[논문]녹용(鹿茸), 홍화자(紅花子) 단일 및 혼합 물 추출물( 抽出物)의 파골세포(破骨細胞) 분화(分化) 억제(抑制)와 골흡수(骨吸收) 억제(抑制) 효과(效果)

안지영; 김주호; 기지예; 곽한복; 오재민; 김윤경

녹용(鹿茸), 홍화자(紅花子) 단일 및 혼합 물 추출물( 抽出物)의 파골세포(破骨細胞) 분화(分化) 억제(抑制)와 골흡수(骨吸收) 억제(抑制) 효과(效果)
Inhibitory Effects of Water Extract of Cervi parvum cornu, Carthami tinctorii fructus and Their Combination on Osteoclast Differentiation and Bone Resorption 원문보기

大韓韓醫學方劑學會誌 = Herbal formula science, v.18 no.2, 2010년, pp.167 - 182

안지영 (원광대학교 약학대학 한약학과.원광한약연구소) , 김주호 (원광대학교 약학대학 한약학과.원광한약연구소) , 기지예 (원광대학교 약학대학 한약학과.원광한약연구소) , 곽한복 (원광대학교 의과대학 해부학교실.의과학 연구소) , 오재민 (원광대학교 의과대학 해부학교실.의과학 연구소) , 김윤경 (원광대학교 약학대학 한약학과.원광한약연구소)

Abstract ▼ AI-Helper

Cervi parvum cornu (Deer Antler) and Carthami tinctorii fructus (Also known as Carthami seed) are widely used for treating osteoporosis and rheumatoid arthritis. In this study, We found out that the water extract of Cervi parvum cornu(WECPC), Carthami tinctorii fructus(WECTF) and their combination have effects of suppressing the RANKL-induced osteoclast differentiation. We assayed mRNA expression levels of NFATc1, c-Fos, TRAP and GAPDHS from bone marrow macrophages(BMMs) by means of RT-PCR. Similarly, the protein expression levels of NFATc1, c-Fos, MAPKs and $\beta$-actin in cell lysates were analyzed by means of Western blotting. then we determined the anti-osteoporotic effects of WECPC, WECTF and their combination using Lipopolysaccharide (LPS)-induced bone-loss mouse. WECPC, WECTF and their combination showed remarkable inhibition on RANKL-treated osteoclast differentiation without cytotoxicity. WECPC suppressed degradation of I-${\kappa}B$. WECPC, WECTF and their combination down-regulated the induction of c-Fos and NFATc1 by RANKL. Lastly, in vivo data showed that WECPC, WECTF and their combination rescued the bone erosion by LPS treatment. Thus, these results demonstrate that WECPC, WECTF and their combination can be efficacious remedies for bone-loss diseases such as osteoporosis and rheumatoid arthritis.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

천연물 혹은 천연물에서 유래한 성분을 이용하여 세포 단위에서 RANKL(receptor activator of NFκB ligand)로 誘導된 破骨細胞의 分化를 단계별로 抑制하는 效果를 시험한 연구도 보고^43-46) 되었으나 아직 鹿茸, 紅花子의 물 抽出物이 세포 수준에서 破骨細胞의 分化를 억제하는 정도와 염증성 骨損失에 미치는 작용, 작용기전과 두 약물의 混合 물 抽出物의 相乘效果에 관해 보고한 논문은 아직 없었다. 따라서 이 연구는 鹿茸과 紅花子의 효과에 관한 과학적 근거를 밝히고 각각의 약물의 투여와 倂用投與가 어떤 효과를 가지는지 그 가능성을 확인하고자 실험을 진행하였다.

가설 설정

A : The mRNA expression levels of the genes were determined by RT-PCR.

제안 방법

/well의 밀도로 96-well plate에 分株하고 M-CSF(30 ng/mL)를 처리한 후 鹿茸 물 抽出物, 紅花子 물 抽出物을 농도별로 처리하여 3일간 배양하였다. 3일 후 각각의 well에 XTT 용액을 처리하고 4시간 동안 incubation한 다음 ELISA Reader로 450nm 흡광도에서 측정하였다.
5×10⁴/well의 밀도로 48-well plate에 分株하고 M-CSF(30 ng/mL)와 RANKL(50 ng/mL)을 첨가한 배지에 鹿茸 물 抽出物과 紅花子 물 抽出物을 각각 농도별로 처리하여 培養하였다. 3일후 배양액을 교환하고 4일째에 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 용액으로 염색하여 적자색의 TRAP 양성세포를 破骨細胞로 인정하였다. 염색된 破骨細胞에서 핵이 3개 이상인 세포의 개수를 통계에 이용하였다.
그 후 30 μg의 단백을 10% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에서 電氣泳動으로 분리하고 PVDF 막으로 옮겼다. 5% skim milk를 처리하여 非特異 단백이 부착되는 것을 방지한 후 단백 각 사이즈 별로 1차 항체를 처리하였다. 이어 horseradish peroxidase가 붙어있는 2차 항체를 처리하고 ECL(enhanced chemiluminescence) 용액으로 蛋白發顯 정도를 측정하였다.
각 遺傳因子의 DNA 증폭을 위한 PCR(polymerase chain reaction) primer는 Table 1과 같다. PCR을 마친 후 增幅된 각 DNA를 1% agarose gel에 電氣泳動을 걸어 분리하고 ethylene bromide(Et-Br)로 염색한 후 U.V.에서 band를 확인하였다.
大食細胞를 3.5×104/well의 밀도로 48-well plate에 分株하고 M-CSF(30 ng/mL)와 RANKL(50 ng/mL)을 첨가한 배지에 鹿茸 물 抽出物과 紅花子 물 抽出物을 각각 농도별로 처리하여 培養하였다.
鹿茸 물抽出物과 紅花子 물 抽出物이 破骨細胞의 分化와 밀접한 관련이 있는 誘導因子에 어떤 效果를 나타내는지 확인하기 위하여 RANKL로 誘導되는 NFATc1, c-Fos, TRAP, ID2(Inhibitor of DNA binding 2)의 mRNA 發顯 정도를 RT-PCR 방법으로 검증하였다. 大食細胞에 M-CSF(20 ng/mL) 와 RANKL(100 ng/mL)을 처리한 다음 각 군별로 鹿茸 물 抽出物, 紅花子 물 抽出物을 처리하거나 처리하지 않고 培養하여 배양된 세포를 시간별로 모았다. RANKL은 NFATc1, c-Fos, OSCAR mRNA의 發顯을 촉진하였지만 鹿茸 물 抽出物과 紅花子 물 抽出物에 의해 유의하게 抑制되었고, TRAP의 發顯에는 유의한 차이가 없었다(Fig.
이 연구에 사용한 鹿茸(옴니허브, 뉴질랜드)과 紅花子(한국식물추출물은행, 한국생명공학연구원)를 각각 100 g에 정제수 1,000 mL를 넣고 Glas-Col(Terre Haute, IN, USA)社에서 구입한 Heating mantle을 이용하여 2시간 동안 40℃에서 減壓加熱하여 抽出하였다. 減壓濃縮機(Rotavapor R-124, Buchi, Switzerland)로 濃縮한 후 凍結乾燥機(FDU-2100, EYELA, Japan)로 건조하여 최종적으로 파우더 형태로 각각의 약물을 얻었다. 鹿茸의 收得率은 3.
7A). 紅花子 물 抽出物도 같은 방법으로 RANKL로 誘導되는 MAPKs인 p38, ERK, JNK 와 I-kB에 미치는 영향을 검증하였다. 그 결과, 紅花子 물 抽出物은 MAPKs인 p38, ERK, JNK의 활성에는 영향을 주지 않았고, I-κB에만 선택적으로 작용하였다(Fig.
紅花子 물抽出物은 NF-κB의 활성을 조절하는 I-κB의 활성만을 선택적으로 抑制하였다.
骨損失誘發을 위해 實驗群에 LPS(마우스 g당 5μg)를鹿茸 물 抽出物, 紅花子 물 抽出物 투여일로부터 3일과 6일에 2회에 걸쳐 腹腔注射하였고 對照群에는 PBS를 腹腔注射하여 實驗誤差를 제거하였다.
도 많이 있다. 대부분 마우스나 랫드를 이용하여 난소적출로 骨多孔症을 유발한 모델을 사용하여 실험을 진행하였다. 난소를 적출한 동물 모델에서는 모두 骨多孔症이 발생하는 것으로 보아 여성호르몬의 결핍과 骨多孔症이 밀접한 관계가 있는 것으로 思料되며 여성 생식기의 기능이 쇠퇴하는 폐경기 여성 骨多孔症과 유사한 모델로 볼 수 있을 것이다^51,52).
분리한 RNA 중에서 1μg을 oligo dT primer, dNTP buffer, dithiothreitol, RNase inhibitor, Superscript II reverse transcriptase(Invitrogen)를 사용하여 cDNA로 합성하였다.
생체 내의 骨損失에 미치는 鹿茸, 紅花子와 混合 물 抽出物의 效果를 연구하기 위해, 5週齡의 수컷 ICR 마우스 각 5마리씩을 각 군별로 배정하였다. 鹿茸 물 抽出物, 紅花子 물 抽出物, 混合 물抽出物(마우스 g당 0.
세포내 전량의 RNA를 TRIzol 용액(Invitrogen, USA)을 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 분리하였다. 분리한 RNA 중에서 1μg을 oligo dT primer, dNTP buffer, dithiothreitol, RNase inhibitor, Superscript II reverse transcriptase(Invitrogen)를 사용하여 cDNA로 합성하였다.
5% skim milk를 처리하여 非特異 단백이 부착되는 것을 방지한 후 단백 각 사이즈 별로 1차 항체를 처리하였다. 이어 horseradish peroxidase가 붙어있는 2차 항체를 처리하고 ECL(enhanced chemiluminescence) 용액으로 蛋白發顯 정도를 측정하였다. PVDF 막으로 옮긴 이후의 각 과정 중간 단계마다 TBS-T 용액으로 세척하여 불순물을 제거하였다.
채취한 骨髓細胞에서 적혈구를 제거한 후 10% FBS(Fetal bovine serum)와 M-CSF(30 ng/mL)를 첨가한 α-MEM(α-minimum essential medium) 배지에서 3일간 배양하였다.
전체 세포 용해물을 遠心分離(14,000 rpm, 20 min) 하여 上層液을 얻었다. 표준 단백질량과 비교하여 단백을 定量化하였다. 그 후 30 μg의 단백을 10% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에서 電氣泳動으로 분리하고 PVDF 막으로 옮겼다.
생체 내의 骨損失에 미치는 鹿茸, 紅花子와 混合 물 抽出物의 效果를 연구하기 위해, 5週齡의 수컷 ICR 마우스 각 5마리씩을 각 군별로 배정하였다. 鹿茸 물 抽出物, 紅花子 물 抽出物, 混合 물抽出物(마우스 g당 0.4mg 또는 0.2mg), 또는 PBS 를 군별로 나누어 10일간 經口投與 하였다. 骨損失誘發을 위해 實驗群에 LPS(마우스 g당 5μg)를鹿茸 물 抽出物, 紅花子 물 抽出物 투여일로부터 3일과 6일에 2회에 걸쳐 腹腔注射하였고 對照群에는 PBS를 腹腔注射하여 實驗誤差를 제거하였다.
鹿茸, 紅花子와 混合 물 抽出物이 생체 내 骨組織에 미치는 영향을 검증하고자 염증성 骨損失 동물모델을 사용하여 마우스는 각 군별로 5마리씩을 배정하고 각각의 마우스에 LPS를 腹腔注射하여 骨損失을 유발시켰다. 鹿茸, 紅花子의 單一 물 抽出物과 混合 물 抽出物을 각 군별로 나누어 經口投與하여 LPS에 의한 骨損失에 미치는 效果를 확인한 결과 LPS만 단독 처리한 對照群의 경우 小柱骨(trabecular bone)의 骨損失을 뚜렷하게 확인할 수 있었다.
鹿茸과 紅花子 모두 30 μg/mL의 농도부터 유의성이 있는分化抑制效果를 관찰하였고, 100 μg/mL의 농도에서 90% 이상 抑制되는 濃度依存的抑制效果를 확인하였다(Fig. 1B, 2B).
鹿茸과 紅花子 물 抽出物을 이용하여 破骨細胞分化抑制 실험과 骨吸收抑制效果에 대해LPS로 염증성 骨損失을 유도한 마우스 동물실험을 수행한 결과는 다음과 같다.

대상 데이터

5週齡의 수컷 ICR 마우스를 頸椎奪骨法으로 희생시킨 후 1× antibiotic을 첨가한 α-MEM(α-minimum essential medium)을 1cc 주사기에 충전하여 脛骨 및 大腿骨에서 骨髓를 채취하였다.
20 ㎛ 필터에 여과한 후 -20℃ 저장고에서 보관하였다. Human RANKL과 Human M-CSF는 Peprotech(London, UK)社의 것을, c-Fos와 NFATc1의 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)社의 것을 사용하였다. Phospho-ERK, ERK, phospho-p38, p38, phospho-JNK, JNK, I-κB에 대한 항체는 Cell signaling Technology(Beverly, MA, USA)社의 제품을, XTT assay kit는 Roche(Indianapolis, IN, USA)社의 제품을, actin 항체와 TRAP solution, LPS(Lipopolysaccaride)는 Sigma Aldrich(St.
10일째 되는 날 마우스를 희생시키고 대퇴골을 취하여 4% paraformaldehyde로 고정하였다. Nano-CT 인 NFR-Polaris-S160(Nano Focus Ray, 한국)을 이용하여 대퇴골 내부의 3차원적 영상을 얻었다.
Louis, MO, USA)社에서 구입하여 사용하였다. PVDF(polyvinylidene difluoride membrane) millipore(billerica, CA, USA)社의 제품을, ECL(enhanced chemiluminescence) 용액은 iNtRON(성남, 한국) 社의 제품을 사용하였다.
Phospho-ERK, ERK, phospho-p38, p38, phospho-JNK, JNK, I-κB에 대한 항체는 Cell signaling Technology(Beverly, MA, USA)社의 제품을, XTT assay kit는 Roche(Indianapolis, IN, USA)社의 제품을, actin 항체와 TRAP solution, LPS(Lipopolysaccaride)는 Sigma Aldrich(St. Louis, MO, USA)社에서 구입하여 사용하였다.
이 연구를 수행하기 전 骨多孔症에 效果가 있다고 알려진 數種의 韓藥材를 시험적으로 스크린 하여 우수한 效果를 보인 鹿茸과 紅花子를 선택하였다. 大食細胞에 M-CSF와 RANKL을 처리하고 4일간 배양하면 對照群 세포와 같이 핵이 3개 이상인 TRAP 양성 다핵형 破骨細胞로 分化되는데, 여기에 鹿茸 물 抽出物(Water extract of Cervi parvum cornu, WECPC)과 紅花子 물 抽出物(Water extract of Carthami tinctorii fructus, WECTF)을 투여하여 破骨前驅細胞에서 破骨細胞로의 分化를 억제하는 것을 확인하였다(Fig.
이 연구에 사용한 鹿茸(옴니허브, 뉴질랜드)과 紅花子(한국식물추출물은행, 한국생명공학연구원)를 각각 100 g에 정제수 1,000 mL를 넣고 Glas-Col(Terre Haute, IN, USA)社에서 구입한 Heating mantle을 이용하여 2시간 동안 40℃에서 減壓加熱하여 抽出하였다. 減壓濃縮機(Rotavapor R-124, Buchi, Switzerland)로 濃縮한 후 凍結乾燥機(FDU-2100, EYELA, Japan)로 건조하여 최종적으로 파우더 형태로 각각의 약물을 얻었다.

데이터처리

결과의 통계적인 유의성은 Student's unpaired t-test를 이용하여 분석하였고, p<0.05 인 경우를 통계적으로 유의 한 것으로 인정하였다.
정량적인 결과는 평균 ± 표준편차로 나타내었다.

이론/모형

NFATc1과 c-Fos는 破骨細胞의 分化에 가장 중요하고 필수적인 요소이다. RANKL로 誘導되는 轉寫因子인 NFATc1, c-Fos의 蛋白發顯이 鹿茸 물 抽出物과 紅花子 물 抽出物에 의해 抑制되는 것을 Western blot 방법으로 확인하였다. M-CSF 와 RANKL을 처리한 對照群의 NFATc1과 c-Fos 의 단백이 時間依存的으로 發顯되는 것에 비해 鹿茸, 紅花子를 각각 처리한 實驗群에서는 단백 發顯이 현저히 감소되는 것을 확인하였다(Fig.
RANKL에 의해 誘導되는 NFATc1과 c-Fos의 蛋白發顯에 紅花子 30 μg/mL, 鹿茸 30 μg/mL, 紅花子 15 μg/mL + 鹿茸 15 μg/mL, 紅花子 30 μg/mL + 鹿茸 30 μg/mL 를 처리했을 때의 效果를 western blot 방법으로 검증하였다.
鹿茸 물 抽出物이 RANKL로 유도되는 여러 가지 MAPKs(Mitogen-activated protein kinases) 에 미치는 영향을 western blot 방법으로 검증하였다. 그 결과 鹿茸 물 抽出物은 p38, JNK, AKT의 燐酸化를 억제하였으나 I-κB에는 영향을 주지 않았다(Fig.
RANKL 신호에 發顯되는 특정 유전자들은 破骨細胞의 分化를 조절하는 기능을 한다. 鹿茸 물抽出物과 紅花子 물 抽出物이 破骨細胞의 分化와 밀접한 관련이 있는 誘導因子에 어떤 效果를 나타내는지 확인하기 위하여 RANKL로 誘導되는 NFATc1, c-Fos, TRAP, ID2(Inhibitor of DNA binding 2)의 mRNA 發顯 정도를 RT-PCR 방법으로 검증하였다. 大食細胞에 M-CSF(20 ng/mL) 와 RANKL(100 ng/mL)을 처리한 다음 각 군별로 鹿茸 물 抽出物, 紅花子 물 抽出物을 처리하거나 처리하지 않고 培養하여 배양된 세포를 시간별로 모았다.

성능/효과

1. 鹿茸과 紅花子는 세포독성없이 破骨前驅細胞에서 破骨細胞로의 分化를 濃度依存的으로 抑制하였다.
2. RANKL 신호에 發顯되면서 破骨細胞의 分化를 조절하는 기능을 하는 특정 유전자에 대한 效果를 확인한 결과, NFATc1, c-Fos의 유전자 發顯은 鹿茸과 紅花子 모두에서 유의하게 抑制되었다. RANKL로 誘導되는 NFATc1, c-Fos의蛋白發顯은 鹿茸, 紅花子 물 抽出物을 투여한 實驗群에서 대조군에 비하여 감소되었고 특히 倂用投與한 實驗群은 濃度依存的으로 유의성있는 抑制效果를 나타냈다.
3. 鹿茸 물 抽出物은 RANKL로 유도되는 MAPKs인 p38, JNK, AKT의 燐酸化를 억제하였고 I-κ B의 활성에는 영향을 주지 않았다.
4. 鹿茸, 紅花子와 두 약물의 混合 물 抽出物을 투여하여 생체내 骨組織에 미치는 影響을 확인한 결과 LPS에 의해 骨損失을 유발한 마우스에서 鹿茸 물 抽出物, 紅花子 물 抽出物과 두 약물의 混合 물 抽出物을 倂用投與한 實驗群에서는 骨損失이 抑制되었다. 특히 鹿茸과 紅花子의 倂用投與는 단일 약물의 투여에 비해 骨損失에 대한 탁월한 회복을 보여주었다.
RANKL로 誘導되는 轉寫因子인 NFATc1, c-Fos의 蛋白發顯이 鹿茸 물 抽出物과 紅花子 물 抽出物에 의해 抑制되는 것을 Western blot 방법으로 확인하였다. M-CSF 와 RANKL을 처리한 對照群의 NFATc1과 c-Fos 의 단백이 時間依存的으로 發顯되는 것에 비해 鹿茸, 紅花子를 각각 처리한 實驗群에서는 단백 發顯이 현저히 감소되는 것을 확인하였다(Fig. 6).
RANKL 신호에 發顯되면서 破骨細胞의 分化를 조절하는 기능을 하는 특정 유전자에 대한 效果를 확인한 결과, NFATc1, c-Fos의 유전자 發顯은 鹿茸과 紅花子 모두에서 유의하게 抑制되었다. RANKL로 誘導되는 NFATc1, c-Fos의蛋白發顯은 鹿茸, 紅花子 물 抽出物을 투여한 實驗群에서 대조군에 비하여 감소되었고 특히 倂用投與한 實驗群은 濃度依存的으로 유의성있는 抑制效果를 나타냈다.
이 연구를 수행하기 전 骨多孔症에 效果가 있다고 알려진 數種의 韓藥材를 시험적으로 스크린 하여 우수한 效果를 보인 鹿茸과 紅花子를 선택하였다. 大食細胞에 M-CSF와 RANKL을 처리하고 4일간 배양하면 對照群 세포와 같이 핵이 3개 이상인 TRAP 양성 다핵형 破骨細胞로 分化되는데, 여기에 鹿茸 물 抽出物(Water extract of Cervi parvum cornu, WECPC)과 紅花子 물 抽出物(Water extract of Carthami tinctorii fructus, WECTF)을 투여하여 破骨前驅細胞에서 破骨細胞로의 分化를 억제하는 것을 확인하였다(Fig. 1A, 2A). 鹿茸과 紅花子 모두 30 μg/mL의 농도부터 유의성이 있는分化抑制效果를 관찰하였고, 100 μg/mL의 농도에서 90% 이상 抑制되는 濃度依存的抑制效果를 확인하였다(Fig.
RANKL에 의해 誘導되는 NFATc1과 c-Fos의 蛋白發顯에 紅花子 30 μg/mL, 鹿茸 30 μg/mL, 紅花子 15 μg/mL + 鹿茸 15 μg/mL, 紅花子 30 μg/mL + 鹿茸 30 μg/mL 를 처리했을 때의 效果를 western blot 방법으로 검증하였다. 그 결과 對照群은 時間依存的으로 c-Fos와 NFATc1 蛋白發顯이 증가하였지만 鹿茸, 紅花子抽出物과 混合 물 抽出物을 같이 처리한 實驗群의 NFATc1과 c-Fos 蛋白發顯은 對照群에 비하여 감소되었다. 특히 鹿茸과 紅花子를 단독으로 30 μg/mL를 투여한 것보다 鹿茸과 紅花子를 각 15 μg/mL 씩 倂用投與한 군에서 더 큰 억제 효과를 나타냈고 鹿茸 과 紅花子를 각 30 μg/mL씩 倂用投與한 群은 15μg/mL 씩 倂用投與한 군과 비교할 때 濃度依存的으로 有意性있는 抑制效果를 나타냈다(Fig.
그 결과 鹿茸 물 抽出物은 p38, JNK, AKT의 燐酸化를 억제하였으나 I-κB에는 영향을 주지 않았다(Fig. 7A).
그 결과, 紅花子 물 抽出物은 MAPKs인 p38, ERK, JNK의 활성에는 영향을 주지 않았고, I-κB에만 선택적으로 작용하였다(Fig. 7B).
鹿茸, 紅花子 물 抽出物은 破骨前驅細胞에서 破骨細胞로의 分化에 有意性있는 抑制效果를 나타냈다. 그러나 鹿茸, 紅花子 물 抽出物에 의한 破骨細胞分化抑制가 破骨前驅細胞에 대한 독성 때문인지 확인하기 위하여 XTT 검사를 실시하여 M-CSF 단독 처리한 對照群과 鹿茸 물 抽出物과紅花子 물 抽出物을 농도별로 10 ㎍/mL에서부터 150 ㎍/mL까지 농도를 높이면서 처리한 결과 鹿茸과 紅花子 모두 150 ㎍/mL 까지 大食細胞에 대한 毒性을 나타내지 않았다(Fig. 3). 따라서 이 결과를 통해 破骨細胞分化抑制효과는 破骨前驅細胞에 대한 鹿茸이나 紅花子 물 抽出物의 細胞毒性으로 인한 것이 아니라고 할 수 있다.
3). 따라서 이 결과를 통해 破骨細胞分化抑制효과는 破骨前驅細胞에 대한 鹿茸이나 紅花子 물 抽出物의 細胞毒性으로 인한 것이 아니라고 할 수 있다.
鹿茸, 紅花子의 單一 물 抽出物과 混合 물 抽出物을 각 군별로 나누어 經口投與하여 LPS에 의한 骨損失에 미치는 效果를 확인한 결과 LPS만 단독 처리한 對照群의 경우 小柱骨(trabecular bone)의 骨損失을 뚜렷하게 확인할 수 있었다. 반면에 鹿茸, 紅花子 물 抽出物과 混合 물 抽出物을 투여한 實驗群에서는 LPS에 의한 骨損失이 抑制되었음을 확인하였다. 鹿茸과 紅花子를 단독으로 200 mg/kg을 투여한 것보다 鹿茸과 紅花子를 각 100 mg/kg 씩을 混合하여 倂用投與한 군에서 骨損失을 억제하는 것이 단독으로 200 mg/kg을 투여한 것보다 효과가 있었고, 鹿茸 과 紅花子를 각각 200mg/kg 씩 倂用投與한 군은 100 mg/kg 씩을 倂用投與한 군과 비교할 때 濃度依存的으로 유의성 있는 抑制效果를 나타냈다(Fig.
1B, 2B). 이 결과는 鹿茸 물 抽出物과 紅花子 물 抽出物이 RANKL에 의해 誘導되는 破骨細胞의 分化 과정을 직접적으로 抑制하고 있다는 것을 의미한다.
9). 이 결과로 鹿茸, 紅花子의 單一 물 抽出物과 混合 물 抽出物은 生體內條件에서도 염증성 骨損失을 抑制한다는 사실을 확인할 수 있었다. 특히 鹿茸, 紅花子의 混合 물 抽出物을 투여한 경우 같은 농도의 단일 투여군보다 월등한 효과를 나타내었다.
TRAF-6에 의해 유도되는 NF-κB와 MAPKs의 활성이 紅花子와 鹿茸의 藥理作用에 의해 차단되고 또 紅花子, 鹿茸 각각의 抽出物이 차단하는 破骨細胞에 分化에 대한 신호 전달 경로가 독립적이므로 두 약물을 倂用投與했을 때 그 약효가 相乘하게 되는 것으로 생각된다. 이 실험을 통해 鹿茸, 紅花子抽出物이 RANKL 신호 전달 과정의 한 단계를 차단함으로써 破骨細胞 형성을 抑制한다는 것을 확인하였다.
이번 연구를 통해 전형적인 RANKL → TRAF-6 → c-Fos → NFATc1 경로를 통한 破骨細胞의 分化 과정에서 鹿茸과 紅花子가 細胞毒性 없이 分化를 직접적으로 抑制하며, 생체의 骨損失 모델에서 鹿茸과 紅花子가 骨損失을 抑制하는 결과를 얻었다.
이번 연구에서 LPS로 骨損失을 유발한 마우스에 鹿茸, 紅花子 그리고 이들의 混合 물 抽出物을 투여한 결과 鹿茸과 紅花子 각각의 단일 抽出物을 200 mg을 투여한 경우에도 骨損失을 일정 정도 복원하였으나 각각의 용량을 100mg씩으로 한 混合抽出物을 투여했을 경우 骨損失의 복원이 단일抽出物을 200 mg을 투여한 경우보다 유의성있게 증가하였고 鹿茸과 紅花子의 용량을 200 mg씩으로 倂用投與한 경우 骨損失을 거의 완벽하게 차단하였다. 앞으로 더 많은 연구가 뒤따라야 하겠지만 이 실험의 결과는 LPS를 투여하여 骨多孔症을 유발하는 경우 骨多孔症과 관련하여 증가하는 염증성 사이토카인이나 PGE2 같은 염증 물질을 鹿茸과 紅花子의 倂用投與가 抑制할 가능성이 있음을 시사하는 것이다.
특히 鹿茸 물 抽出物은 RANKL로 유도되는 다양한 MAPKs인 p38, JNK, AKT의 燐酸化를 억제하였고, 紅花子 물 抽出物은 NFATc1 상위단계의 調節因子인 NF-κB의 활성을 억제하는 구체적인 경로도 확인할 수 있었다.
이 결과로 鹿茸, 紅花子의 單一 물 抽出物과 混合 물 抽出物은 生體內條件에서도 염증성 骨損失을 抑制한다는 사실을 확인할 수 있었다. 특히 鹿茸, 紅花子의 混合 물 抽出物을 투여한 경우 같은 농도의 단일 투여군보다 월등한 효과를 나타내었다.
특히 鹿茸과 紅花子를 단독으로 30 μg/mL를 투여한 것보다 鹿茸과 紅花子를 각 15 μg/mL 씩 倂用投與한 군에서 더 큰 억제 효과를 나타냈고 鹿茸 과 紅花子를 각 30 μg/mL씩 倂用投與한 群은 15μg/mL 씩 倂用投與한 군과 비교할 때 濃度依存的으로 有意性있는 抑制效果를 나타냈다(Fig. 8)
鹿茸, 紅花子와 두 약물의 混合 물 抽出物을 투여하여 생체내 骨組織에 미치는 影響을 확인한 결과 LPS에 의해 骨損失을 유발한 마우스에서 鹿茸 물 抽出物, 紅花子 물 抽出物과 두 약물의 混合 물 抽出物을 倂用投與한 實驗群에서는 骨損失이 抑制되었다. 특히 鹿茸과 紅花子의 倂用投與는 단일 약물의 투여에 비해 骨損失에 대한 탁월한 회복을 보여주었다.
鹿茸, 紅花子와 混合 물 抽出物이 생체 내 骨組織에 미치는 영향을 검증하고자 염증성 骨損失 동물모델을 사용하여 마우스는 각 군별로 5마리씩을 배정하고 각각의 마우스에 LPS를 腹腔注射하여 骨損失을 유발시켰다. 鹿茸, 紅花子의 單一 물 抽出物과 混合 물 抽出物을 각 군별로 나누어 經口投與하여 LPS에 의한 骨損失에 미치는 效果를 확인한 결과 LPS만 단독 처리한 對照群의 경우 小柱骨(trabecular bone)의 骨損失을 뚜렷하게 확인할 수 있었다. 반면에 鹿茸, 紅花子 물 抽出物과 混合 물 抽出物을 투여한 實驗群에서는 LPS에 의한 骨損失이 抑制되었음을 확인하였다.
NFATc1과 c-Fos는 TRAP, DC-STAMP, OSCAR 등 破骨細胞의 分化에 중요한 蛋白發顯을 조절한다^53-55). 鹿茸과 紅花子 물 抽出物로 처리하였을 때 RANKL 신호 전달 과정에서 M-CSF와 RANKL로 처리한 대식세포의 破骨細胞誘導因子인 NFATc1과 c-Fos의 蛋白發顯이 현저히 감소되는 것을 알 수 있었다. 특히 鹿茸 물 抽出物은 RANKL로 유도되는 다양한 MAPKs인 p38, JNK, AKT의 燐酸化를 억제하였고, 紅花子 물 抽出物은 NFATc1 상위단계의 調節因子인 NF-κB의 활성을 억제하는 구체적인 경로도 확인할 수 있었다.
RANKL이 수용체인 破骨細胞 막의 RANK와 결합하면 破骨細胞의 형성에 중요한 세포내 여러 가지 신호 전달 물질을 활성화시키는데⁵³⁾ 특히 중요한 調節因子의 하나인 TRAF-6(TNFα receptor-associated factor-6)는 MAPKs, NFATc1, NFκB의 활성화를 통해 破骨細胞의 分化를 촉진한다^51,54-56). 鹿茸과 紅花子 물 抽出物은 破骨細胞로 分化하기 이전 단계인 破骨前驅細胞 단계에서 濃度依存的으로 分化를 억제하며 破骨細胞分化에 직접적인 영향을 미치고 있다는 것을 실험을 통해 확인할 수 있었다. NFATc1과 c-Fos는 TRAP, DC-STAMP, OSCAR 등 破骨細胞의 分化에 중요한 蛋白發顯을 조절한다^53-55).
반면에 鹿茸, 紅花子 물 抽出物과 混合 물 抽出物을 투여한 實驗群에서는 LPS에 의한 骨損失이 抑制되었음을 확인하였다. 鹿茸과 紅花子를 단독으로 200 mg/kg을 투여한 것보다 鹿茸과 紅花子를 각 100 mg/kg 씩을 混合하여 倂用投與한 군에서 骨損失을 억제하는 것이 단독으로 200 mg/kg을 투여한 것보다 효과가 있었고, 鹿茸 과 紅花子를 각각 200mg/kg 씩 倂用投與한 군은 100 mg/kg 씩을 倂用投與한 군과 비교할 때 濃度依存的으로 유의성 있는 抑制效果를 나타냈다(Fig. 9). 이 결과로 鹿茸, 紅花子의 單一 물 抽出物과 混合 물 抽出物은 生體內條件에서도 염증성 骨損失을 抑制한다는 사실을 확인할 수 있었다.
鹿茸과 紅花子의 in vivo 실험에서는 LPS로 염증을 유발한 마우스를 사용하여 骨損失에 대한 효과를 실험하여 유의할만한 결과를 얻었다. LPS에 의해 破骨細胞의 分化를 촉진하는 정확한 작용기 전은 밝혀지지 않았지만 LPS의 破骨細胞 분화 촉진은 LPS가 破骨前驅細胞에서 MMP-9을, 造骨細胞에서 SDF-1α의 發顯을 증가시켜 破骨前驅細胞 의 이동을 촉진시키기 때문으로 추측⁵⁷⁾하고 있다.

후속연구

이번 연구에서 LPS로 骨損失을 유발한 마우스에 鹿茸, 紅花子 그리고 이들의 混合 물 抽出物을 투여한 결과 鹿茸과 紅花子 각각의 단일 抽出物을 200 mg을 투여한 경우에도 骨損失을 일정 정도 복원하였으나 각각의 용량을 100mg씩으로 한 混合抽出物을 투여했을 경우 骨損失의 복원이 단일抽出物을 200 mg을 투여한 경우보다 유의성있게 증가하였고 鹿茸과 紅花子의 용량을 200 mg씩으로 倂用投與한 경우 骨損失을 거의 완벽하게 차단하였다. 앞으로 더 많은 연구가 뒤따라야 하겠지만 이 실험의 결과는 LPS를 투여하여 骨多孔症을 유발하는 경우 骨多孔症과 관련하여 증가하는 염증성 사이토카인이나 PGE2 같은 염증 물질을 鹿茸과 紅花子의 倂用投與가 抑制할 가능성이 있음을 시사하는 것이다. 그동안 鹿茸과 紅花子는 임상에서 많이 사용되었고 한약으로서의 그 효과는 명백히 알려져 있으나 骨多孔症을 예방하고 치료하는 작용기전에 대해서는 아직도 밝혀지지 않은 부분이 있었다.
이러한 결과로 볼 때, 鹿茸과 紅花子 배합 약물은 파골세포와 관련된 骨損失 질환에 효과적인 치료제로 개발될 수 있다고 思料된다.
이번 연구를 통해 전형적인 RANKL → TRAF-6 → c-Fos → NFATc1 경로를 통한 破骨細胞의 分化 과정에서 鹿茸과 紅花子가 細胞毒性 없이 分化를 직접적으로 抑制하며, 생체의 骨損失 모델에서 鹿茸과 紅花子가 骨損失을 抑制하는 결과를 얻었다. 이를 통해 骨多孔症을 포함한 파골세포와 관련된 骨疾患에 새로운 치료제 연구와 개발로 이어질 수 있을 것으로 思料된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	骨多孔症은 무엇인가?	사회경제 수준의 향상과 과학의 발달은 평균 수명의 증가를 가져왔고 이에 따라 骨多孔症 (Osteoporosis)이나 關節炎과 같은 骨疾患이 점차 주요한 의료 보건 문제로 부각되고 있다. 骨多孔症은 骨代謝의 불균형으로 인해 骨吸收가 骨形成보다 많아져서 骨無機質의 비율은 일정하게 유지되면서도 이것의 총량인 骨量(骨密度)이 감소하는 것이다1,2). 骨多孔症은 그 자체보다 이로 인해 발생하는 骨折이 더 큰 문제가 되며 骨折이 일어나기 전까지는 아무런 통증이나 이상 증세를 나타내지 않는 질환이다.
	약재 紅花는 무엇인가?	紅花(Carthamus tinctorius L. Carthami flos)는 菊花科(Compositae) 에 속한 일년생 본초인 잇꽃(Carthamus tinctorius L.)의 花를 건조한 것이다. 紅花는 7˜8월에 꽃잎이 黃色에서 紅色으로 변할 때 筒狀花를 따서 曬乾하거나 또는 陰乾한다.
	骨損失이 누적되어 단위 용적 내에 骨密度가 감소하면서 발생하는 骨多孔症의 치료제는 무엇이 사용되고 있는가?	骨多孔症이 일어나는 작용기전은 아직 확실치 않으나 閉經 후 骨多孔症의 경우는 난소에서 에스트로겐의 분비가 감소할 때 破骨細胞에 의한 骨吸收의 증가가 그 원인일 것으로 추측하고 있다48). 骨多孔症의 치료에 사용되는 치료제는 骨吸收抑制劑와 骨의 形成을 자극하는 骨形成促進劑의두 가지 종류의 약물이 사용되고 있다. 骨吸收抑制劑는 내과적 치료제로 破骨細胞에 작용하여 骨吸收를 억제하며 estrogen, bisphosphonate, SERM (selective estrogen receptor modulator), calcitonin, tibolone 등이 있다1,3).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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