This study was performed to comprehend the plasma proteins expressed specifically during early pregnancy in pregnant or non-pregnant Hanwoo using proteomic analysis technique. Plasma samples (0, 2, 3, 4, 7, and 11 weeks after AI) were obtained from pregnant (P, n=3) or non-pregnant (NP, n=4) Hanwoo,...
This study was performed to comprehend the plasma proteins expressed specifically during early pregnancy in pregnant or non-pregnant Hanwoo using proteomic analysis technique. Plasma samples (0, 2, 3, 4, 7, and 11 weeks after AI) were obtained from pregnant (P, n=3) or non-pregnant (NP, n=4) Hanwoo, respectively. To evaluate proteins differentially expressed, 2-dimensional electrophoresis (2DE) was conducted. Normalized protein spots were selected for the significant expression variation deviated over two fold in its expression level between two groups; Molecular functions of the proteins were DNA binding, protein binding, hemoglobin binding, ferrochelatase and transporter activity and arylestera, respectively. According to western blotting, haptoglobin was specifically expressed only in NP group during early pregnancy; however, paraoxonase 1 was highly expressed in pregnant group. Based on these results, pregnancy was maintained successfully by the activation of specific plasma proteins associated with immune system and antioxidant regulation during early pregnancy in Hanwoo.
This study was performed to comprehend the plasma proteins expressed specifically during early pregnancy in pregnant or non-pregnant Hanwoo using proteomic analysis technique. Plasma samples (0, 2, 3, 4, 7, and 11 weeks after AI) were obtained from pregnant (P, n=3) or non-pregnant (NP, n=4) Hanwoo, respectively. To evaluate proteins differentially expressed, 2-dimensional electrophoresis (2DE) was conducted. Normalized protein spots were selected for the significant expression variation deviated over two fold in its expression level between two groups; Molecular functions of the proteins were DNA binding, protein binding, hemoglobin binding, ferrochelatase and transporter activity and arylestera, respectively. According to western blotting, haptoglobin was specifically expressed only in NP group during early pregnancy; however, paraoxonase 1 was highly expressed in pregnant group. Based on these results, pregnancy was maintained successfully by the activation of specific plasma proteins associated with immune system and antioxidant regulation during early pregnancy in Hanwoo.
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문제 정의
따라서 본 연구는 임신 또는 비임신된 한우에서 임신 초기 혈장 단백질의 발현 양상을 비교 . 분석하여 임신 초기에 자궁 내 환경 변화를 이해하는데 도움이 되고자 실시하였다.
본 연구는 임신 초기 기간 동안에 임신 또는 비임신된한우의 혈액을 주기적으로 채취하여 혈장을 분리한 다음, 이들 간에 특이적으로 발현 차이를 보이는 단백질들을 발굴하고, 그 발현 차이를 살펴보고자 실시하였다. 임신 또는 비임신된 한우에서 임신 진행에 따라 2배 이상의 발현 차이를 나타내는 spot 17개 중에서 IgG, haptoglobin, Golgi adaptor protein beta 1 subunit 및 prepro complement component C3 등은 비임신군에서 강하게 발현하는 것으로 분석되었다(Table 1) (김 등, 2008).
혈장 단백질의 발현 양상을 비교 . 분석하여 임신 초기에 자궁 내 환경 변화를 이해하는데 도움이 되고자 실시하였다.
제안 방법
)를 사용하였다. Mass spectrum의 분석을 위해서 trypsin의 자가분해에 의해 생성된 펩타이드의 ion peak m/z(842.510, 2211.1046) 를 표준 peaks로 이용하였다. 분석이 완료된 mass spectrum으로부터 단백질 동정을 위하여 Profound 검색엔진(http://prowl.
실험실로 운반하였다. Pr鴨esterone(P4) (Diagnostic Products Corp., Los Angeles, CA, USA) 의 농도 분석은 ELISA 키트(Endocaine Technologies Inc. Newark CA, USA) 를 이용하여 450 nm 파장의 ELISA reader(Mkro- plate Autoreader, Bio-Rad, USA)로 각 샘플당 2逐복하여측정하였다.
0, BioRad)를 이용하여 수행하였다. 각 spot의 quantity는 total valid spots의 inten- sity로 평준화(normalization) 되었으며, 대조군에 비해 두 배 이상의 유의한 발현 변화를 보여주는 단백질 spots을선정하였다.
한편, SPITC 반응이 일어난 단백질 단편들은 PSD(post-source decay) 모드에서 y-ion을 가지는 아미노산에 대하여 누적 peaks 을 얻고, 단백질 절편의 mass spectrum을 구하였다. 누적된 peak을 이용하여 Ettan MALDI-TOF software에서 읽어진 아미노산 서열은 PepFrag(http://prowl.rockefeller.edu /prowl/pepfrag.html) 프로그램을 이용하여 동정하였다.
본 실험에 공시된 한우에서 인공수정 후 임신 초기 동안의 P4.농도 변화를 측정하였다(Fig. 1).
하여 제조회사의 사용매뉴얼을 준수하여 20℃에서 IEF를 수행하였다. 이차적으로 SDSPAGE를 수행하기 전에 IPG Strips을 1% DTT 를 함유한 equilibration buffer(50 mM Tris-Q, pH 6.8, 6 M urea, 2% SDS, 30% glycerol)로 10분간 전처리하였으며, 곧 바로 2.5% iodoacetamide를 함유한 equilibration buffer로 10분간 추가로 처리하였다. 전처리가 완료된 st- lips을 SDS-PAGE gels(20x24 cm, 10-16%) 위에 배열시키고, Hoefer DALT 2D system(GE Healthcare Bio-Sd- ences Corp.
인공수정을 실시한 날로부터 매 일주일 단위로 총 11 주 동안 경정맥에서 채혈한 다음 용혈이 생기지 않도록 하여 실험실로 운반하였다. Pr鴨esterone(P4) (Diagnostic Products Corp.
입하고 CIDR를 제거하면서 PGF2a 25 mg을 투여한 다음 판매 중인 한우 동결정액을 이용하여 인공수정을 2차례 실시하였다. 임신진단은 인공수정 후 60일경에 초음파(Sono 600, Medison Co., Seoul, Korea)를 이용한 진단과 직장검사를 병행하여 실시하였다.
간단히 요약하면 공시축의 발정주기에 상관없이 progesterone releasing intravaginal devi<s(CI- DR-plus, InterAg, New Zealand)를 질 節에 7일간 삽. 입하고 CIDR를 제거하면서 PGF2a 25 mg을 투여한 다음 판매 중인 한우 동결정액을 이용하여 인공수정을 2차례 실시하였다. 임신진단은 인공수정 후 60일경에 초음파(Sono 600, Medison Co.
, NJ, USA)을 이#.하여 제조회사의 사용매뉴얼을 준수하여 20℃에서 IEF를 수행하였다. 이차적으로 SDSPAGE를 수행하기 전에 IPG Strips을 1% DTT 를 함유한 equilibration buffer(50 mM Tris-Q, pH 6.
exe)을 이용허였다. 한편, SPITC 반응이 일어난 단백질 단편들은 PSD(post-source decay) 모드에서 y-ion을 가지는 아미노산에 대하여 누적 peaks 을 얻고, 단백질 절편의 mass spectrum을 구하였다. 누적된 peak을 이용하여 Ettan MALDI-TOF software에서 읽어진 아미노산 서열은 PepFrag(http://prowl.
Tris-buffered saline으로 3차례 이상 세척을 실시한 다음, 저|2차 항체(1:10, 000)가 첨가된 용액에서 30분 흐안 반응을 유도하였다. 항원-항체 결합을 가시적으로 확인하기 위하여 enhanced chemiluminescent detection kit(ECL kit, Amersham Biosciences, USA)를 이용하여 처리하였으며' X-ray 필름에 노출을 실시하여 밴드의 강도를 확인하였다.
대상 데이터
공시 축은 농촌진흥청 국 립 축산과학원(http://wwwnias. go.kr)에서 사육하고 있는 정상적인 발정주기를 나타내는 한우 3~7년 생의 미경산 및 경산우 10두를 시험에 공시하였다. 공시축의 처리는 김 등(2006)의 방법을 일부 변경하여 실시하였다.
1046) 를 표준 peaks로 이용하였다. 분석이 완료된 mass spectrum으로부터 단백질 동정을 위하여 Profound 검색엔진(http://prowl.rockefeller. edu/prowl-cgi/profound.exe)을 이용허였다. 한편, SPITC 반응이 일어난 단백질 단편들은 PSD(post-source decay) 모드에서 y-ion을 가지는 아미노산에 대하여 누적 peaks 을 얻고, 단백질 절편의 mass spectrum을 구하였다.
질량분석기는 Ettan MALDI-TOF(GE Healtticare Bio- Sdences Corp.)를 사용하였다. Mass spectrum의 분석을 위해서 trypsin의 자가분해에 의해 생성된 펩타이드의 ion peak m/z(842.
데이터처리
모든 결과는 3회 이상 반복 실험을 실시하여 얻은 결과를 바탕으로 통계 분석을 실시하였다. One-way analysis of variance(ANOVA) 방법을 활용하여 각 처也 군 간의 차이를 확인하였다. p값이 0.
이차원 전기영동이 완료된 이차원 젤의 단백질은 Oakley 등(1980)의 방법에 따라 은염색(silver stain)으로 시각화되었으며, 질량분석기에 의한 단백질 동정을 위하여 glutaraldehyde 처리 단계는 생략되었다. 단백질 spots의 발현 변화 확인을 위한 정량적인 분석은 PDQuest software(version 7.0, BioRad)를 이용하여 수행하였다. 각 spot의 quantity는 total valid spots의 inten- sity로 평준화(normalization) 되었으며, 대조군에 비해 두 배 이상의 유의한 발현 변화를 보여주는 단백질 spots을선정하였다.
모든 결과는 3회 이상 반복 실험을 실시하여 얻은 결과를 바탕으로 통계 분석을 실시하였다. One-way analysis of variance(ANOVA) 방법을 활용하여 각 처也 군 간의 차이를 확인하였다.
이론/모형
냉동보관하였다. 혈장 단백질 추출은 김 등(2008)의 방법에 따라 진행되었다. 분리된 혈장 10 ul에 200 ul의 7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 1% DTT, 2% phannalyte(pH 3.
성능/효과
2차원 전기영동 결과, haptoglobin이 비임신군에서 강하게 발현하는 것으로 확인이 퇴었다. 이를 western blotting 방법으로 재차 확인한 결과, Fig.
Positive matrix factorization (PMF) 또는 chemical assisted fragmentation(CAF) 분석법을 통해 분석된 17개의 동정된 spotse 알부민, IgG, haptoglobin, ferrochelatase, fibrinogen, hemopexin, paraoxo- nase 1 및 Rab27a 등으로 확인되었다.
동정된 단백질의 분자적 기능(molecular functian)을분류한 결과 몇몇 기능적 그룹이 있는 것으로 나타났다 (Table 2).
본 연구에서 임신 초기 혈액을 이용하여 western blo- tting을 실시한 결과, 예상과 같이 PON-1의 발현이 임신군 특히 4-11 주에 강하게 나타나는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 임신 초기 착상이 일어나는 시기에 자궁 내에서 항산화와 관련된 일련의 변화들이 급격히 일어난다는 것을 암시한다고 할 수 있겠다.
발현하는 것으로 확인이 퇴었다. 이를 western blotting 방법으로 재차 확인한 결과, Fig. 2에서와 같이 임신 군에서는 임신 초기 동안에 전혀 발현하지 않았으나, 비임신군에서는 지속적으로 강하게 발현하는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 임신 초기에 모체와 태아 간의 면역관용에 영향을 미치는 것으로 생각해 볼 수 있다.
후속연구
본 실험으로 얻어진 결과를 바탕으로 얻어진 임신 특이 발현 유전자의 기능적인 분석이 진행된다면 임신 초기 자궁 내에서 일어나는 모체와 태아 간의 상호 작용에 대한 이해도를 높이고, 다양한 요인들로 진행되는 임신을 이해하는데 도움을 줄 수 있을 것이라 사료된다.
이러한 현상은 해당 단백질의 인산화 등이 일어난 것으로 추정할 수 있겠다. 하지만 이 단백질이 비임신 군에서만 강하게 발현하는 것으로 나타나 초기 임신 유지와 어떠한 관련이 있을 것인지에 대해서는 추가적인 기능 분석을 실시하여야만 할 것이다.
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