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문제 정의
- 이에 본 연구는 뇌 허혈 유발 쥐에 침전극 저주파자극 후 대뇌의 c-Fos 발현에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 족삼리(ST 36)에 침전극 저주파자극을 가한 후 대뇌부위에 신경세포 c-Fos 단백질 변화를 연구함으로써 초기 허혈성 뇌손상으로 인한 신경사멸에 대해 전기치료적 관점에서 보다 적극적인 접근방법을 모색해 보고자 한다.
- 동양의학의 침과 서양의학의 전기치료를 접목시킨 침전극 저주파 자극은 세포의 염증을 완화시켜주며 신경재생에 효과가 있다. 허혈을 유발시킨 쥐의 족삼리(ST 36)에 침전극 저주파자극 후 대뇌의 c-Fos 발현에 미치는 영향을 규명하고자 본 연구를 실시하였다. 뇌 허혈은 수컷 SD 쥐의 온목동맥을 결찰하여 유발하였고, 5분간 유지 후 봉합사를 제거하여 혈액을 재관류시켰다.
제안 방법
- 온목동맥폐쇄를 유발하지 않은 대조군과 온목동맥폐쇄를 유발한 global ischemia 군(GI 군), GI를 유발시킨 뒤 침전극저주파자극(needle electrode electrical stimulation; NEES)을 시행한 NEES 군으로 구분하여 각 군마다 3마리씩 사용하여 연구를 시행하였다. GI 군과 NEES 군은 온목동맥폐쇄 12시간, 24시간, 48시간 후 GI 군은 30분간 3% isoflurane을 이용한 마취만 시킨 후에 회복시켰고, NEES 군은 3% isoflurane 마취와 동시 30분간 쥐의 좌․우측에 경혈점 족삼리(ST 36)에 침전극저주파자극기2)를 이용하여 시행하였다. 침전극저주파자극은 교류 2 ㎐로 시행하였으며, 강도는 쥐의 자극지점 주위 근육의 움직임에 따라 조절하였다.
- 일정 시간 감광 시킨 다음 발현하여 밴드 확인한 후 고정기에 담아 고정시켰다. 고정이 끝난 후, 흐르는 물로 깨끗이 씻어 건조 후 스캐닝 하여 농도계(Bio-rad)로 각 밴드의 광학밀도를 측정하였다.
- 허혈을 유발시킨 쥐의 족삼리(ST 36)에 침전극 저주파자극 후 대뇌의 c-Fos 발현에 미치는 영향을 규명하고자 본 연구를 실시하였다. 뇌 허혈은 수컷 SD 쥐의 온목동맥을 결찰하여 유발하였고, 5분간 유지 후 봉합사를 제거하여 혈액을 재관류시켰다. 허혈 유발 후 쥐의 좌․우측에 경혈점 족삼리에 12시간, 24시간, 48시간 후 침전극저주파자극(needle electrode electrical stimulation; NEES)을 30분간 시행하였다.
- 허혈 유발 후 쥐의 좌․우측에 경혈점 족삼리에 12시간, 24시간, 48시간 후 침전극저주파자극(needle electrode electrical stimulation; NEES)을 30분간 시행하였다. 대뇌의 신경세포에서 c-Fos 항체에 반응하는 면역반응세포와 Western blotting으로 이들 단백 발현을 조사하였다. 결과는 다음과 같다.
- 실험동물을 3% isoflurane1)으로 마취 상태를 유지하며, 목 정중선에서 양쪽의 온목동맥(common carotid artery)부분을 2 ㎝ 정중 절개한 후 미주신경 등을 분리하고 온목동맥을 노출시키고 양측의 온목동맥을 비흡수성 봉합사로 완전히 결찰한 후 5분간 유지하였으며, 이 후 봉합사를 제거하여 혈액이 재관류 할 수 있게 하였다.
- 온목동맥폐쇄를 유발하지 않은 대조군과 온목동맥폐쇄를 유발한 global ischemia 군(GI 군), GI를 유발시킨 뒤 침전극저주파자극(needle electrode electrical stimulation; NEES)을 시행한 NEES 군으로 구분하여 각 군마다 3마리씩 사용하여 연구를 시행하였다. GI 군과 NEES 군은 온목동맥폐쇄 12시간, 24시간, 48시간 후 GI 군은 30분간 3% isoflurane을 이용한 마취만 시킨 후에 회복시켰고, NEES 군은 3% isoflurane 마취와 동시 30분간 쥐의 좌․우측에 경혈점 족삼리(ST 36)에 침전극저주파자극기2)를 이용하여 시행하였다.
- 온목동맥폐쇄에 의한 GI 유발 모델 쥐의 대뇌 중 전뇌부위를 선택 후 정단면으로 절단하여 샘플을 만들어 면역조직화학적 검사법을 실시하였다. 4% paraformaldehyde에 고정된 뇌를 동결절편 하였고, free-floating 법으로 실시하였으며, Vectastain ABC Kit3)를 사용하였다.
- 적출한 대뇌를 부위별로 구분하고, 균질기를 사용하여 균질하게 파쇄한 후 1000 rpm에서 원심분리 하여 상층액을 버린 뒤 2 ㎖의 cold PBS를 이용하여 두 번 세척하였다. 원심분리한 후 상층액 만을 취한 뒤 단백질 양은 Protein assay kit(Bio-rad)를 사용하여 750 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 정량이 된 단백질에 lysis buffer와 sample buffer(60 mM tris; pH 6.
- 원심분리한 후 상층액 만을 취한 뒤 단백질 양은 Protein assay kit(Bio-rad)를 사용하여 750 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 정량이 된 단백질에 lysis buffer와 sample buffer(60 mM tris; pH 6.8, 10% glycerol, 2% SDS, .01% bromophenol blue)를 섞어 단백질 양을 동일하게 한 후 100℃ heat block에서 5분 동안 끓이고, 원심분리하여 시료를 모았다. 30% polyacrylamide mix와 3차 증류수, 1.
- GI 군과 NEES 군은 온목동맥폐쇄 12시간, 24시간, 48시간 후 GI 군은 30분간 3% isoflurane을 이용한 마취만 시킨 후에 회복시켰고, NEES 군은 3% isoflurane 마취와 동시 30분간 쥐의 좌․우측에 경혈점 족삼리(ST 36)에 침전극저주파자극기2)를 이용하여 시행하였다. 침전극저주파자극은 교류 2 ㎐로 시행하였으며, 강도는 쥐의 자극지점 주위 근육의 움직임에 따라 조절하였다.
- 뇌 허혈은 수컷 SD 쥐의 온목동맥을 결찰하여 유발하였고, 5분간 유지 후 봉합사를 제거하여 혈액을 재관류시켰다. 허혈 유발 후 쥐의 좌․우측에 경혈점 족삼리에 12시간, 24시간, 48시간 후 침전극저주파자극(needle electrode electrical stimulation; NEES)을 30분간 시행하였다. 대뇌의 신경세포에서 c-Fos 항체에 반응하는 면역반응세포와 Western blotting으로 이들 단백 발현을 조사하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서 사용되어진 실험동물은 1주일 이상 실험실 환경에 적응시킨 체중 300g 내외의 8주령 특정 병원체 부재(specific pathogen free; SPF)인 수컷 Sprague Dawley(SD) 쥐 21마리를 사용하였다. 온도와 습도, 공기 청정 상태를 일정하게 유지하며 물과 사료는 충분히 공급해 주었으며, 실험실의 온도는 22±1℃, 습도는 45∼55%정도를 상시 유지하였다.
데이터처리
- 대조군, 뇌졸중 유발군, 뇌졸중 유발 후 치료군의 효과를 알아보기 위해 유의수준은 α=.05로 설정하고 Kurskal-Wallis 분석을 사용하여 대조군과, 뇌졸중 유발군, 뇌졸중 유발군과 뇌졸중 유발 후 치료군간의 차이 분석을 실시하였다.
- 본 연구에서 수집된 모든 자료는 부호화 후 컴퓨터를 이용한 통계처리 프로그램(SPSS 12.0K/PC)으로 분석하였다. 대조군, 뇌졸중 유발군, 뇌졸중 유발 후 치료군의 효과를 알아보기 위해 유의수준은 α=.
이론/모형
- 온목동맥폐쇄에 의한 GI 유발 모델 쥐의 대뇌 중 전뇌부위를 선택 후 정단면으로 절단하여 샘플을 만들어 면역조직화학적 검사법을 실시하였다. 4% paraformaldehyde에 고정된 뇌를 동결절편 하였고, free-floating 법으로 실시하였으며, Vectastain ABC Kit3)를 사용하였다. 박절된 조직을 .
성능/효과
- (1) 면역조직화학 결과에서 c-Fos 반응 세포 수는 24시간에서 침전극저주파 자극을 시행하지 않은 대조군(GI)에 비하여 NEES군이 유의적인 감소를 나타내었다(p<.05).
- (2) 웨스턴 블롯팅 결과에서 c-Fos 발현은 허혈 유발 24시간 후에서 침전극저주파자극을 시행하지 않은 대조군(GI)에 비하여 NEES군이 유의적으로 감소하였다(p<.05).
- 24시간 후에서는 대조군보다 증가하였고, GI군은 140.33±15.95이었으며 NEES군은 102.33±1.53으로 GI군에 비하여 유의적인 감소를 나타내었다(p<.05).
- 24시간 후의 c-Fos 반응 세포 수는 대조군은 36.33±4.16이었고, GI군에서는 140.33±15.95이었으며, NEES군에서는 102.33±1.53으로 GI군에 비하여 유의적으로 감소하였다(p<.05).
- 24시간 후의 c-Fos 발현은 대조군은 113.67±3.05이었으며, GI군에서는 200.59±4.88이었고, NEES군에서는 178.26±3.03로 GI군에 비하여 유의적으로 감소하였다(p<.05).
- c-Fos 발현은 24시간 후의 GI군에서 200.59±4.88이었고, NEES군은 178.26±3.03로 GI군에 비하여 유의적으로 감소하였다(p<.05).
- 본 연구에서도 허혈이 유발하는 세포자멸사를 확인한 결과 c-Fos 변화는 면역조직화학 및 웨스턴 블롯팅의 결과에서 허혈에 의하여 대뇌의 전반부에서 증가함을 알 수 있었으며, 이러한 결과는 이전의 연구결과 신피질에서 발현되는 같은 양상을 나타내었다. 족삼리에 침전극저주파 자극을 시행한 후 면역조직화학 결과에서 c-Fos 반응 세포 수 변화 비교는, 허혈 유발 후 12시간에서 c-Fos 반응 세포 수가 대조군보다 GI군과 NEES 군에서 각각 증가하였으며 GI군보다 NEES군이 적게 관찰 되었다.
- 온도와 습도, 공기 청정 상태를 일정하게 유지하며 물과 사료는 충분히 공급해 주었으며, 실험실의 온도는 22±1℃, 습도는 45∼55%정도를 상시 유지하였다.
- 12시간 후 보다 24시간에 반응세포 수가 증가를 보이고 있는데 이는 주위 세포에 의한 자극을 받아 염증이 일어난 결과로 보인다. 웨스턴 블롯팅 결과 c-Fos 발현 비교에서, 허혈 유발 후 12시간에서 c-Fos 발현은 대조군보다 GI군과 NEES군에서 증가하였으며, GI군보다 NEES군에서 적게 관찰되었다. 허혈 유발 24시간 후에서는 GI군은 200.
- 05), 허혈 유발 48시간 후 NEES군은 GI군에 비하여 감소하였으나 유의적인 차이는 없었다. 이러한 결과 면역조직화학 및 웨스턴 블롯팅 모두에서 NEES 적용이 GI 상태에서 대뇌에서 c-Fos에 대하여 24시간에 유의한 차이 효과를 나타냈으며, 12시간에서도 NEES군이 GI군보다 적게 관찰되는 차이를 보였지만 유의하지는 못했다.
- 본 연구에서도 허혈이 유발하는 세포자멸사를 확인한 결과 c-Fos 변화는 면역조직화학 및 웨스턴 블롯팅의 결과에서 허혈에 의하여 대뇌의 전반부에서 증가함을 알 수 있었으며, 이러한 결과는 이전의 연구결과 신피질에서 발현되는 같은 양상을 나타내었다. 족삼리에 침전극저주파 자극을 시행한 후 면역조직화학 결과에서 c-Fos 반응 세포 수 변화 비교는, 허혈 유발 후 12시간에서 c-Fos 반응 세포 수가 대조군보다 GI군과 NEES 군에서 각각 증가하였으며 GI군보다 NEES군이 적게 관찰 되었다. 24시간 후에서는 대조군보다 증가하였고, GI군은 140.
- 허혈 유발 24시간 후에서는 GI군은 200.59±4.88이었고, NEES군은 178.26±3.03로 GI군에 비하여 유의적으로 감소하였고(p<.05), 허혈 유발 48시간 후 NEES군은 GI군에 비하여 감소하였으나 유의적인 차이는 없었다.
- 허혈 유발 48시간 후 GI군의 c-Fos 반응 세포 수는 48.67±8.50이었으며, NEES군의 반응 세포 수는 59.33±6.03으로서 각각 24시간에 비하여 감소하였으나 유의적인 차이는 없었다.
- 허혈 유발 후 쥐 대뇌 c-Fos 반응 세포 수는 그림 1과 그림 2에서 보는 바와 같이 허혈 유발 후 12시간에서의 c-Fos 반응 세포 수가 대조군에서 35.00±7.00이었고, GI군과 NEES군에서는 각각 109.33±15.31와 96.00±12.77로서 대조군에 비하여 증가하였다.
후속연구
- 05). 따라서 허혈 후 24시간에 NEES가 가장 효과가 크게 나타남으로써 침전극저주파자극이 허혈성 뇌졸중 이후 조기치료에 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 사료된다. 또한 본 연구의 제한점은 실험을 통해서 얻어진 결과를 사람에게 그대로 적용 할 수 없으며, 실험동물 개체에 따른 뇌 허혈 유발 정도의 차이가 있을 수 있다.
- 따라서 허혈 후 24시간에 NEES가 가장 효과가 크게 나타남으로써 침전극저주파자극이 허혈성 뇌졸중 이후 조기치료에 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 사료된다. 또한 본 연구의 제한점은 실험을 통해서 얻어진 결과를 사람에게 그대로 적용 할 수 없으며, 실험동물 개체에 따른 뇌 허혈 유발 정도의 차이가 있을 수 있다.
- 이상의 연구 결과를 보아 침전극저주파자극이 초기에 세포자멸을 촉진하는 c-Fos의 발현시기를 지연시켜 세포자멸의 지연 및 억제를 시켰다고 사료되며, 본 연구에서 동물실험을 통해 얻어진 결과 뇌혈관 손상 환자에게 적용함에 있어 주의와 체계적인 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
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