We investigated the cleavage rate and blastocyst yield for each culture condition to enhance tolerance of cryo-preservation of bovine IVF embryo with relatively lower cryo-tolerance compared to in vivo embryo. The cleavage rate and blastocysts yield for CR1aa, IVMD, IVD, CR1aa+10% FBS were 73.2, 69....
We investigated the cleavage rate and blastocyst yield for each culture condition to enhance tolerance of cryo-preservation of bovine IVF embryo with relatively lower cryo-tolerance compared to in vivo embryo. The cleavage rate and blastocysts yield for CR1aa, IVMD, IVD, CR1aa+10% FBS were 73.2, 69.3, 72.8, 68.5% and 44.1, 30.8, 33.3, 48.0%, respectively. The values did not differ among each treatments without serum. For embryo vitrification, In vivo and In vitro blastocysts were exposed to VS1(10% glycerin, 0.1 M glucose, 0.1 M sucrose, PEG 1%) for 5 min, and VS2 (10% glycerin, 10% EG, 0.2 M glucose, 0.2 M sucrose, PEG 2%) for 5 min and then VS3 (10% glycerin, 30% EG, 0.3 M glucose, 0.3 M sucrose, PEG 3%) for 1 min. The exposed embryos were then loaded into the 0.25 ml plastic straws and then plunged into liquid nitrogen. The straws were held for period of 1 to 2 weeks before thawing. In embryo viability, no differences in blastocyst re-expansion rates were found between in vivo and in vitro embryos. whereas expansion-BL rates was significantly higher for in vivo-derived embryos (72.7%) when compared to in vitro-derived embryos (51.4%), respectively (P<0.05). In conclusion, our results indicate that combined use of CRIaa culture medium with vitrification might enhance tolerance of cryopreservation for bovine IVF embryo production.
We investigated the cleavage rate and blastocyst yield for each culture condition to enhance tolerance of cryo-preservation of bovine IVF embryo with relatively lower cryo-tolerance compared to in vivo embryo. The cleavage rate and blastocysts yield for CR1aa, IVMD, IVD, CR1aa+10% FBS were 73.2, 69.3, 72.8, 68.5% and 44.1, 30.8, 33.3, 48.0%, respectively. The values did not differ among each treatments without serum. For embryo vitrification, In vivo and In vitro blastocysts were exposed to VS1(10% glycerin, 0.1 M glucose, 0.1 M sucrose, PEG 1%) for 5 min, and VS2 (10% glycerin, 10% EG, 0.2 M glucose, 0.2 M sucrose, PEG 2%) for 5 min and then VS3 (10% glycerin, 30% EG, 0.3 M glucose, 0.3 M sucrose, PEG 3%) for 1 min. The exposed embryos were then loaded into the 0.25 ml plastic straws and then plunged into liquid nitrogen. The straws were held for period of 1 to 2 weeks before thawing. In embryo viability, no differences in blastocyst re-expansion rates were found between in vivo and in vitro embryos. whereas expansion-BL rates was significantly higher for in vivo-derived embryos (72.7%) when compared to in vitro-derived embryos (51.4%), respectively (P<0.05). In conclusion, our results indicate that combined use of CRIaa culture medium with vitrification might enhance tolerance of cryopreservation for bovine IVF embryo production.
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문제 정의
이러한 기구들을 사용하는 초자화 동결은 액체 질소와 접촉하는 면에서, 보다 적은 동결 보호제의 양에 수정란을장진하여 유리 상태에 도달하기 위해서 보다 큰 냉각 효율을 얻기 위해서 사용한다(Rios 등, 2010). 따라서 본 연구에서는 체외수정란의 내동성에 영향을 미치는 배양 조건에 따른 발달율과 수정란의 동결에 따른 생존성 조사로 유전 자원으로서 수정란의 효과적인 보존 효율을 조사하고자 실시하였다.
시킬 수 있는 기술력이다. 본 연구에서는 체내수정란보다 상대적으로 내동성이 떨어지는 체외수정란의 동결성을 향상시키기 위하여 수정란의 배양 조건에 따른 분할율과 배반포 발생율을 조사하였다. 각 처리군으로 나누어 실험한 결과는 혈청이 첨가되지 않은 배양액에서는 세가지 처리구인 CRI&a, IVMD, IVD 배양액에서 분할율은 각각 73.
제안 방법
직경이 2~6mm의 난포로부터 난포란을 난포액과 함께 19 gauge 주사침이 부착된 10ml 주사기를 이용하여 흡입 방법으로 난모세포를 채취하였으며, 체외성숙을 위한 난모세포는 1, 2등급(IETS 기준)만을 사용하였다. 체외성숙은 TCM199(Sigma, U.S.A)를 기본 배양액으로 5% fetal bovine serum(FBS, Oib- co, U.S.A), 10 "g/ml LH(Sigma, U.S.A) 및 35 “g/ml FSH (Sigma, U.S.A)를 첨가하여 5% CO2 인큐베이터 내에서 22시간 동안 실시하였다.
25 mg, 6회째에 15 mg을 근육 주사하였고 CIDR를 제거하였다. 발정 징후를 나타내는 공란우는 12시간 간격으로 2회 인공수정을 실시하였다, 인공수정 후 7일째 비외과적인 방법으로 수정란을 채란하여 수정란 동결 실험에 공시하였다.
A)를 첨가하여 7, 8, 9일까지 배양하였다. 배양액 교환은 2일째, 4일째, 6일째 3회 실시하였다. 수정란배양 조건은 38.
5℃ 온도에서 5% CO2, 5% 02 그리고 90% 질소가 포함된 배양 조건에서 수정란을 배양하였다. 분할율은체외수정 후 48시간에 확인하였으며, 3일과 5일째 신선한 배양액으로 배양액 교환을 하였으며, 수정 란은 수정 후 7일과 8 일째 생산된 배반포 수정란을 실험에 공시하였다.
관은 최소 2주간 이상 보관을 실시하였다. 수정란 융해 후 생존율 확인을 위한 수정란 융해는 스트로우를 보관고에서 꺼내어 공기 중에 약 10초간 노출시킨 후 37℃로 가온된 온수에서 약 20초간 융해한 다음, HEPES- Buffer 배양액에 0.13 M sucrose 첨가 배양액에서 5분간, 0.075 M sucrose에서 10분 동안 처리 후 체외배양액으로 옮겨 1회 세척한 다음 배양 48시간과 72시간에 수정 란의 재확장 및 부화 여부로 생존성을 판단하였다.
9% 생리식염수의 온도를 25℃ 이상의 조건으로 맞추어 보온병에 담아 실험실로 2시간 이내로 운반하였다. 직경이 2~6mm의 난포로부터 난포란을 난포액과 함께 19 gauge 주사침이 부착된 10ml 주사기를 이용하여 흡입 방법으로 난모세포를 채취하였으며, 체외성숙을 위한 난모세포는 1, 2등급(IETS 기준)만을 사용하였다. 체외성숙은 TCM199(Sigma, U.
체내수정란 생산을 위해서 한우 공란우의 처리는 발정발현과무관하게 progesterone releasing intravaginal device 인 CIDR (CIDR-plus, InterAg, New Zealand)를 질내에 삽입 하고, CIDR 삽입 7~8일째부터 FSH(Antorin R-10®, Kawasaki, Japan) 28AU를 감량법으로 12시간 간격으로 4일간 나누어서 근육 주사를 실시하였으며, FSH 투여량은 5회째에 PGF2a 제제인 Luta- lyse®(Belgium)를 25 mg, 6회째에 15 mg을 근육 주사하였고 CIDR를 제거하였다. 발정 징후를 나타내는 공란우는 12시간 간격으로 2회 인공수정을 실시하였다, 인공수정 후 7일째 비외과적인 방법으로 수정란을 채란하여 수정란 동결 실험에 공시하였다.
체외배양시 38.5 ℃ 온도에서 5% CO2 조건과 습도가 최적화된 조건에서 난포란을 체외수정 시킨 후 체외배양을 실시하였을 때 수정란의 분할율과 수정란의 배반포 생산 효율을 조사하였다. CRlaa 배양액에서 배양한 난포란의 분할율은 73.
체외배양에 사용된 수정란은 체외수정 후 무혈청 배양액인IVMDQFP, Japan) 배양액은 난구세포와 공동 배양을 실시하여 배양하였으며, CRlaae 배양액에 0.3% bovine serum al- bumin(Sigma, U.S.A)를 첨가하여 7, 8, 9일까지 배양하였다. 배양액 교환은 2일째, 4일째, 6일째 3회 실시하였다.
사용된 정액의 최종 농도는 2x 이었다. 체외성숙된 난포란의 난구세포 일부를 제거하기 위해서 0.1% PVA(polyvinyl alcohol)가 첨가된 D-PBS(Sig- ma) 배 양액에서 약 10초간 vortexing 후 수정 배 양액 인 50 u1 IVF 100(IFP, Japan) 미소적에 약 20개의 체외성숙된 난포란과 정자를 공동배양하여 수정을 유도하였다.
대상 데이터
한우 도축 암소로부터 적출된 난소를 회수하여 실험실로 운반하여 실험에 공시하였다. 본 실험의 조건에 맞춘 난소 수송 온도는 0.
데이터처리
Values within lines that do not have a common letter differ using the ANOVA test(P<0.05).
수정란의 동결 후 체내 및 체외 수정란의 생존율 조사에 대한 결과 비교는 Chi-square Test 방법을 이용하여 유의성 검정 (F<0.05)을 실시하였다.
성능/효과
D 배 양액은 낮은 농도의 glucose, lactate, 성장 인자 그리고 항산화제와 관련된 성분들을 포함하고 있어 수정란의 배반포 발생율을 향상시켰다고 보고하였다. CRlaa 배양액에 10% FBS를첨가한 후 수정란의 체외발달율은 48% 결과를 나타내었다. Aoyagi 등(1999)도 이와 유사한 실험 결과에서 CRIaa+5% CS 을 첨가하였을 때 핵이식의 분할율은 80.
5 ℃ 온도에서 5% CO2 조건과 습도가 최적화된 조건에서 난포란을 체외수정 시킨 후 체외배양을 실시하였을 때 수정란의 분할율과 수정란의 배반포 생산 효율을 조사하였다. CRlaa 배양액에서 배양한 난포란의 분할율은 73.2% 그리고 IVMD 배양액에서는 69.3%의 결과를 보였으며, IVD 배양액에서는 수정율은 72.8% 분할율을 보였다. 그러나 배양액 간의 수정란의 분할율은 유의적인 차이를 보이지 않았다.
8%의 결과를 보였으며, 배반포 발달율은 CRlaa, Ⅳ.MD, IVD 배양액에서 44.1%, 30.8% 그리고 333%의 결과로서 분할율과 배반포 발생율 모두 CRlaa 배양액에서 상대적으로 높은 분할율과 배발달율을 보였다. 혈청이 10% 첨가된 CRlaa 배양액에서의 배반포 발달율도 세가지 처리군과 비교했을 때 유의적인 차이를 보이지 않아 체외배양 시 혈청을 첨가하지 않는 것이 체외수정란 동결을 위해서는 효과적일 것으로 보인다.
본 연구에서는 체내수정란보다 상대적으로 내동성이 떨어지는 체외수정란의 동결성을 향상시키기 위하여 수정란의 배양 조건에 따른 분할율과 배반포 발생율을 조사하였다. 각 처리군으로 나누어 실험한 결과는 혈청이 첨가되지 않은 배양액에서는 세가지 처리구인 CRI&a, IVMD, IVD 배양액에서 분할율은 각각 73.2%, 69.3% 그리고 72.8%의 결과를 보였으며, 배반포 발달율은 CRlaa, Ⅳ.MD, IVD 배양액에서 44.
혈청이 10% 첨가된 CRlaa 배양액에서의 배반포 발달율도 세가지 처리군과 비교했을 때 유의적인 차이를 보이지 않아 체외배양 시 혈청을 첨가하지 않는 것이 체외수정란 동결을 위해서는 효과적일 것으로 보인다. 그리고 체내 및 체외수정란의 초자화 방법으로 동결성 조사를 실시한 결과, 융해 후 수정란의 재형성 비율은 체내수정란 91.7%, 체외수정란은 82.2%의 생존율을 보였으며, 확장 배반포까지 발달율은 72.7%와 51.4%로서 체내수정란이 유의적으로(FV0.05) 높은 결과를 보였다. 이러한 결과를 볼 때 체외수정란 생산을 위해서는 CRlaa 배양액 선정과 초자화 동결 방법으로 동결하였을 때 동결성을 향상시킬 수 있을 것으로 사료된다.
Table 2의 실험에서는 체내 . 외 수정란을 초자화 동결 후에 융해하였을 때 생존성을 조사한 결과로서 체내수정란의 생존성 확인은 동결 후 약 20분후에 수정란이 형태적으로 배반포기 단계의 수정란으로 재형성되는 비율은 91.7%의 결과를 나타내었으며, 수정란이식이 가능한 확장 배반포 단계까지 발달한 비율은 72.7%의 결과를 나타내었다. 그러나 체외수정란의 경우 재확장된 수정란은 82.
05) 높은 결과를 보였다. 이러한 결과를 볼 때 체외수정란 생산을 위해서는 CRlaa 배양액 선정과 초자화 동결 방법으로 동결하였을 때 동결성을 향상시킬 수 있을 것으로 사료된다.
후속연구
체외수정란의 안정적인 생산 시스템은 유전자원의 활용성 제고를 위해서 더 많은 연구가 수행되어야 할 것이며, 특히 수정란 이식을 위해서는 우수한 유전력을 지닌 개체 확보하여 생체내 난자 채취(ovum pick up)후 체외수정란을 생산하기 위해서도 배양 체계에 대한 연구는 지속적으로 연구가 수행되어져야 할 것이다.
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