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문제 정의
- 따라서 본 연구는 단백질 약물을 함유하는 나노크기의 수화젤(나노젤)을 제조하는데 있어서 inverse miniemulsion방법을 사용하되 짧은 시간 내에 제조하고 유기용매를 증발시킬 필요 없이 젤을 회수할 수 있도록 하는 방법을 사용함으로써, 기존의 공정시간보다 줄이면서 포함된 단백질 약물의 안정도를 높일 수 있는 지 여부를 조사하고자 한다. 또한 제조된 수화젤의 제조 조건에 따라 그 물리화학적 특성과 약물 방출 양상을 비교함으로써 제조된 나노젤이 단백질 약물의 전달체로 활용할 수 있는 지 그 가능성을 연구하고자 한다.
- 따라서 본 연구는 단백질 약물을 함유하는 나노크기의 수화젤(나노젤)을 제조하는데 있어서 inverse miniemulsion방법을 사용하되 짧은 시간 내에 제조하고 유기용매를 증발시킬 필요 없이 젤을 회수할 수 있도록 하는 방법을 사용함으로써, 기존의 공정시간보다 줄이면서 포함된 단백질 약물의 안정도를 높일 수 있는 지 여부를 조사하고자 한다. 또한 제조된 수화젤의 제조 조건에 따라 그 물리화학적 특성과 약물 방출 양상을 비교함으로써 제조된 나노젤이 단백질 약물의 전달체로 활용할 수 있는 지 그 가능성을 연구하고자 한다.
제안 방법
- 1%(w/v)의 AP 수용액 40 μL과 TEMED 20 μL를 첨가한 후 sonicator(HD2070, Sonoplus)를 이용하여 정해진 시간에 따라 초음파처리(출력 90%) 하였다.
- 제조된 나노젤 입자의 크기 분석은 particle size analyzer(BI-90 Plus, Brookhaven, USA)를 이용하여 분석하였다. 10 mL의 큐벳에 나노젤을 10%로 증류수를 이용하여 희석하였으며, 나노젤의 크기를 측정하기 직전에 10초동안 초음파(30 Hz)처리를 거쳐 입자의 크기를 측정하였다. 입자의 사이즈는 1분간 10초 간격으로 6번 측정하였다.
- 4℃를 유지한 상태에서 UV/VIS Spectrometer (S-3100, Sinco)를 이용하여 2분 동안 10초 간격으로 450 nm에서 감소하는 흡광도(A)의 변화(ΔA/min)를 측정하였으며,13) 첨가된 라이소자임의 질량에 대한 흡광도의 변화율(ΔA/min/mg)을 라이소자임 활성도(lysozyme activity)로 정하였다.
- Inverse-miniemulsion polymerization 방법을 이용한 나노젤의 제조과정은 Figure 1에서 나타내었다. Acrylamided와 bis-methylene acrylamide의 농도 및 초음파처리의 시간에 따라 다양한 나노젤을 제조하였으며 각 제조조건은 아래 Table I과 같다. 주어진 농도의 acrylamide, bis-methylene acrylamide 및 라이소자임을 녹인 수용액 10 mL (수용액층)를 50 mL의 튜브에 넣은 후, 0.
- 초음파가 처리되는 동안 고분자 중합반응이 완료되어 나노젤이 형성되며, 초음파처리가 끝난 후 일정시간 안정화 시키면 다시 층 분리가 일어나게 되고 나노젤은 하부층인 수용액층에 모이게 된다. 라이소자임의 활성을 유지하기 위해 상기의 실험과정은 저온(4℃)을 유지한 상태에서 진행하였으며, 특정하게 언급되지 않은 경우, 하부층에서 취한 나노젤을 즉시 사용하였다.
- 마지막으로, 단량체로 사용된 acrylamide 농도(5, 10, 30, 50%)를 변화시키면서 그 특성을 관찰하였다. Figure 2 (C)에서와 같이, acrylamide의 농도가 높아질수록 대체로 나노젤 입자의 크기는 더 커지고 라이소자임의 활성도는 더 작아지는 경향을 관찰할 수 있었으나 오차의 범위를 고려하였을 때 유의미한 변화는 아니었다.
- 4)에 넣어 37℃의 인큐베이터에서 intelli-mixer (MyLab, SLRM-2M)를 이용하여 흔들며 보관하였다. 정해진 시간마다 1 mL를 뽑아 낸 후 10000 rpm로 1분간 원심분리(Biospin, Hanil)하여 상층부를 추출하였고 UV/VIS spectrometer (S-3100, Scinco) 이용하여 흡광도를 측정하였다. 상층부에 포함된 라이소자임의 농도는 아래의 Warburg-Christian방법12)을 이용하여 결정하였다.
- 제조된 나노젤 입자의 크기 분석은 particle size analyzer(BI-90 Plus, Brookhaven, USA)를 이용하여 분석하였다. 10 mL의 큐벳에 나노젤을 10%로 증류수를 이용하여 희석하였으며, 나노젤의 크기를 측정하기 직전에 10초동안 초음파(30 Hz)처리를 거쳐 입자의 크기를 측정하였다.
대상 데이터
- 나노젤을 제조하기 위해 N-hepthane, span80, acrylamide, bis-methylene acrylamide, ammonium persulfate (AP), N,N,N',N'-tetramethylethylene diamine (TEMED)과, 모델약물로써 라이소자임 (lysozyme)을 사용하였으며, 라이소자임 활성도 평가를 위해서 Micrococcus lysodeikticus 박테리아를 사용하였다.
- 나노젤을 제조하기 위해 N-hepthane, span80, acrylamide, bis-methylene acrylamide, ammonium persulfate (AP), N,N,N',N'-tetramethylethylene diamine (TEMED)과, 모델약물로써 라이소자임 (lysozyme)을 사용하였으며, 라이소자임 활성도 평가를 위해서 Micrococcus lysodeikticus 박테리아를 사용하였다. 이들 모두 Sigma-Aldrich Korea Inc. (Seoul)에서 구입하였으며 다른 화학적 처리 없이 사용하였다. 라이소자임을 제외한 모든 재료는 실험 30분전에 4℃에서 보관하여 사용하였다.
이론/모형
- 본 연구에서는 나노젤을 형성하기 위해 이용하는 inverse-miniemulsion 방법을 사용하였고 나노 크기의 수화젤 및 높은 라이소자임 활성도를 얻을 수 있었다. 이는 일반적으로 유기용매를 제거하기 위해 사용되는 증발방법을 생략하게 되고 짧은 시간 안에 입자의 제조가 완료됨으로써 가능하였다고 판단된다.
- 정해진 시간마다 1 mL를 뽑아 낸 후 10000 rpm로 1분간 원심분리(Biospin, Hanil)하여 상층부를 추출하였고 UV/VIS spectrometer (S-3100, Scinco) 이용하여 흡광도를 측정하였다. 상층부에 포함된 라이소자임의 농도는 아래의 Warburg-Christian방법12)을 이용하여 결정하였다.
성능/효과
- 5) 하지만 이와 같은 고분자 마이크로 및 나노입자를 이용해 단백질 약물을 전달하는 경우에는, 고려해야 할 몇 가지 문제점이 있는 것으로 알려져 있다.6) 입자를 제조하기 위해서는 고분자를 녹이기 위한 유기용매의 사용이 필수적인데, 이 과정에서 단백질이 유기용매에 접촉하게 되면 변성이 일어날 수 있게 된다. 또한 유기용매가 제거되고 입자가 제조되면 단백질은 소수성인 고분자와 접촉할 기회가 생기게 되고 이 또한 단백질 변성의 한 요인이 될 수 있다.
- 이는 높은 농도의 단량체가 고분자중합 반응동안 더 많은 열을 생성하게 되고 이는 라이소자임 활성도에 부정적인 영향을 미쳤다고 판단된다. 결론적으로 본 연구에 제시된 inverse miniemulsion방법은 비교적 공정이 간단하고, 약물 봉입을 위한 2차 공정을 필요치 않으며, 신속하게 유기용매 제거가 가능하다는 면에서 유기용매에 예민한 단백질 약믈을 전달하기 위한 나노젤을 제조하는 방법으로 유용한 방법이라고 생각된다. 다만 아직 약물의 방출속도가 비교적 빠르기 때문에 이를 적절히 조절하기 위한 추가적인 연구가 필요하다고 판단되며, 동물실험 등의 추가적인 연구를 통해 그 유용성을 확인할 필요가 있을 것이다.
- 이는 크기의 변화와 수화젤 내부 구조의 차이에 기인한다고 판단된다. 라이소자임 활성도에 있어서는 초음파 처리시간이 짧은 수록 높은 활성도 수치를 나타내었으며, acrylamide와 bis-methylene acrylamide의 농도가 높을수록 라이소자임의 활성도가 저하됨을 확인하였다. 이는 높은 농도의 단량체가 고분자중합 반응동안 더 많은 열을 생성하게 되고 이는 라이소자임 활성도에 부정적인 영향을 미쳤다고 판단된다.
- 라이소자임 활성도의 경우에는 모든 경우에 90% 이상의 활성도를 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 제조과정에 유기용매를 사용하였음에도 90% 이상의 높은 활성도를 가졌다는 것은 본 연구에서 제시된 제조과정을 이용하게 되면 유기용매의 영향을 최소화할 수 있다는 것을 보여준다.
- 먼저 초음파 처리시간(10초-60초)에 따른 나노젤의 평균 입자크기를 관찰하였을 때, 초음파 처리시간이 길어질수록 평균입자의 크기는 작아지는 것을 관찰할 수 있었다. (Figure 2 (A)) 비록 오차의 범위를 고려하였을 때 유의미한 차이를 보이지 않는 경우도 있었으나 초음파 처리시간과 평균 입자 크기의 상관 관계 및 그 경향성은 충분히 관찰할 수 있었다.
- 05) 이는 초음파 처리시간이 길어질수록 생성되는 에멀젼의 크기가 작아지고 이에 따라 최종 생성되는 나노젤의 크기 또한 작아지게 되는 것이라 판단된다. 반면에 초음파처리 시간이 길어질수록 초기 라이소자임의 활성도를 떨어지는 것으로 관찰되었다. 이는 초음파가 직접적으로 라이소자임의 활성에 직접 영향을 미쳤거나 초음파를 가했을 때 발생되는 열에 의해 라이소자임이 손상되었을 수도 있었다고 생각된다.
- 입자의 크기에서는 초음파 처리 시간이 길어질수록, 입자의 크기가 작아지며, acrylamide의 농도가 증가할수록 입자의 크기가 증가한다. 방출테스트에 있어서는 초음파 처리 시간이 길어질수록 그리고 acrylamide 농도가 감소할수록 빠른 방출이 있어났으며, acrylamide 농도의 변화가 더 큰 효과를 나타내었다. 이는 크기의 변화와 수화젤 내부 구조의 차이에 기인한다고 판단된다.
- Figure 3 (A)에서 보는 바와 같이 초음파의 처리시간(10초-60초)이 길어질수록 라이소자임의 방출속도가 증가하고 있음을 관찰할 수 있었다. 입자크기에서와 같이, 오차 범위를 감안하면 비록 그 차이가 유의미하지 않은 경우도 있으나 그 경향은 관찰할 수 있으며, 10초와 60초의 경우를 비교하면 의미 있는 차이를 관찰할 수 있었다. (p<0.
- 라이소자임 활성도의 경우에는 모든 경우에 90% 이상의 활성도를 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 제조과정에 유기용매를 사용하였음에도 90% 이상의 높은 활성도를 가졌다는 것은 본 연구에서 제시된 제조과정을 이용하게 되면 유기용매의 영향을 최소화할 수 있다는 것을 보여준다. 다시말해, 초음파처리를 통해 에멀젼이 생성되는 짧은 시간(10초-60초)동안만 에멀젼의 표면에서 유기용매를 접촉할 기회가 있으며, 또한 빠른 시간 안에 수용액층으로 다시 모이게 됨으로써 단백질의 활성도를 최대한 유지할 수 있을 것으로 생각된다.
- 반면에, acrylamide의 농도에 따른 방출특성을 비교하였을 때, acrylamide의 농도가 변함에 따라 보다 현저한 방출속도의 차이를 관찰할 수 있었다 (Figure 3(C)). 즉, acrylamide의 농도가 높을수록 보다 현저하게 느린 방출속도를 나타내었다. 앞서 언급한 대로 acrylamide의 농도가 높을수록 입자의 크기가 커지는 경향이 있기 때문에 이에 대한 영향으로 볼 수도 있다.
후속연구
- 결론적으로 본 연구에 제시된 inverse miniemulsion방법은 비교적 공정이 간단하고, 약물 봉입을 위한 2차 공정을 필요치 않으며, 신속하게 유기용매 제거가 가능하다는 면에서 유기용매에 예민한 단백질 약믈을 전달하기 위한 나노젤을 제조하는 방법으로 유용한 방법이라고 생각된다. 다만 아직 약물의 방출속도가 비교적 빠르기 때문에 이를 적절히 조절하기 위한 추가적인 연구가 필요하다고 판단되며, 동물실험 등의 추가적인 연구를 통해 그 유용성을 확인할 필요가 있을 것이다.
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