(결과 미제시). 따라서 탈수소효소를 이용한 독성 평가에 KCAD-4 가 가장 적합한 것으로 판단되었다.
- 001). 초기 세균 농도가 OD600=10 또는 8이었을 때, Cu에 대한 세균의 EC50은 각각 0.11, 또는 0.14 mg/L로 높은 값이 측정되었으며, OD600=6 인 경우에도 EC50이 0.055 mg/L로 비교적 높게 측정되었다 (Fig. 3). EC50 값이 높은 것은 세균의 민감도가 떨어짐을 나타내므로 OD600=6 이상의 농도를 사용하는 것은 독성 평가 시 적합하지 않은 것으로 판단된다.
- 5 배가 높아 OD600=4 가 적합한 것으로 판단된다. 따라서 후속 실험에서는 세균의 초기 농도를 OD600=4를 사용하였으며, OD600=4 일 때 세균의 농도를 측정한 결과 5.4x109 CFU/mL 이었다.
- 증류수와 Tris-buffer 또는 phosphate buffer를 사용하여 탈수소효소의 반응 정도를 비교한 결과, 증류수를 사용하거나 Tris-buffer 를 사용하였을 때 효소의 활성도가 매우 낮았다(Fig. 4(a)).
- Phosphate buffer의 경우에는 높은 효소 활성에 의해 발색되는 정도가 매우 높았다. 이러한 결과로부터 탈수소효소를 이용한 독성 평가시 phosphate buffer가 가장 적합한 것으로 판단되었다.
- 독성물질과 세균의 접촉시간을 10~60분까지 10분 단위로 조절하여 독성물질에 대한 반응도를 측정한 결과, 접촉 시간이 길어질수록 효소 활성도가 약간씩 감소하는 것으로 나타났다. 하지만 20분 이상을 처리한 시료에서는 효소 활성 저해 도가 거의 변화가 없었으며, 20분 처리한 시료와 60분 처리한 시료의 활성도의 차이는 4.
- 3%에 불과하였다(결과 미제시). 따라서 독성 물질에 의한 효소 활성의 저해 정도를 유지시키고 독성 측정에 필요한 시간을 단축시키기 위해, 독성물질과 세균의 접촉 시간은 20분이 적합한 것으로 판단되었다.
- 10 mg/L로 하였을 때, 60분까지는 시간이 증가함에 따라 생성되는 INT-formazan의 양이 서서히 증가하였으나, 이후 큰 변화가 없었다. 구리의 농도가 0.05 mg/L일 경우에는 더 큰 폭으로 INT-formazan 의 양이 증가하였으며 90분까지 농도가 증가하며 그 이후 안정화되었다. 이러한 결과는 독성물질의 농도가 높을 때에는 효소의 활성이 빠른 시간에 정점에 도달하는 반면, 독성 물질의 농도가 낮을 때에는 효소의 활성을 평가하기 위해 긴 시간이 필요함을 의미한다.
- 이러한 결과는 독성물질의 농도가 높을 때에는 효소의 활성이 빠른 시간에 정점에 도달하는 반면, 독성 물질의 농도가 낮을 때에는 효소의 활성을 평가하기 위해 긴 시간이 필요함을 의미한다. 따라서 독성물질에 의한 효소의 저해도를 판단할 때, 손상된 효소와 기질의 반응 시간은 120분이 적합한 것으로 보인다. 본 연구에서는 이상의 결과로부터 세균과 독성물질의 반응 시간은 20분으로 설정하였으며, 손상된 효소와 기질의 반응시간은 120분으로 설정하였다.
- 활성에 대한 저해도를 평가하였다. 평가 결과, 중금속의 종류에 따라 효소에 대한 반응 양상이 달랐으며, 크게 세 가지 양상으로 나눌 수 있었다(Fig. 5(a)).
- 5(a)). 구리(Cu), 수은(Hg), 아연(Zn), 카드뮴(Cd), 셀레늄(Se) 및 망간(Mn)의 경우에는 민감도의 차이는 있으나, 중금속의 농도가 증가함에 따라 효소 활성도가 감소하는 경향이 나타났다. 반면 철 (Fe) 의 경우에는 농도가 증가함에 따라 효소 활성도가 증가하여, Fe가 효소를 저해하는 것이 아니라 오히려 효소 기능을 촉진시키는 것으로 보인다.
- 크롬(Cr), 납(Pb), 비소(As) 및 알루미늄(Al)의 경우에는 독성물질의 농도가 증가함에 따라 뚜렷한 활성도 변화가 관찰되지 않았다. KCAD-4 의 탈수소효소 활성을 저해하는 6 종의 중금속의 EC50을 비교한 결과, 구리와 망간을 제외하고, 나머지 중금속의 경우 EC50이 6.3~73 mg/L의 범위로 매우 높았다(Fig. 5(b)).
- 본 연구에서 사용한 KCAD-4 는 구리에 대하여 민감한 세균을 screening하는 과정에서 선택한 것이기 때문에, 구리에 특이적으로 민감하며 다른 종류의 중금속에 의한 손상이 적은 것으로 보인다. 본 실험실에서 행한 후속 연구에서 하수처리시설의 생물 반응조로부터 분리된 세균이 수은(Hg) 에 대해 특이적으로 손상을 받는 것을 확인하였다(결과 미제시). 따라서 각각의 중금속에 의하여 특이적으로 손상되는 세균을 분리한 후, 본 연구에서 표준화한 독성 평가법을 활용한다면 중금속에 의한 생태독성 평가가 가능할 것으로 판단된다.
- 1) 독성물질에 의해 손상된 세균의 탈수소효소 활성 저해도를 이용하여 생태독성을 평가할 때, INT를 기질로 사용하는 것이 가장 적합하였다. 본 연구에서 탈수소효소의 활성 저해도를 평가하기 위한 반응 조건을 최적화한 결과, 접종 세균의 농도는 5.
- 것이 가장 적합하였다. 본 연구에서 탈수소효소의 활성 저해도를 평가하기 위한 반응 조건을 최적화한 결과, 접종 세균의 농도는 5.4x109 CFU/mL(OD6oo=4)이 적합하였으며, 반응 완충용액으로 phosphate buffer를 사용하였을 때 효소의 활성이 가장 뛰어났다. 세균과 독성물질의 접촉시간은 20분이 가장 적합하였으며, 저해된 효소가 기질과 반응하는 시간은 120분이 적절한 것으로 판단되었다.
- 4x109 CFU/mL(OD6oo=4)이 적합하였으며, 반응 완충용액으로 phosphate buffer를 사용하였을 때 효소의 활성이 가장 뛰어났다. 세균과 독성물질의 접촉시간은 20분이 가장 적합하였으며, 저해된 효소가 기질과 반응하는 시간은 120분이 적절한 것으로 판단되었다.
- 2) 산업폐수 처리시설의 생물 반응조에서 분리된 KCAD-4 균주의 구리에 대한 EC50은 ~0.04 mg/L로 구리에 대해 매우 민감하게 반응하는 것으로 나타나, 구리를 포함한 산업 폐수 방류수의 생태독성 측정에 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 3) 11종의 중금속에 대하여 KCAD-4 세균의 민감도를 평가한 결과, 중금속에 종류에 따라 민감도가 달랐으며, 구리 이외의 중금속에 대해서는 민감하게 반응하지 않아 이들 물질에 의한 생태독성을 평가하기에는 적합하지 않은 것으로 판단된다. 하지만, 각각의 중금속에 민감한 세균을 분리한 후, 본 연구에서 표준화된 생태 독성측정법을 적용한다면, 산업폐수 방류수에 포함된 환경오염물질의 생태독성을 평가할 수 있을 것으로 사료된다.
후속연구
- 본 실험실에서 행한 후속 연구에서 하수처리시설의 생물 반응조로부터 분리된 세균이 수은(Hg) 에 대해 특이적으로 손상을 받는 것을 확인하였다(결과 미제시). 따라서 각각의 중금속에 의하여 특이적으로 손상되는 세균을 분리한 후, 본 연구에서 표준화한 독성 평가법을 활용한다면 중금속에 의한 생태독성 평가가 가능할 것으로 판단된다.
- 않은 것으로 판단된다. 하지만, 각각의 중금속에 민감한 세균을 분리한 후, 본 연구에서 표준화된 생태 독성측정법을 적용한다면, 산업폐수 방류수에 포함된 환경오염물질의 생태독성을 평가할 수 있을 것으로 사료된다.
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