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문제 정의
- 또한 콜라겐은 중심관을 감싸고 있는 골층판에 무기질과 함께 섬유질 형태로 밀집되어 있다. 따라서 골소강과 골층판 구조에 대해 평가함으로써 DNA와 콜라겐의 보존성 예측할 수 있다.
- 발굴 시 안전하게 시료 채취가 이루어진 조선시대 인골은 분석 결과의 신뢰성이 매우 높다. 또한 토광묘 가운데 회곽묘와 같이 계층적으로 조성된 묘제를 인골의 생화학적 분석 결과와 비교함으로써 피장자의 생존 당시 반상(班常), 남녀(男女)의 차이 등 사회적 관계가 인골에 어떻게 반영되었는지 연구할 수 있다. 특히 인구통계, 지방사, 가족사 등의 풍부한 사료와 연구결과를 비교할 수 있기 때문에 고고학적 해석에 의한 검증과 과학적 일반화에 유리하다.
- 본 연구에서 수행한 미토콘드리아 DNA 변이형 및 아밀로제닌 유전자 분석과 매장양식을 종합적으로 고려하여 피장자들의 친연관계와 유전적인 특징을 다음과 같이 고찰할 수 있다. 갓재골 5호 회곽묘에 동혈합장 된 피장자들의 미토콘드리아 DNA 변이형은 서로 다른 것으로 나타났다.
- 본 연구에서는 충청남도 서천군 옥남리 유적에서 출토된 조선시대 인골 4구을 대상으로 조직 분석, 고DNA 분석, 안정동위원소 분석에 대한 각각의 원리와 목적을 간단히 설명하면서 서천 옥남리 피장자(被葬者)들의 유전적 특징과 식생활에 대하여 종합적인 연구결과를 제시하였다. 이를 토대로 조선시대 인골에 대한 생화학적 연구의 유용성과 중요성에 대하여 논의하였다.
- 본 연구에서는 충청남도 서천군 옥남리 유적에서 출토된 조선시대 인골 4구을 대상으로 조직 분석, 고DNA 분석, 안정동위원소 분석에 대한 각각의 원리와 목적을 간단히 설명하면서 서천 옥남리 피장자(被葬者)들의 유전적 특징과 식생활에 대하여 종합적인 연구결과를 제시하였다. 이를 토대로 조선시대 인골에 대한 생화학적 연구의 유용성과 중요성에 대하여 논의하였다.
제안 방법
- 중합효소연쇄반응 조건은 초기 변성(initiate denaturation)을 95℃에서 15분 동안 1회 실시하도록 한 후 95℃에서 30초간 변성(denaturation), 58℃에서 30초간 풀림(annealing), 72℃에서 30초간 신장(extension) 과정을 40회 반복하며 최종 신장(final extension)을 72℃에서 10분간 반응 하도록 설정하였다. DNA 증폭장치(ABI veriti, Applied Biosystems)로 PCR 반응을 수행한 후 자동전기영동장치(HDA-GT12, eGene)를 이용하여 증폭 산물을 확인하였다. 증폭된 산물은 정제 키트(QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen)를 이용하여 순수 분리한 후 유전자검출기(CEQ8000, Beckman coulter)로 시퀀싱 반응을 수행하여 염기서열을 결정하였다.
- DNA 분석용 시편의 경우 표면의 미생물과 핵산 오염물의 화학적 제거를 위해 시편을 6% 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite, Sigma) 수용액으로 15분간 처리한 후 3차 증류수로 2회 이상 세척하였으며, 젖은 시편은 무균작업대 내에서 1일 동안 자연 건조되었다. 끝으로 시편 전면에 자외선(260㎚)을 40분간 방사함으로써 오염 DNA가 비정상적인 퓨린 이합체(pyrimidine dimer)를 형성하도록 유도하였다. 콜라겐 추출을 위한 인골 시편은 DNA 분석용 시편처럼 오염물 제거를 위한 별도의 처리 과정을 거치지 않았다.
- 따라서 성결정을 위해 아밀로제닌 유전자 마커를 중합효소연쇄반응 시킬 경우 X 염색체는 106bps, Y 염색체에서 112bps의 아밀로제닌 유전자 일부가 증폭된다7. 따라서 XY의 성염색체를 가지고 있는 남성의 경우 106bps와 112bps의 두 가지 증폭산물이 확인되며, XX의 성염색체를 가지고 있는 여성의 경우 106bps의 산물만이 증폭되는 원리를 이용하여 출토 인골의 성에 대한 판별을 시도하였다. KAB0001과 KAB0003은 106bps의 증폭 산물만이 확인되어 여성으로 판명하였으며, KAB0002와 KAB0004는 106bps와 112bps가 모두 증폭되어 남성으로 확인되었다(Figure 5, Table 4).
- 시편의 조직 관찰은 실체현미경(Axiotech 100HD, Carl Zeiss) 하에서 x5, x10, x20 배율로 실시하였다. 또한 주사전자현미경(JSM-5910LV, Jeol)에 의한 조직 관찰은 시편 표면을 금으로 도금한 후 20㎸에서 x200 배율로 실시하였다.
- 4구의 인골을 대상으로 진행된 본 연구에서 피장자 3인이 동일한 미토콘드리아 DNA 하플로타입을 공유하고 있었다는 사실은 다음 두 가지 경우로 논할 수 있다. 먼저 세 피장자가 공유하고 있는 하플로타입이 당시 옥남리 일대와 인근 지역에 오랜 세대에 걸쳐 형성된 주요 모계 계통형(maternal lineage type)으로 집단 내 유전자 빈도(gene frequency)가 높았기 때문에 나타날 수 있는 결과로 해석할 수 있다. 그러나 이 지역 집단의 미토콘드리아 DNA 하플로타입 유전자 빈도를 정확히 분석하기 위해서는 함께 발굴된 많은 수의 인골에 대한 분석을 보강해야 하기 때문에 단정하기 어렵다.
- 미토콘드리아 DNA 과변이부위 HVR1, HVR2 증폭을 위한 중합효소연쇄반응 반응액은 중합효소(HotStar Taq, Qiagen) 5unit, 12.5p㏖ 프라이머 양방향 각각 4㎕, 2.5mM dNTP 3㎕, 10× buffer 5㎕, 1㎍/㎕ BSA 5㎕를 첨가한 후 3차 증류수를 이용해 최종 50㎕에 맞추어 제조하였다.
- , 앞서 언급한 골공동계 구조를 근거로 보존 상태가 양호할수록 지수가 높게 책정된다. 서천 옥남리 출토 인골의 4구에 대한 생물․화학적 분석에 앞서 뼈의 보존 상태를 확인하기 위하여 분석용 시료로 채취된 대퇴골 골공동계 조직의 보존 상태를 관찰하였다(Figure 3, 4). 실체 현미경 관찰에 의해 시료의 골공동계 조직을 구성하는 요소의 보존 유무를 확인할 수 있었다.
- 조직 분석용 시편은 대퇴골 중앙의 수직 단면을 원호(약 5-7㎜) 모양으로 절단하여 에폭시수지로 고착하고 연마지로 연마한 후 3㎛와 1㎛의 광택천으로 가공하여 준비되었다. 시편의 조직 관찰은 실체현미경(Axiotech 100HD, Carl Zeiss) 하에서 x5, x10, x20 배율로 실시하였다. 또한 주사전자현미경(JSM-5910LV, Jeol)에 의한 조직 관찰은 시편 표면을 금으로 도금한 후 20㎸에서 x200 배율로 실시하였다.
- 반응액을 실온에서 3시간 동안 보관한 후, 5,000g에서 2분 동안 원심분리하여 실리카 펠릿(pellet)만 남기고 상층액을 완전히 제거하였다. 실리카 펠릿에 50% ethanol, 125mM NaCl, 10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.0의 세척완충용액(washing buffer) 1㎖을 첨가하여 잘 혼합한 후, 16,000g에서 15초 동안 원심분리하여 상층액을 완전히 제거하는 과정을 2회 반복하였다. 남아 있는 실리카 펠릿은 실온에서 15분 동안 자연건조 시켰다.
- kr)를 활용하였다8. 아밀로제닌 유전자의 증폭은 풀림(annealing)과정을 58℃ 20초에서 수행하였으며, 나머지 과정은 미토콘드리아 DNA 과변이부위의 증폭 조건과 동일하게 수행하였다. 아밀로제닌 증폭 산물의 크기는 자동전기영동장치를 이용하여 분석하였다.
- 아밀로제닌 유전자의 증폭은 풀림(annealing)과정을 58℃ 20초에서 수행하였으며, 나머지 과정은 미토콘드리아 DNA 과변이부위의 증폭 조건과 동일하게 수행하였다. 아밀로제닌 증폭 산물의 크기는 자동전기영동장치를 이용하여 분석하였다.
- 5mM dNTP 3㎕, 10× buffer 5㎕, 1㎍/㎕ BSA 5㎕를 첨가한 후 3차 증류수를 이용해 최종 50㎕에 맞추어 제조하였다. 중합효소연쇄반응 조건은 초기 변성(initiate denaturation)을 95℃에서 15분 동안 1회 실시하도록 한 후 95℃에서 30초간 변성(denaturation), 58℃에서 30초간 풀림(annealing), 72℃에서 30초간 신장(extension) 과정을 40회 반복하며 최종 신장(final extension)을 72℃에서 10분간 반응 하도록 설정하였다. DNA 증폭장치(ABI veriti, Applied Biosystems)로 PCR 반응을 수행한 후 자동전기영동장치(HDA-GT12, eGene)를 이용하여 증폭 산물을 확인하였다.
- DNA 증폭장치(ABI veriti, Applied Biosystems)로 PCR 반응을 수행한 후 자동전기영동장치(HDA-GT12, eGene)를 이용하여 증폭 산물을 확인하였다. 증폭된 산물은 정제 키트(QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen)를 이용하여 순수 분리한 후 유전자검출기(CEQ8000, Beckman coulter)로 시퀀싱 반응을 수행하여 염기서열을 결정하였다. 미토콘드리아 DNA의 하플로타입(haplotype)은 표준염기서열(revised Cambridge Reference Sequence, rCRS)을 기준으로 결정되었으며, 하플로그룹(haplogroup)의 예측은 mtDNAmanager(http://mtmanager.
- 출토 인골의 성결정은 아밀로제닌 유전자 분석을 통하여 이루어졌다. 아밀로제닌 유전자는 X 염색체와 Y 염색체에 모두 존재하지만, X 염색체의 아밀로제닌 유전자는 염기서열 내에 부분결실이 존재한다.
대상 데이터
- 'R'은 13C/12C 또는 15N/14N의 비를 나타내며, 'Rstandard' (안정동위원소비가 0‰인 표준물질)는 국제표준기준에 따라 탄소의 경우 PDB(Pee Dee Belemnite)를 사용하였고 질소는 대기 중 질소(atmospheric N2)를 사용하였다.
- 군장국가산업단지 서해안 개발계획사업의 일환으로 군장지역의 장항지구 지원도로 건설이 제기됨에 따라 서천군 옥남리 일대에 대한 문화재 발굴 조사가 실시되었다. (재)충청문화재연구원은 2005~2006년까지 충청남도 서천군 마서면 삼연리에서 장항읍 옥남리 일대 약 1.2㎞ 5개 지점(날머리I, 날머리II, 갓재골, 원개들, 우아실)에 대한 조사를 진행하였다(Figure 1). 이 유적지에서 조선시대 분묘가 181기가 발굴되었는데 이중 토광묘(土壙墓)는 161기였으며 회곽묘(灰槨墓)는 21기였다5.
- 군장국가산업단지 서해안 개발계획사업의 일환으로 군장지역의 장항지구 지원도로 건설이 제기됨에 따라 서천군 옥남리 일대에 대한 문화재 발굴 조사가 실시되었다. (재)충청문화재연구원은 2005~2006년까지 충청남도 서천군 마서면 삼연리에서 장항읍 옥남리 일대 약 1.
- 이 유적지에서 조선시대 분묘가 181기가 발굴되었는데 이중 토광묘(土壙墓)는 161기였으며 회곽묘(灰槨墓)는 21기였다5. 이 가운데 동혈합장(同穴合葬墓)되어 있는 갓재골 유적의 5호 회곽묘 인골은 2006년 본 연구진에 의해 현장에서 직접 수습되었으며, 우아실 유적 1호, 2호 회곽묘에서 출토된 인골은 같은 해 (재)충청문화재연구원으로부터 제공받아 본 연구에 활용되었다(Table 1, Figure 2).
- 조직 분석용 시편은 대퇴골 중앙의 수직 단면을 원호(약 5-7㎜) 모양으로 절단하여 에폭시수지로 고착하고 연마지로 연마한 후 3㎛와 1㎛의 광택천으로 가공하여 준비되었다. 시편의 조직 관찰은 실체현미경(Axiotech 100HD, Carl Zeiss) 하에서 x5, x10, x20 배율로 실시하였다.
이론/모형
- 미토콘드리아 DNA(mitochondrial DNA; mtDNA)의 조절부위(control region)에 있는 과변이부위(hypervariable region; HVR)에 대한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)은 지상현 등(2008)을 참고하였으며, 성별 판정을 위한 아밀로제닌(amelogenin) 유전자 분석은 Sullivan 등(1993)의 방법을 적용하였다4,7. 미토콘드리아 DNA와 아밀로제닌 증폭에 사용된 프라이머(primer)는 Table 2와 같다.
- 증폭된 산물은 정제 키트(QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen)를 이용하여 순수 분리한 후 유전자검출기(CEQ8000, Beckman coulter)로 시퀀싱 반응을 수행하여 염기서열을 결정하였다. 미토콘드리아 DNA의 하플로타입(haplotype)은 표준염기서열(revised Cambridge Reference Sequence, rCRS)을 기준으로 결정되었으며, 하플로그룹(haplogroup)의 예측은 mtDNAmanager(http://mtmanager.yonsei.ac.kr)를 활용하였다8. 아밀로제닌 유전자의 증폭은 풀림(annealing)과정을 58℃ 20초에서 수행하였으며, 나머지 과정은 미토콘드리아 DNA 과변이부위의 증폭 조건과 동일하게 수행하였다.
- 인골의 DNA 추출은 Rohland 등(2007)이 제시한 실리카 추출법을 이용하였다6. 인골 분말 500㎎에 0.
- 콜라겐의 탄소와 질소 안정동위원소비 분석은 서울대학교 농생명과학공동기기원의 CN 원소분석기(NA Series2, CE Instruments)가 장착된 연속흐름형 안정동위원소 질량분석기(continuous-flow stable isotope ratio mass spectrometer with elemental analyzer, Micromass Ltd.)를 이용하였다. 탄소와 질소의 안정동위원소비(δ13C, δ15N)는 다음 식에 의해 계산되었다.
성능/효과
- 서천 옥남리 피장자의 미토콘드리아 변이형은 Table 3과 같이 분석되었다. 갓재골 유적의 5호 회곽 동혈합장묘 출토 인골 KAB0001을 제외한 나머지 3구 KAB0002, KAB0003, KAB0004는 동일한 하플로타입으로 나타났는데 이는 3명의 피장자가 동일한 모계 조상을 공유한다는 것을 의미한다. KAB0001의 하플로그룹은 B4a(16129, 16217, 16261, 73, 263, 315.
- 갓재골 유적의 5호 회곽묘 피장자(KAB0002)와 우아실 유적 1호, 2호 회곽묘의 두 피장자(KAB0003, KAB0004)의 미토콘드리아 DNA의 하플로타입(16223, 16287, 16319, 16362, 16390, 73, 207, 263, 315.1C)이 정확히 일치하는 것으로 밝혀졌다. 4구의 인골을 대상으로 진행된 본 연구에서 피장자 3인이 동일한 미토콘드리아 DNA 하플로타입을 공유하고 있었다는 사실은 다음 두 가지 경우로 논할 수 있다.
- 회를 사용하지 않은 토광묘 121기 가운데 18기에만 인골이 출토되었다5. 갓재골의 5호 회곽묘와 우아실의 1호, 2호 회곽묘는 잘 보존된 회곽으로 발견되었으며, 인골 또한 매우 양호한 상태로 출토 되었다.
- 또한 두 피장자의 성별 결정을 위한 아밀로제닌 유전자 분석에서 안치된 피장자를 기준으로 우측의 KAB0002 피장자는 남성, 좌측의 KAB0001 피장자는 여성으로 분석되었다. 두 가지 분석결과를 종합해 볼 때 동혈합장 된 두 피장자는 친남매 또는 모자관계로 보기 어려우며, 남편의 왼쪽에 부인을 안치하는 조선시대 후기 부부 동혈합장의 전통적인 매장방식을 감안하면 KAB0001, KAB0002 피장자는 서로 부부관계일 가능성이 매우 높다.
- 시편에서 관찰된 골공동계의 개수와 크기는 시료마다 약간의 차이를 보였으나 각각의 조직학적 특징은 잘 나타나 있었다. 모든 시료에서 중심관과 골소강이 매우 잘 보존되어 있었으며, 부분적으로 골층판의 구조가 분명하지 않은 것이 있었으나 대체로 서천 옥남리 출토 인골의 보존상태가 매우 좋은 것으로 관찰되었다. 주사전자현미경에서도 모든 시료의 조직 표면은 생물․화학적 물리적으로 훼손된 부위 없이 잘 보존되어 있는 것으로 나타났다.
- 반면, 회곽묘는 17기 가운데 13기에서 인골이 출토되었다. 발굴시 회다짐이 발견된 토광묘에서 인골의 발굴 빈도가 높았다. 회다짐 흔적이 있는 갓재골 4기의 토광묘에서 모두 인골이 출토되었으며, 우아실 유적은 회다짐한 4기의중 2기에서 인골이 출토되었다.
- 이러한 관점에서 조선 시대 인골은 직접적이고 명백한 역사의 증거로서 중요한 학술 연구 대상으로 인식되어야 하며, 서천 옥남리 4구에 대한 본 연구결과가 시사하는 의미는 매우 중요하다. 본 연구를 통해 조선시대 부부 동혈합장묘의 전통적인 매장방식을 DNA 분석에 의하여 검증할 수 있었다. 또한 피장자 4명이 조선시대 후기 서천 지역 사람들의 식생활 양식을 대표한다고 할 수는 없으나 당시 회곽묘를 조성할 수 있었던 경제적 계층의 식생활에 대한 정보를 일부 확인하였다는 점에서 중요한 의의를 갖는다.
- 본 연구에서 피장자들의 탄소 안정동위원소비 평균값은 δ13C=-20.2± 0.3‰로 측정되었다.
- 또한 하플로그룹 D는 32%, 서브그룹인 D4b은 5%를 차지하는 것으로 나타났다12. 본 연구에서 확인된 피장자의 미토콘드리아 DNA 하플로그룹이 조선시대 서천 옥남리 지역 집단의 유전적 특성을 대표할 수는 없으나, 조선시대 한국인 집단의 미토콘드리아 DNA 하플로그룹에 대한 중요 정보를 제공하고있다 점에 의의가 있다.
- 서사면에 나란히 쌍분(雙墳)으로 조성되어 있는 우아실 유적의 회곽묘 1호, 2호 피장자의 성별 분석 결과 KAB0003은 여자, KAB0004는 남자로 판명되었으며, 미토콘드리아 DNA 변이형이 서로 일치하는 것으로 나타났다. 발굴 당시 두 회곽묘는 동일 등고선상 1m 간격으로 매우 인접해 있었으며, 사면과 나란한 장축방향으로 조성되어 가족묘로 추정되었다.
- 실체 현미경 관찰에 의해 시료의 골공동계 조직을 구성하는 요소의 보존 유무를 확인할 수 있었다. 시편에서 관찰된 골공동계의 개수와 크기는 시료마다 약간의 차이를 보였으나 각각의 조직학적 특징은 잘 나타나 있었다. 모든 시료에서 중심관과 골소강이 매우 잘 보존되어 있었으며, 부분적으로 골층판의 구조가 분명하지 않은 것이 있었으나 대체로 서천 옥남리 출토 인골의 보존상태가 매우 좋은 것으로 관찰되었다.
- 서천 옥남리 출토 인골의 4구에 대한 생물․화학적 분석에 앞서 뼈의 보존 상태를 확인하기 위하여 분석용 시료로 채취된 대퇴골 골공동계 조직의 보존 상태를 관찰하였다(Figure 3, 4). 실체 현미경 관찰에 의해 시료의 골공동계 조직을 구성하는 요소의 보존 유무를 확인할 수 있었다. 시편에서 관찰된 골공동계의 개수와 크기는 시료마다 약간의 차이를 보였으나 각각의 조직학적 특징은 잘 나타나 있었다.
- KAB0003은 대부분의 골공동계 구조의 보존 상태가 양호하여 HI4로 평가였다. 조직 분석 결과를 종합할 때 서천 옥남리 인골 시료는 대체로 양호하여 DNA와 콜라겐 추출이 가능하고 생화학적 분석에 적합한 것으로 판단되었다.
- 모든 시료에서 중심관과 골소강이 매우 잘 보존되어 있었으며, 부분적으로 골층판의 구조가 분명하지 않은 것이 있었으나 대체로 서천 옥남리 출토 인골의 보존상태가 매우 좋은 것으로 관찰되었다. 주사전자현미경에서도 모든 시료의 조직 표면은 생물․화학적 물리적으로 훼손된 부위 없이 잘 보존되어 있는 것으로 나타났다. 조직의 균열이나 공극이 거의 없이 치밀하게 유지되었기 때문에 뼈의 강도가 세고 미생물이나 토양오염물질의 침입이도 거의 없었을 것으로 사료되었다.
- 피장자들의 질소 안정동위원소비 평균값은 δ15N=11.5±0.4‰로 나타났다.
후속연구
- 두 번째는 세 피장자들이 동시대에 생존한 근친 혈연관계로서 남매지간이거나 모자관계였을 것으로 추정 할 수 있다. 그러나 서천 옥남리 피장자 4명의 정확한 혈연관계에 대해서는 남자로 판명된 KAB0002와 KAB0004 피장자의 Y 염색체와 세 피장자들의 상동염색체에 대한 DNA 분석을 수행한 후 재논의할 수 있을 것이다.
- 미토콘드리아 DNA의 과변이 부위는 핵 DNA 보다 10배 정도 돌연변이 발생 비율이 높기 때문에 상대적으로 짧은 기간에 다양한 유전자 변이가 일어날 수 있다. 또한 핵 DNA는 양친에게 절반씩 유전되는 것과 달리 미토콘드리아 DNA는 모계로부터만 유전되기 때문에 모계 조상형을 추적하는 계통학적 연구가 가능하다. 따라서 사람은 개인마다 독특한 미토콘드리아 DNA 변이에 대한 유전자형인 하플로타입을 갖고 있으며, 비슷한 하플로타입을 보유한 집단은 하플로그룹으로 분류할 수 있다.
- 또한 피장자 4명이 조선시대 후기 서천 지역 사람들의 식생활 양식을 대표한다고 할 수는 없으나 당시 회곽묘를 조성할 수 있었던 경제적 계층의 식생활에 대한 정보를 일부 확인하였다는 점에서 중요한 의의를 갖는다. 향후 조선시대 인골에 대한 폭넓은 연구가 지속적으로 이루어진다면 현대에서 고대사를 잇는 조선시대 사람들의 인류유전학적 특징과 식생활에 대한 중요한 과학적 자료 확보가 가능할 것으로 사료된다.
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