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문제 정의
- 각각의 혼합 비율을 달리하여 멜라민을 식품에 첨가한 시료를 전자코 분석을 통하여 상관관계식을 설정하고 이를 토대로 미지의 멜라민 양이 함유되었을 때 그 함량을 예측하고자 하였다. 0, 30, 50, 80, 100%의 멜라민이 혼합된 분유, 커피 크림 시료의 전자코 데이터를 통계처리하여 얻어진 DF1 값과 멜라민 농도간의 관계를 토대로 표준곡선을 만들고 미지의 시료(20, 40, 70, 90%)를 전자코로 분석하여 통계처리한 후 표준곡선을 적용하여 멜라민 함량을 예측하였다.
- 또한 비파괴적인 분석방법으로 전처리 과정에서 파괴되거나 손실되는 것을 방지하여 멜라민과 같이 향이 적은 물질을 분석하는데 효과적이다. 따라서 본 연구에서는 기존의 멜라민 분석 방법의 한계점을 극복하고자 전처리 과정이 필요치 않으면서 빠르고 간편하게 전자코로 분석할 수 있는 방법을 모색하고자 한다. 이를 토대로 유제품에 멜라민을 첨가하였는지 그 진위여부를 신속하게 파악(12)할 뿐 아니라 첨가량을 달리한 차이를 구분하여 정량적인 양까지도 예측하고자 한다.
- 멜라민을 첨가한 분유와 크림에 대하여 각각의 혼합 비율에 따른 차이를 MS-전자코로 분석하고자 하였다. 각 시료가 들어 있는 vial을 300 rpm으로 교반하면서 70°C를 유지하였고 주입구 온도는 130°C인 상태에서 주입하였다.
- 본 분석방법이 요소나 멜라민이 합성되는 과정에서 함께 생성되는 cyanuric acid와 같이 유사한 구조를 지닌 다른 물질의 영향을 받지 않으면서 멜라민 자체만의 함량을 분석한 것인지 확인해 보았다. 유사물질간의 차이를 알아보고자 분유에 cyanuric acid, 요소, 멜라민을 각각 혼합하여 전자코로 분석한 결과는 Fig.
- 따라서 본 연구에서는 기존의 멜라민 분석 방법의 한계점을 극복하고자 전처리 과정이 필요치 않으면서 빠르고 간편하게 전자코로 분석할 수 있는 방법을 모색하고자 한다. 이를 토대로 유제품에 멜라민을 첨가하였는지 그 진위여부를 신속하게 파악(12)할 뿐 아니라 첨가량을 달리한 차이를 구분하여 정량적인 양까지도 예측하고자 한다. 이러한 연구를 통하여 향후 미지의 멜라민 함량이 첨가된 제품에 그 함유량을 분석 가능하게 하여 제품의 품질 관리시 활용할 수 있는 대안을 제시할 수 있을 것이다.
제안 방법
- 각각의 혼합 비율을 달리하여 멜라민을 식품에 첨가한 시료를 전자코 분석을 통하여 상관관계식을 설정하고 이를 토대로 미지의 멜라민 양이 함유되었을 때 그 함량을 예측하고자 하였다. 0, 30, 50, 80, 100%의 멜라민이 혼합된 분유, 커피 크림 시료의 전자코 데이터를 통계처리하여 얻어진 DF1 값과 멜라민 농도간의 관계를 토대로 표준곡선을 만들고 미지의 시료(20, 40, 70, 90%)를 전자코로 분석하여 통계처리한 후 표준곡선을 적용하여 멜라민 함량을 예측하였다.
- 전자코로 측정된 10-200 amu 값들 중 멜라민이 나타내는 주요 amu 값인 41, 42, 43, 63, 68, 83, 85, 126, 127 amu에서 감응도 값들을 이용하여 DFA 통계처리를 통해 시료간의 차이와 멜라민 함량간의 관계로부터 멜라민의 함량을 분석하였다. DFA는 선택된 ion fragment를 나타내는 amu에서 감응도 값을 이용하여 종속변수에 영향을 주는 독립변수를 검정한 것으로 종속변수를 예측할 수 있는 판별함수값인 독립변수 중 영향력이 큰 DF1과 DF2로 시료간의 차이를 판별하였다. Lim 등(13)은 원산지가 다른 쇠고기를 전자코로 측정하여 이를 구분한 바 있으며 이때 원산지간 차이가 큰 amu에서 감응도 값 4가지를 선별하여 DFA 통계처리 하였다.
- 2. Discriminant function analysis of the obtained data by electronic nose for melamine and coffee whitener (A), correlation between DF1 and mixing ratio of melamine and coffee whitener (B).
- 1. Discriminant function analysis of the obtained data by electronic nose for melamine and powdered milk (A), correlation between DF1 and mixing ratio of melamine and powdered milk (B).
- 분석에 사용된 전자코는 질량분석기(Quadrapole Mass Spectrometer, Balzers Instruments, Marin-Epagnier, Switzerland)가 연결되어 있으며 휘발성 물질들은 70 eV에서 이온화시켜 180초 동안 생성된 이온물질을 사중극자(quadrupole)질량 필터를 거친 후 특정 질량 범위(10-200 amu)에 속하는 물질을 정수 단위로 측정하여 channel수로 사용하였다(13). 각각의 시료는 4회 반복을 실시하였다.
- 멜라민은 비휘발성 물질이지만 전자코에 있는 shaking incubater에서 일정 온도(70°C)의 열을 가하고 MS system에 의해 다시 ion fragment로 만들어준 후 생성된 일부 분해산물을 기반으로 분석하였다.
- 멜라민은 요소로부터 합성되며 부산물로 cyanuric acid가 생성되므로 이러한 물질들이 멜라민 분석에 영향을 주지 않는지 알아보기 위하여 농도별로(4.7, 9, 13% 첨가) 분석하였다.
- 멜라민을 첨가하는 제품들에 대한 기존의 분석법의 한계를 극복하고자 전자코를 이용하여 멜라민 첨가 진위 여부와 첨가 함량의 차이를 분석하였다. 그 결과 멜라민을 분유와 커피 크림에 농도별로 첨가하였을 때 차이가 뚜렷이 구분되었으며 이를 통해 얻은 멜라민 농도와 DF1간의 상관관계식(분유: DF1= -0.
- 멜라민이 첨가된 제품의 분석은 mass spectrometer를 바탕으로 한 전자코를 활용하였고 각기 다른 channel의 intensity는 matrix 형태로 기록되었으며 이온화되어 얻어진 분자들 중 가장 차별성을 높게 표현하는 분자량(m/z)을 갖는 variables 그룹을 20-30개 선정하여 DFA(discriminant function analysis)를 실시하였다(13,14). 이때 사용된 소프트웨어는 SMart Nose statistical analysis software를 사용하였다.
- 4와 같다. 본 분석방법은 멜라민 함량에 초점을 둔 것이기 때문에 통계처리시 멜라민의 mass spectrum에서 나타나는 ion fragment를 선택적으로 선별하였으며 멜라민 함량에 따라 DF1 값에 영향을 많이 받으므로 DF1 값을 중심으로 비교하였다. Cyanuric acid를 분유에 농도(4.
- 이들 독립변수 중에서 종속변수를 예측할 수 있는 판별함수 값은 DF1, DF2, DF3 ………… DFn으로 나타냈다. 여러 독립변수들 중에서 종속변수에 영향력을 주는 순서를 기준으로 DF1과 DF2를 정하였다.
- 유제품에 멜라민이 혼합된 시료를 제조하여 mass spectrum을 바탕으로 한 전자코를 이용하여 분석하였다. 멜라민은 비휘발성 물질이지만 전자코에 있는 shaking incubater에서 일정 온도(70°C)의 열을 가하고 MS system에 의해 다시 ion fragment로 만들어준 후 생성된 일부 분해산물을 기반으로 분석하였다.
- 0에 가까워 미지의 멜라민 함량이 첨가된 시료를 전자코로 분석하여 통계처리한 후 얻은 DF1 값을 대입하면 멜라민의 양을 예측할 수 있었다. 이를 토대로 미지의 멜라민 양을 첨가하였을 때 그 정도를 예측할 수 있는지 알아보기 위해 20, 40, 70, 90%의 멜라민을 분유, 커피 크림과 혼합한 것을 전자코로 분석하였다.
- 멜라민은 비휘발성 물질이지만 전자코에 있는 shaking incubater에서 일정 온도(70°C)의 열을 가하고 MS system에 의해 다시 ion fragment로 만들어준 후 생성된 일부 분해산물을 기반으로 분석하였다. 전자코로 측정된 10-200 amu 값들 중 멜라민이 나타내는 주요 amu 값인 41, 42, 43, 63, 68, 83, 85, 126, 127 amu에서 감응도 값들을 이용하여 DFA 통계처리를 통해 시료간의 차이와 멜라민 함량간의 관계로부터 멜라민의 함량을 분석하였다. DFA는 선택된 ion fragment를 나타내는 amu에서 감응도 값을 이용하여 종속변수에 영향을 주는 독립변수를 검정한 것으로 종속변수를 예측할 수 있는 판별함수값인 독립변수 중 영향력이 큰 DF1과 DF2로 시료간의 차이를 판별하였다.
- 판별함수 분석(DFA: discriminant function analysis)은 휘발성 향기 성분으로부터 생성되는 150여개 이상의 ion fragment 중 이온화되어 얻어진 분자들의 질량별 검출량을 기준으로 각 시료 간에 차별성이 높은 20-30여개의 fragments(m/z)를 독립변수로 선택하였다. 이때 선택한 amu값들은 멜라민의 mass spectrum에서 나타난 주요 ion fragment인 41, 42, 43, 63, 68, 83, 85, 126, 127을 선택하였다.
대상 데이터
- 시료는 자동시료채취기가 연결된 전자코(SMart Nose300, SMart Nose, Marin-Epagnier, Switzerland)로 분석하였다. 분석에 사용된 전자코는 질량분석기(Quadrapole Mass Spectrometer, Balzers Instruments, Marin-Epagnier, Switzerland)가 연결되어 있으며 휘발성 물질들은 70 eV에서 이온화시켜 180초 동안 생성된 이온물질을 사중극자(quadrupole)질량 필터를 거친 후 특정 질량 범위(10-200 amu)에 속하는 물질을 정수 단위로 측정하여 channel수로 사용하였다(13). 각각의 시료는 4회 반복을 실시하였다.
- 5 mL 취하였다. 시료는 자동시료채취기가 연결된 전자코(SMart Nose300, SMart Nose, Marin-Epagnier, Switzerland)로 분석하였다. 분석에 사용된 전자코는 질량분석기(Quadrapole Mass Spectrometer, Balzers Instruments, Marin-Epagnier, Switzerland)가 연결되어 있으며 휘발성 물질들은 70 eV에서 이온화시켜 180초 동안 생성된 이온물질을 사중극자(quadrupole)질량 필터를 거친 후 특정 질량 범위(10-200 amu)에 속하는 물질을 정수 단위로 측정하여 channel수로 사용하였다(13).
- 각 시료가 들어 있는 vial을 300 rpm으로 교반하면서 70°C를 유지하였고 주입구 온도는 130°C인 상태에서 주입하였다. 이 때 사용한 가스는 질소(99.999%, Donga Gas, Seoul, Korea)였으며 분당 230 mL의 유속으로 흘려보냈다. 데이터 수집시간은 3분이었으며 분석 후 purge는 3분간 지속되었고 시료 사이에서의 purge도 3분간을 유지하였다.
- 이 실험에서 사용된 멜라민, 요소, cyanuric acid는 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며 분유, 커피 크림(coffee whitener)은 서울 시내 대형마트에서 구입하였다. 임의의 농도인 멜라민과 각 제품을 혼합하여 제조한 시료는 10 mL vial(Pharma Fix.
- 판별함수 분석(DFA: discriminant function analysis)은 휘발성 향기 성분으로부터 생성되는 150여개 이상의 ion fragment 중 이온화되어 얻어진 분자들의 질량별 검출량을 기준으로 각 시료 간에 차별성이 높은 20-30여개의 fragments(m/z)를 독립변수로 선택하였다. 이때 선택한 amu값들은 멜라민의 mass spectrum에서 나타난 주요 ion fragment인 41, 42, 43, 63, 68, 83, 85, 126, 127을 선택하였다. 선택된 독립변수의 해당 감응도(intensity)값을 이용하여 다음의 식에 따라서 판별함수분석(DFA)을 실시하였으며 종속변수에 영향을 주는 독립변수를 검정하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하였으며 분유, 커피 크림(coffee whitener)은 서울 시내 대형마트에서 구입하였다. 임의의 농도인 멜라민과 각 제품을 혼합하여 제조한 시료는 10 mL vial(Pharma Fix. Chemmea, Slovakia)에 넣고 PTFE/silicone뚜껑으로 닫은 후 분석 시료로 사용하였다.
데이터처리
- 분유와 커피 크림에 멜라민을 첨가한 시료를 전자코로 분석하여 ion fragments값을 얻었으며 이를 통계분석하여 구한 DF1 값들과 멜라민 함량간의 상관관계식을 각각 구하였다(Table 1). x는 멜라민 함량(%)이고 y는 DF1 값이다.
- 이때 선택한 amu값들은 멜라민의 mass spectrum에서 나타난 주요 ion fragment인 41, 42, 43, 63, 68, 83, 85, 126, 127을 선택하였다. 선택된 독립변수의 해당 감응도(intensity)값을 이용하여 다음의 식에 따라서 판별함수분석(DFA)을 실시하였으며 종속변수에 영향을 주는 독립변수를 검정하였다.
성능/효과
- 본 분석방법은 멜라민 함량에 초점을 둔 것이기 때문에 통계처리시 멜라민의 mass spectrum에서 나타나는 ion fragment를 선택적으로 선별하였으며 멜라민 함량에 따라 DF1 값에 영향을 많이 받으므로 DF1 값을 중심으로 비교하였다. Cyanuric acid를 분유에 농도(4.7, 9, 13%)별로 혼합한 결과(Fig. 4A) 분유 자체만을 측정한 것과 cyanuric acid를 첨가한 것 간에 미세한 차이는 있으나 cyanuric acid 첨가량에 따라 DF1 값 간의 일정한 경향을 보이지 않았으며 농도에 따른 값 간의 차이도 적어 멜라민 분석에 cyanuric acid가 거의 영향을 주지 않는 것으로 보인다. 요소를 분유에 혼합하였을 때도(Fig.
- 그 결과 멜라민 함량이 증가함에 따라 판별함수 분석에서 얻은 DF1 값이 감소하였으며 분유와 커피 크림 모두 멜라민 함량이 증가함에 따라 DF1 값이 양의 방향에서 음의 방향으로 일정한 간격을 유지하는 경향을 보이며 위치하였다(Fig. 3). 또한 멜라민 첨가량과 DF1 값을 통해 얻은 상관관계식을 이용하여 미지의 시료를 적용한 결과 적은 오차 범위 내에서 멜라민의 함량 예측이 가능하였다(Table 1).
- 멜라민을 첨가하는 제품들에 대한 기존의 분석법의 한계를 극복하고자 전자코를 이용하여 멜라민 첨가 진위 여부와 첨가 함량의 차이를 분석하였다. 그 결과 멜라민을 분유와 커피 크림에 농도별로 첨가하였을 때 차이가 뚜렷이 구분되었으며 이를 통해 얻은 멜라민 농도와 DF1간의 상관관계식(분유: DF1= -0.006x(멜라민 농도)+0.327, 커피 크림: DF1= -0.006x+0.316)을 바탕으로 멜라민 함량을 적은 오차 범위 내에서 예측 가능하였다. 또한 멜라민을 urea로부터 합성하는 과정에서 생성되는 부산물인 cyanuric acid는 멜라민과 유사하여 기존의 분석방법으로는 쉽게 구분되지 않지만 전자코를 통하여 확연히 구분되었다.
- 3). 또한 멜라민 첨가량과 DF1 값을 통해 얻은 상관관계식을 이용하여 미지의 시료를 적용한 결과 적은 오차 범위 내에서 멜라민의 함량 예측이 가능하였다(Table 1). 이처럼 기존의 분석방법들과는 달리 전처리를 전혀 하지 않고도 빠른 시간 내에 멜라민의 첨가 유무를 전자코를 이용하여 분석하는 것이 가능하였다.
- 1B와 같다. 멜라민 첨가량이 증가할수록 전자코 결과에서 얻은 DF1 값은 일정하게 감소하는 경향이 뚜렷하게 나타났다.
- 또한 멜라민을 urea로부터 합성하는 과정에서 생성되는 부산물인 cyanuric acid는 멜라민과 유사하여 기존의 분석방법으로는 쉽게 구분되지 않지만 전자코를 통하여 확연히 구분되었다. 멜라민을 분유나 커피 크림에 첨가하였을 경우에는 농도별로 차이를 보였으며 urea 혹은 cyanuric acid 첨가 유무에 따라서는 미세한 차이는 보였지만 첨가양에 따른 일정한 경향을 나타나지 않은 것으로 보아 유사물질의 영향을 거의 받지 않으면서 멜라민 자체만의 분석이 가능한 것으로 보인다. 이러한 연구를 통하여 향후 미지의 멜라민 함량이 첨가된 1차 가공품에 대한 함유량을 분석하는 것이 가능하며 제품의 품질관리시 활용할 수 있는 대안을 제시할 수 있을 것이다.
- 4B) cyanuric acid와 마찬가지로 분유 자체만을 측정한 것과 요소를 농도별로 혼합한 것 간에 DF1값의 차이는 거의 없는 것으로 나타났으며 요소 첨가농도에 따른 경향도 보이지 않은 것으로 보아 본 분석방법이 요소 첨가 여부에 영향을 거의 받지 않는 것으로 보인다. 반면 분유에 멜라민을 농도별로 혼합한 결과(Fig. 4C) 분유에 멜라민 첨가량이 증가함에 따라 DF1 값이 양의 방향에서 음의 방향으로 일정한 경향을 보이며 뚜렷이 구분되어 위치하는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 본 분석방법이 cyanuric acid나 요소와 같은 유사물질의 영향을 거의 받지 않으면서 멜라민 자체만의 양을 분석 가능하다는 것을 보여주었다.
- 5C). 분유와 커피 크림에 cyanuric acid나 요소를 첨가하였을 때 영향을 아예 끼치지 않는다면 첨가 유무에 상관없이 시료 자체와 유사물질을 첨가한 처리구가 동일하게 나타나야 하지만 본 결과에서는 미세한 차이를 보이는 것으로 보아 본 분석방법이 멜라민뿐만 아니라 유사물질의 함유 여부에 따라 영향을 미세하게 받는 것으로 보인다. 그러나 이러한 차이에도 불구하고 유가공 제품에서 멜라민의 함유 여부는 신속하게 판정할 수 있었다.
- 4A) 분유 자체만을 측정한 것과 cyanuric acid를 첨가한 것 간에 미세한 차이는 있으나 cyanuric acid 첨가량에 따라 DF1 값 간의 일정한 경향을 보이지 않았으며 농도에 따른 값 간의 차이도 적어 멜라민 분석에 cyanuric acid가 거의 영향을 주지 않는 것으로 보인다. 요소를 분유에 혼합하였을 때도(Fig. 4B) cyanuric acid와 마찬가지로 분유 자체만을 측정한 것과 요소를 농도별로 혼합한 것 간에 DF1값의 차이는 거의 없는 것으로 나타났으며 요소 첨가농도에 따른 경향도 보이지 않은 것으로 보아 본 분석방법이 요소 첨가 여부에 영향을 거의 받지 않는 것으로 보인다. 반면 분유에 멜라민을 농도별로 혼합한 결과(Fig.
- 994로 멜라민 함량과 DF1 값 간에 높은 상관관계를 갖는 것을 확인하였다. 위에서 얻은 상관관계식은 결정계수(r2)가 1.0에 가까워 미지의 멜라민 함량이 첨가된 시료를 전자코로 분석하여 통계처리한 후 얻은 DF1 값을 대입하면 멜라민의 양을 예측할 수 있었다. 이를 토대로 미지의 멜라민 양을 첨가하였을 때 그 정도를 예측할 수 있는지 알아보기 위해 20, 40, 70, 90%의 멜라민을 분유, 커피 크림과 혼합한 것을 전자코로 분석하였다.
- 4C) 분유에 멜라민 첨가량이 증가함에 따라 DF1 값이 양의 방향에서 음의 방향으로 일정한 경향을 보이며 뚜렷이 구분되어 위치하는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 본 분석방법이 cyanuric acid나 요소와 같은 유사물질의 영향을 거의 받지 않으면서 멜라민 자체만의 양을 분석 가능하다는 것을 보여주었다.
- 6로 멜라민 함량에 따라 DF1값의 영향을 크게 받는 것을 알 수 있다. 이러한 결과를 통해 전자코를 이용하여 각 제품에 멜라민의 첨가 여부와 정량적인 분석 가능성을 확인하였으며 멜라민 함유량과 전자코에서 얻은 DF1값 간에 높은 상관관계를 보이는 것으로 보아 상관관계식을 통하여 멜라민 함량 예측이 가능할 것이라 여겨진다.
- 커피 크림에 멜라민을 첨가한 경우에도 분유와 마찬가지로 멜라민 함량에 따라 처리구들간의 차이가 뚜렷하게 구분되었으며(Fig. 2A) 멜라민 함유량이 증가함에 따라 DF1 값이 감소하는 경향을 보였다(Fig. 2B). 커피 크림의 경우 DF1 값이 r2=0.
후속연구
- 그러나 이러한 차이에도 불구하고 유가공 제품에서 멜라민의 함유 여부는 신속하게 판정할 수 있었다. 따라서 전자코를 이용한 멜라민 분석방법은 향후 제품의 품질관리에도 활용 가능할 것으로 기대된다. 본 방법은 전자코 분석을 이용한 1차 screening 방법으로서의 가능성 여부를 조사한 것으로 melamine의 함량 10-30% 정도로 많이 함유된 경우의 1차 가공품 분석에 용이하며 이러한 1차 가공품을 이용하여 제조 가공한 2, 3차 가공품의 함량은 제품의 matrix의 차이로 보다 정밀한 분석방법에 의해 이루어져야할 것이다.
- 이러한 위험성에도 불구하고 멜라민은 단백질 함량을 측정하는 과정에서 단백질과 유사한 구조로 인하여 검출하는데 어려움이 있다. 또한 멜라민은 urea로부터 합성이 되는데 합성되는 과정에서 멜라민 뿐 아니라 이와 유사한 cyanuric acid, ammelide, ammeline 등과 같은 유사물질도 함께 합성되어(3) 분석에 더욱 어려움을 주기 때문에 이러한 유사물질의 영향을 받지 않으며 멜라민 자체만의 함량을 분석할 수 있는 방법이 요구된다.
- 따라서 전자코를 이용한 멜라민 분석방법은 향후 제품의 품질관리에도 활용 가능할 것으로 기대된다. 본 방법은 전자코 분석을 이용한 1차 screening 방법으로서의 가능성 여부를 조사한 것으로 melamine의 함량 10-30% 정도로 많이 함유된 경우의 1차 가공품 분석에 용이하며 이러한 1차 가공품을 이용하여 제조 가공한 2, 3차 가공품의 함량은 제품의 matrix의 차이로 보다 정밀한 분석방법에 의해 이루어져야할 것이다.
- 멜라민을 분유나 커피 크림에 첨가하였을 경우에는 농도별로 차이를 보였으며 urea 혹은 cyanuric acid 첨가 유무에 따라서는 미세한 차이는 보였지만 첨가양에 따른 일정한 경향을 나타나지 않은 것으로 보아 유사물질의 영향을 거의 받지 않으면서 멜라민 자체만의 분석이 가능한 것으로 보인다. 이러한 연구를 통하여 향후 미지의 멜라민 함량이 첨가된 1차 가공품에 대한 함유량을 분석하는 것이 가능하며 제품의 품질관리시 활용할 수 있는 대안을 제시할 수 있을 것이다.
- 이를 토대로 유제품에 멜라민을 첨가하였는지 그 진위여부를 신속하게 파악(12)할 뿐 아니라 첨가량을 달리한 차이를 구분하여 정량적인 양까지도 예측하고자 한다. 이러한 연구를 통하여 향후 미지의 멜라민 함량이 첨가된 제품에 그 함유량을 분석 가능하게 하여 제품의 품질 관리시 활용할 수 있는 대안을 제시할 수 있을 것이다.
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