소 심낭의 무세포화에서 트립신이 이식편의 물리-역학적 및 조직학적 변화에 미치는 영향 Effect of Trypsin on Physico-dynamic and Histological Changes after Decellularization of Bovine Pericardium원문보기
배경: 이식편을 개발함에 있어서 숙주의 면역반응을 최소화하여 보다 더 오래 사용할 수 있게 하기위한 방법으로 무세포화에 대한 연구가 시행되고 있다. 저자들은 소 심낭의 무세포화의 과정에 효소제인 트립신 전처치가 물리역학적, 조직학적으로 미치는 영향에 대해 알아보고자 하였다. 대상 및 방법: 소 심낭편을 SDS와 Triton X-100 또는 N-lauroylsarcosinate와 Triton X-100으로 무세포화하는 것을 기본으로 한 군들과 0.1% 트립신/0.1% EDTA로 전처치를 추가한 군들에서 장력 검사를 실시하고, 생체 이식 후의 상태를 가정한 피로도 검사를 전후로 하여 투과도와 유순도는 검사하였고, 피로도 검사 전후로 조직학적인 변화를 광학현미경 및 전자현미경으로 관찰하였다. 결과: 트립신 처치를 추가한군과 아닌 군에서 기계적 장벽의 차이는 없었으나, 투과도와 유순도는 피로도검사 전과 후로 트립신 처치를 하지 않은 군에 비해 증가하였으며, 조직학적으로도 세포외 기질이 더 손상된 소견을 보였다. 걸론: 소 심낭의 무세포화에서 트립신 전처치는 세포외 기질의 손상을 유발하지만 기계적 장력에는 큰 영향을 미치지 않았으며, 피로도검사 전후 모두 투과도와 유순도를 증가시켰다. 무세포화과정에서 트립신과 같은 단백질 분해 효소제를 이용하기 위해서는 조직의 생체 물리적 손상을 최소화할 수 있는 다양한 방법을 조합한 연구가 더 필요하다.
배경: 이식편을 개발함에 있어서 숙주의 면역반응을 최소화하여 보다 더 오래 사용할 수 있게 하기위한 방법으로 무세포화에 대한 연구가 시행되고 있다. 저자들은 소 심낭의 무세포화의 과정에 효소제인 트립신 전처치가 물리역학적, 조직학적으로 미치는 영향에 대해 알아보고자 하였다. 대상 및 방법: 소 심낭편을 SDS와 Triton X-100 또는 N-lauroylsarcosinate와 Triton X-100으로 무세포화하는 것을 기본으로 한 군들과 0.1% 트립신/0.1% EDTA로 전처치를 추가한 군들에서 장력 검사를 실시하고, 생체 이식 후의 상태를 가정한 피로도 검사를 전후로 하여 투과도와 유순도는 검사하였고, 피로도 검사 전후로 조직학적인 변화를 광학현미경 및 전자현미경으로 관찰하였다. 결과: 트립신 처치를 추가한군과 아닌 군에서 기계적 장벽의 차이는 없었으나, 투과도와 유순도는 피로도검사 전과 후로 트립신 처치를 하지 않은 군에 비해 증가하였으며, 조직학적으로도 세포외 기질이 더 손상된 소견을 보였다. 걸론: 소 심낭의 무세포화에서 트립신 전처치는 세포외 기질의 손상을 유발하지만 기계적 장력에는 큰 영향을 미치지 않았으며, 피로도검사 전후 모두 투과도와 유순도를 증가시켰다. 무세포화과정에서 트립신과 같은 단백질 분해 효소제를 이용하기 위해서는 조직의 생체 물리적 손상을 최소화할 수 있는 다양한 방법을 조합한 연구가 더 필요하다.
Background: Various decellularization methods have been studied in order to develop tissue graft which is less immunogenic and more durable. This study was performed to investigate the physico-dynamic and histological effect of trypsin pretreatment on decellularization protocols. Material and Method...
Background: Various decellularization methods have been studied in order to develop tissue graft which is less immunogenic and more durable. This study was performed to investigate the physico-dynamic and histological effect of trypsin pretreatment on decellularization protocols. Material and Method: Two groups of bovine pericardium specimen each underwent decellularization process based on SDS and Triton X-100 or N-lauroylsarcosinate and Triton X-100. Two more groups additionally underwent pretreatment with 0.1% Trypsin/0.1% EDTA. After decellularization process, mechanical tensile strength was tested, then biomechanical test of permeability and compliance was tested before and after fatigue test. Light microscopy and electron microscopy was performed to observe histological findings. Result: There was no difference in mechanical tensile strength between groups, but permeability and compliance was decreased in trypsin pretreated groups. Light microscopic and electron microscopic findings revealed damage of the extracellular matrix in trypsin pretreated groups and in groups which underwent the fatigue test also. Conclusion: Trypsin pretreatment in decellularizing process of bovine pericardium damages extracellular matrix and increases permeability and compliance of the bovine pericardium, but did not decrease tensile strength. Further studies are needed to use enzymatic treatments in decellularization protocols.
Background: Various decellularization methods have been studied in order to develop tissue graft which is less immunogenic and more durable. This study was performed to investigate the physico-dynamic and histological effect of trypsin pretreatment on decellularization protocols. Material and Method: Two groups of bovine pericardium specimen each underwent decellularization process based on SDS and Triton X-100 or N-lauroylsarcosinate and Triton X-100. Two more groups additionally underwent pretreatment with 0.1% Trypsin/0.1% EDTA. After decellularization process, mechanical tensile strength was tested, then biomechanical test of permeability and compliance was tested before and after fatigue test. Light microscopy and electron microscopy was performed to observe histological findings. Result: There was no difference in mechanical tensile strength between groups, but permeability and compliance was decreased in trypsin pretreated groups. Light microscopic and electron microscopic findings revealed damage of the extracellular matrix in trypsin pretreated groups and in groups which underwent the fatigue test also. Conclusion: Trypsin pretreatment in decellularizing process of bovine pericardium damages extracellular matrix and increases permeability and compliance of the bovine pericardium, but did not decrease tensile strength. Further studies are needed to use enzymatic treatments in decellularization protocols.
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문제 정의
다음의 검사들을 피로도 검사 시행 전의 심낭편과 피로도 검사 시행 후의 심낭편에 각각 실험하여 피로도 검사시행 후의 변화를 알아보고자 하였다.
본 연구와 같은 무세 포화에 대한 연구를 통해 얻고자 하는 것은, 최대한 간단하면서도 많은 시간을 요하지는 않으면서 보다 경제적이면서도 적절한 무세포화를 달성하고, 그러면서도 인체 내의 환경에서 물리적이나 화학적으로 내구도가 높고 면역반응이 적은 이식편을 만들어내는 처치방법이다. 본 연구에서는 SDS 또는 N-lauroylsarcosinate와 Triton X-100을 이용하여 무세포화를 진행할 때 물리적, 기계적 장력을 측정하고 역학적 피로도 검사를 시행하여 각각의 무세 포화 과정 후 피로도 검사 전·후의 투과도와 유순도, 조직학적인 변화를 측정하여 이러한 조직을 생체에 이식하여 시간이 경과하였을 때를 가정하여 트립신 처리 여부와 세정제의 선택이 무세포화의 과정에 끼치는 물리-기계적 및 구조 조직학적인 영향을 알아보고자 하였다.
Triton X-100은 지질-지질 사이 및 지질-단백질 사이의 결합을 파괴시키나, 단백질-단백질간의 결합엔 손상을 끼치지 않으며 여러 이식편에 따라 서로 다른 연구 결과들이 보고되어 있다[10, 16-25]. 본 연구에서는 고장 성 및 저장성 처치, SDS 또는 N-lauroylsarcosinate, Triton-X 의 무세포화 과정에 앞서서 0.1% 트립신으로 비교적 단시간인 3시간동안 유지하여 이 처치과정이 여러 종류의 이식 편들 중 소 심낭에 끼치는 영향을 보고자 하였다. Wang 등은 돼지 대동맥 판막에서 0.
본 연구에서는 이종 소 심낭편을 사용하여 무세포화 (decellularization)를 진행할 때 SDS (Sodium dodecylsulfate) 와 Triton X-100, 또는 N-lauroylsarcoate과 Triton X-100의 세정제(detergent)를 조합하여 사용하였을 경우, 그리고 강력한 소화효소인 트립신(trrypsin)으로 먼저 처치를 한 후 세정 제(detergent)로 무세포화를 진행하였을 경우 자체적으로 개발한 장치를 통한 기계적 장력검사(mechanical tensile strength test)를 시행하여 장력을 측정하고 피로도 검사 (fatigue test)를 시행하여 피로도 검사 전·후의 생체-물리 역학적 (biomechanical) 변화를 측정하고 조직 학적인 변화를 현미경으로 관찰하여 트립신 처치와 세정제의 종류가 이식 편의 물리적, 조직학적 구조에 미치는 영향에대하여 알아보고자 하였다.
제안 방법
(1) 투과도 검사(peimeability test): 한 시간 동안 생리식염수로 심낭편의 한쪽에서 압력을 가한 후, 투과된 생리식염수의 양을 측정하여, 투과도로 정하였으며, 이를 mL/hxcm로 표시하였다.
(2) 유순도 검사'(compliance test): 각 처리과정을 마친 심낭 편에 생리식염수를 이용하여 100, 120, 140, 160, 180, 200 mmHg의 압력을 한쪽 면에 가한 후 심낭편이 늘어남으로 인해 변형된 부피를 측정하였다. 100 mmHg에서 200 mmHg까지 압력이 변하였을 때 변화한 심낭편의 쏠림으로 늘어난 부피를 유순도로 정하였으며, 이를 일반적으로 L/mmHg로 표시하였다.
(3) 조직학적 변화의 관찰(광학현미경 및 전자현미경): 피로도 검사 시행 전과 후의 조직학적인 소견을 hematox ylin-eosin 염색(H-E 염색) 후 광학현미경으로 관찰하였고, 전자현미 경 으로 조직 학적 인 변화를 관찰하였다.
1% PAA (peracetic acid)와 4% 에탄올(ethanol)이 섞인 용액에 1시간 동안 담가 둔 후 30분간 증류수로 철저히 세척하는 과정을 거친 후, 무세포화 과정 중 트립신 전처치 과정이 추가된 군을 1과 2군으로 하였고, 트립신 처치를 하지 않은 군을 3과 4군으로 하였으며 각 무세포화 과정은 다음과 같다. 각각의 세정제로 무세포화를 거친 후 모든 이식 편은 등장성 용액에 4℃에서 30분 세척 1% Triton X-HX)이 혼합된 등장성용액에 WC에서 18시간, 등장성용액에 4℃에서 30분 세척, 고장성용액(II)어I 4℃에서 6시간, PBS 용액에 ' 4℃에서 3시간 세척하는 과정을 거쳤다.
고정은 0.6% 글루타르알데히드(glutaraldehyde, GA) 용액에 상온에서 2일 -송 0.5% GA용액과 75% 에탄올, 그리고 5% 옥탄올(octanol)이 혼합된 용액에 42℃에서 2일 유지한 후 0.25% GA 용액에 상온에서 1주일간 보관하였으며, 실험 전 등장액에 충분한 세척을 시행하였다.
글루타알데히드를 이용하여 고정만 시행하고 무세 포화 과정은 거치지 않은 심낭편을 대조군으로 하였고, 이 대조군과 SDS를 사용한 1군과 3군을 피로도검사 전 - 후로 전자현미경으로 20, 000배 배율에서 관찰하였다(Fig. 4). 전자현미경으로 관찰한 조직의 소견으로, 무세포화를 시행하지 않은 심낭편은 섬유소(collagen fiber)가 원래 모습대로 굵고 치밀하나, 무세포화 후에는 섬유소가 가늘어지고 치밀함이 감소하였고, trypsin 처치군과 trypsin 비처치군과의 큰 차이는 보이지 않았으나 피로도 검사 전과 후를 비교해 보았을 경우 치밀함이 떨어지고, gap이나 작은 미세공간이 관찰되어 micropore를 증가시킴으로써 조직의 투과도나 유순도를 증가시키고, 피로도검사에 취약하게 할 것으로 생각된다.
소 심낭편을 차가운 생리식염수로 세척한 후 0.1% PAA (peracetic acid)와 4% 에탄올(ethanol)이 섞인 용액에 1시간 동안 담가 둔 후 30분간 증류수로 철저히 세척하는 과정을 거친 후, 무세포화 과정 중 트립신 전처치 과정이 추가된 군을 1과 2군으로 하였고, 트립신 처치를 하지 않은 군을 3과 4군으로 하였으며 각 무세포화 과정은 다음과 같다. 각각의 세정제로 무세포화를 거친 후 모든 이식 편은 등장성 용액에 4℃에서 30분 세척 1% Triton X-HX)이 혼합된 등장성용액에 WC에서 18시간, 등장성용액에 4℃에서 30분 세척, 고장성용액(II)어I 4℃에서 6시간, PBS 용액에 ' 4℃에서 3시간 세척하는 과정을 거쳤다.
위의 전 과정에서 보조 물리적 방법으로 자체 고안한 진탕기(vibrator)를 이용하여 분당 3(X)회 이상 회전 진동하였다.
구하였다. 장력을 측정하는 데에는 스탠드(푸쉬풀전동 스탠드, K-ML-1000N, M-TECH, Korea)와 계측기 디지털 포스 게이지, DS2-50N, IMADA, Japan)를 이용하였고, 심낭편이 파열되기까지의 장력(tensile stress at break point)을 MPa (N/mnf)로 나타내었다.
9% 생리식염수에 항생제용액(antibiotic antimycotic solution (100x) stabilized, Sigma 를 희석하여 1 mL에 penicillin G 100 uints, streptomycin sulfate 100 u g, amphotericin B 250 g을 포함하도록 첨가)을 첨가한 것을 이용, 내부압력은 평균 80 mmHg로 하여 240 rpm (4 Hz)에서 45일간 실험하였다. 정상인의 심박동수로 가정하여 기준이 될 심박동수를 60으로 가정히, 여, 60 rpm의 4배인 240 rpm으로 45일간 시행하여 6개월 동안 판막이 움직인 결과와 같은 상태를 예상해 보았다.
직경 25 mm인 원 모양의 심낭편에 박동성의 압력을 반복해서 가할 수 있는 장치를 고안하였고, 이를 이용하여각 처리과정을 마친 심낭편에 0.9% 생리식염수에 항생제용액(antibiotic antimycotic solution (100x) stabilized, Sigma 를 희석하여 1 mL에 penicillin G 100 uints, streptomycin sulfate 100 u g, amphotericin B 250 g을 포함하도록 첨가)을 첨가한 것을 이용, 내부압력은 평균 80 mmHg로 하여 240 rpm (4 Hz)에서 45일간 실험하였다. 정상인의 심박동수로 가정하여 기준이 될 심박동수를 60으로 가정히, 여, 60 rpm의 4배인 240 rpm으로 45일간 시행하여 6개월 동안 판막이 움직인 결과와 같은 상태를 예상해 보았다.
피로도 검사 시행 전·후의 조직학적 양상을 H-E 염색 후 관찰하였고, 100배의 배율과 400배의 배율에서 각각 관찰하였다(Fig. 2, 3). 모든 군에서 무세포화는 잘 시행되어 세포 성분이 관찰되지 않았고, 피로도 검사 시행 전 1 군과 3군, 2군과 4군을 서로 비교해 보았을 때 트립신 처치를 한 1군과 2군보다 3군과 4군에서 조직이 더 치밀한 소견을 관찰할 수 있었다.
피로도 검사 전의 투과도를 먼저 측정하였고, 각 군마다 샘플의 수는 4개씩 총 16개였다(Table 2). 1군과 3군, 2 군과 4군을 짝을 이루어 비교해 봤을 때 통계적으로 유의한 차이를 보였으며(p-value 0.
피로도 검사를 시행하지 않은 5x50 mm 크기의 심 낭편에서 양 끝과 가운데 25 mm지점에서 심낭의 두께를 측정하고(Quick-Mini, PK-1012SU, MITUTOYO, Japan) 세 값의 평균 값을 구하였다. 장력을 측정하는 데에는 스탠드(푸쉬풀전동 스탠드, K-ML-1000N, M-TECH, Korea)와 계측기 디지털 포스 게이지, DS2-50N, IMADA, Japan)를 이용하였고, 심낭편이 파열되기까지의 장력(tensile stress at break point)을 MPa (N/mnf)로 나타내었다.
대상 데이터
Grauss 등은 동일한 노출 시간과 더 높은 트립신 농도에서도 쥐 대동맥 판막에서 효과적인 무세포화를 달성하지 못하였다고 보고하였고, 반면 Schenke-Layland 등은 같은 조건에서 돼지 폐동맥 판막에서 완전한 무세포화를 보고하였다[13, 15]. 본 연구에서 사용된 세정제들 중 SDS와 N-lauroylsarcosi-nate는 이온성 세정제이며, Triton X-100은 비이온성 세정제이다. 이 중 특히 SDS의 경우 세포질과 핵막을 용해시키며, 단백질을 변성시키는 경향이 있어서 본래 조직의 구조를 파괴하는 경향이 있으며 글리코스아미노글리칸 (GAGs) 을 제거하며 콜라겐에 손상을 입힌다.
이종 소 심낭편 및 모든 이종 조직편은 도살장에서 수의사의 협조 하에 건강한 소를 도살한 후에 즉시 심낭을 무균적으로 적출하여 4℃의 phosphate buffered solution (PBS, 0.1 M, pH 7.4)에 넣어 아이스박스에 보관한 채로 실험에 사용하였다.
데이터처리
SPSS 12.0 K for Windows! 사용, 기술통계를 시행하였고, Kruskal-Wallis, Mann-Whitney 검정으로 트립신 처치를 한 무세포화군과 하지 않은 무세포화군을 서로 비교하였고, Wilcoxon signed rank test를 이용하여 피로도검사 전과 후의 각각의 군을 비교하였다
성능/효과
샘플의 수는 4개씩 총 16개였다(Table 2). 1군과 3군, 2 군과 4군을 짝을 이루어 비교해 봤을 때 통계적으로 유의한 차이를 보였으며(p-value 0.02/0.02), 트립신 처치를 한 군에서 투과도가 높게 나타났다. 이후 피로도 검사 후의 투과도를 측정하였고(Table 3), 여기에서도 1군과 3군, 2군과 4군을 비교해 보았을 때 트립신 처치를 한 군에서 투과도가 높게 나타났다(p-vahie 0.
SDS, N-lauroylsarcosinate, Triton-X 등의 세정제를 이용한 무세포화 과정에 앞선 3시간의 0.1% 트립신/0.1%EDTA 처치는 소 심낭편의 기계적 장력은 감소시키지 않았으나 투과도나 유순도는 피로도 검사 전과 후로 증가시켰고, 조직학적 소견의 관찰에서 세포 외 기질의 손상을 확인할 수 있었다. 그러나 여러 방법으로 트립신 전 처치 과정을 조합하여 이후의 세정제들로 인한 무세포화 작용을 강화시킴으로써 , 세정제들에의 노출시간을 감소시킴으로써 전체적인 무세포화 과정에 걸리는 시간을 단축시키는 데 이용해 볼 수 있을 것으로 생각된다.
또한 SDS 처리군과 N-lauroylsarcosinate 처리군을 1군과 2 군, 3군과 4군으로 짝지어 피로도 검사 전과 후를 비교해보았을 경우 통계적으로 유의한 차이는 보이지 않았으나, 적은 수의 샘플 수를 고려할 때 제시한 Table의 결과와 그림(Fig. 1)에서 보이듯이 저농도 SDS 세정제 처리군은 N-la-uroylsarcosinate 처리군에 비하여 피로도 검사 이후 투과도 및 유순도에서 약간 우수할 수 있을 것으로 생각된다.
2, 3). 모든 군에서 무세포화는 잘 시행되어 세포 성분이 관찰되지 않았고, 피로도 검사 시행 전 1 군과 3군, 2군과 4군을 서로 비교해 보았을 때 트립신 처치를 한 1군과 2군보다 3군과 4군에서 조직이 더 치밀한 소견을 관찰할 수 있었다. 피로도 검사 시행 전과 후를 서로 같은 군끼리 비교해 볼 때, 피로도 검사 후에 조직 의치 밀도가 더 떨어져 보임을 관찰할 수 있었디.
폐동맥판막 이식편을 트립신/ EDTA에 장시간 노출시킬 때 세포외 기질의 구조는 변형되지만 조직의 콜라겐 함량은 변화하지 않으며, 세포외기질의 라미닌(laminin)과 피브로넥틴(fibronectin)의 함량은감소되고 시간이 지남에 따라 조직의 elastin content와 Glycosaminoglycans (GAGs)가 감소하여 세포 외 기질(extracellular matrix)의 조성을 변화시키고, 이는 조직의 장력을 50%까지 감소시킬 수 있기 때문에 세포 외 세부구조와 성분의 파괴를 최소화하려면 트립신/EDTA에 노출되는 시간을 제한하는 것이 바람직하다고 알려져 있다[10, 13, 14]. 본 연구에서는 0.1% 트립신/0.1% EDTA에서 3시간동안 유지하였고, 기계적 장력 검사결과에서는 트립신 전처치를 한 군에서 트립신 전처리를 하지 않은 군보다 오히려 높게 나타났고, 장력의 감소는 없는 것으로 나타났다. 하지만 투과도와 유순도에서는 트립신 처치를 한 군이 트립신 처치를 하지 않은 군보다 피로도 검사의 시행과 관계없이 더 높게 나타났으며, 트립신 처치를 한 군의 많은 샘플에서 유순도 검사시 누수가 있었던 점을 볼 때, 트립신 처치를 한 군에서 세포 외 기질의 변화가 더 심함을 알 수 있다.
02), 트립신 처치를 한 군에서 투과도가 높게 나타났다. 이후 피로도 검사 후의 투과도를 측정하였고(Table 3), 여기에서도 1군과 3군, 2군과 4군을 비교해 보았을 때 트립신 처치를 한 군에서 투과도가 높게 나타났다(p-vahie 0.02/0.02). 피로도 검사 전 후의 투과도를 같은 군끼리 비교하였고, 오히려 피로도검사를 시행한 후의 투과도는 피로도 검사를 시행하기 전의 투과도와 큰 차이가 없는 것으로 나타났다(pvalue 0.
4). 전자현미경으로 관찰한 조직의 소견으로, 무세포화를 시행하지 않은 심낭편은 섬유소(collagen fiber)가 원래 모습대로 굵고 치밀하나, 무세포화 후에는 섬유소가 가늘어지고 치밀함이 감소하였고, trypsin 처치군과 trypsin 비처치군과의 큰 차이는 보이지 않았으나 피로도 검사 전과 후를 비교해 보았을 경우 치밀함이 떨어지고, gap이나 작은 미세공간이 관찰되어 micropore를 증가시킴으로써 조직의 투과도나 유순도를 증가시키고, 피로도검사에 취약하게 할 것으로 생각된다.
샘플의 수는 4캐씩 총 16개였다(Table 4). 투과도 비교와 같은 방식으로 짝지어 비교하였을 때 트립신 처치를 한 군에서 유순도가 높게 나타났으며(p-value 0.02/0.02), 피로도 검사 후에 시행한 유순도 검사(Table 5)에서도 트립신 처치를 한 군에서 유순도가 높은 것으로 나타났다 (p-value 0.02/0.02). 그러나 피로도 검사 전과 후의 유순도를 서로 같은 군끼리 짝지어 비교해 보았을 때, 유순 도는 의미 있는 차이를 보이지 않았으나(p-value 0.
02). 피로도 검사 전 후의 투과도를 같은 군끼리 비교하였고, 오히려 피로도검사를 시행한 후의 투과도는 피로도 검사를 시행하기 전의 투과도와 큰 차이가 없는 것으로 나타났다(pvalue 0.144/0.456/0.068/0.068).
후속연구
1%EDTA 처치는 소 심낭편의 기계적 장력은 감소시키지 않았으나 투과도나 유순도는 피로도 검사 전과 후로 증가시켰고, 조직학적 소견의 관찰에서 세포 외 기질의 손상을 확인할 수 있었다. 그러나 여러 방법으로 트립신 전 처치 과정을 조합하여 이후의 세정제들로 인한 무세포화 작용을 강화시킴으로써 , 세정제들에의 노출시간을 감소시킴으로써 전체적인 무세포화 과정에 걸리는 시간을 단축시키는 데 이용해 볼 수 있을 것으로 생각된다. 트립신 처치를 세정제에 조합해서 피로도검사 전이나 후의 투과도나 유순도에큰 영향이 없는 무세포화 과정을 만들기 위해서는 부다 더 저농도의 트립신을 사용하던가, 트립신에의 노출 시간을 더 감소시키던가, 또는 세정제에의 노출시간을 감소시키는 등 여러 방법의 무세포화에 대한 연구가 필요하다 또한 앞서 인용했던 연구들에서 보여졌듯이 무세 포화의 효율은 각각의 조직에 따라서 다르기 때문에, 소 심낭 뿐만이 아닌 다른 조직들에서의 트립신 등의 효소 사용과, 서로 다른 세정제 종류와 선택에 따른 효과에 대해서도 추가적인 연구가 시행되어야 할 것이다.
그러나 여러 방법으로 트립신 전 처치 과정을 조합하여 이후의 세정제들로 인한 무세포화 작용을 강화시킴으로써 , 세정제들에의 노출시간을 감소시킴으로써 전체적인 무세포화 과정에 걸리는 시간을 단축시키는 데 이용해 볼 수 있을 것으로 생각된다. 트립신 처치를 세정제에 조합해서 피로도검사 전이나 후의 투과도나 유순도에큰 영향이 없는 무세포화 과정을 만들기 위해서는 부다 더 저농도의 트립신을 사용하던가, 트립신에의 노출 시간을 더 감소시키던가, 또는 세정제에의 노출시간을 감소시키는 등 여러 방법의 무세포화에 대한 연구가 필요하다 또한 앞서 인용했던 연구들에서 보여졌듯이 무세 포화의 효율은 각각의 조직에 따라서 다르기 때문에, 소 심낭 뿐만이 아닌 다른 조직들에서의 트립신 등의 효소 사용과, 서로 다른 세정제 종류와 선택에 따른 효과에 대해서도 추가적인 연구가 시행되어야 할 것이다.
하지만 투과도와 유순도에서는 트립신 처치를 한 군이 트립신 처치를 하지 않은 군보다 피로도 검사의 시행과 관계없이 더 높게 나타났으며, 트립신 처치를 한 군의 많은 샘플에서 유순도 검사시 누수가 있었던 점을 볼 때, 트립신 처치를 한 군에서 세포 외 기질의 변화가 더 심함을 알 수 있다. 트립신 처치를 한 1군과 2군에서의 투과도와 유순도 는 많이 증가되어 sample간의 격차가 크게 나타났으며, 각 군마다 sample수가 4개로 부족한 점은 본 연구의 제한점으로 생각된다.
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