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문제 정의
- 코팅된 시료에 혈청이 포함되어 있지 않은 추출용 배지를 넣고 하루 동안 방치하여 얻어진 추출 용액과 일주일 동안 방치하여 얻은 추출 용액으로 동일한 실험을 수행하였다. 독성 성분이 천천히 빠져나올 가능성도 있기 때문에, 두 추출 용액으로부터의 결과를 통해 독성 성분이 배출되는지 그리고 배출된다면 어떤 속도로 녹아 나오는지를 동시에 알아보기 위한 실험을 설계하였다. Figure 6에서 보여지는 바와 같이 두 추출 용액에서 세포의 생장에 악영향을 줄 수 있는 성분은 없는 것으로 나타났다.
- PMMA-b-PEG 고분자를 PDMS 표면에 스핀코팅한 경우, 소수성인 PDMS 표면에 PMMA 주사슬이 용이하게 흡착되고 친수성인 PEG 가지들이 바깥쪽에 노출되면서 재료의 표면 성질을 변화시킬 수 있다. 이 연구에서는 PMMA-b-PEG 고분자박막을 PDMS 표면에 고정시키고 장기간의 표면 특성관찰을 통한 박막의 표면 안정성을 확인하였다. 또한 생체 주입용 소재로 응용하기에 앞서 필요한 세포독성평가를 실시하였다.
- 이 연구에서는 이러한 양친성 공중합체를 스핀 코팅하여 PDMS의 표면을 개질하고자 하였다. 양친성 빗 모양 고분자인 methyl methacrylate-based polyethylene glycol (PMMA-b-PEG)는 유연한 소수성의 PMMA 주 사슬에 짧은친수성의 PEG 사슬이 가지처럼 붙어있는 빗 모양 고분자로세18] 단백질과 세포에 대하여 우수한 흡착 억제 능력을 가지고 있다.
- 소수성의 PMMA를 기본 주쇄로 하여 합성조건에 따라 측쇄의 변화를 줌으로써 친수성을 조절하도록 하였다. 측쇄는 CH3 또는 OH 기를 말단으로 가지도록 하여 OH 기가 밀집함으로써 발생할 수 있는 말단기간 결합을 최소화하고자 하였다. CH3 또는 OH기 말단을 조절하는 것은 전체적인 고분자 성질을 좌우하게 되므로 용해도, 수용액상에서의 안정성 연동 작용의 효율성 등에 크게 영향을 미치게 된다.
제안 방법
- 5 g 씩 넣어 굳힌 후 고분자를 농도별로 코팅한 시료에, 혈청이 들어있지 않은 RPMI 1640배지 (Gibco) 500 ㎕를첨가하여 추출물로 사용하였다. 24 h 추출물과 7일간 추출물 두 가지를 가지고 동일한 실험을 수행했다. 모든 작업은 무균 작업대 안에서 이루어졌으며, 양성 대조군으로 일반적인 organotin 1% 용액이 사용되었다.
- 제조하였다. 3일간 건조 후 가로, 세로의 길이가 각각 1.5 cm 가 되도록 잘라 시료로 사용하였다. PMMA-b-PEG 코팅용액은 에탄올과 증류수를 1 : 1로 (v/v) 혼합한 용매에 고분자를 녹여 준비하였다.
- [18]. Methyl methacrylate (MMA, 197 mmol) poly(oxyethylene) methacrylate (POEM, 13.8 mmol), hydroxy-poly (oxyethylene) methacrylate (HPOEM, 36.4 mmol)를 혼합한 500 mL tetrahydrofuran (THF) 용액에 2.46 g 2, 2 '-azo-bis-iso- butyronitrile (AIBN, 15 mmol)를 게시제로 넣어 합성을 시도하였다. 혼합 용액은 합성에 앞서 질소를 20 min 동안 거품 충진하여 용액에 잔존하는 산소를 충분히 제거하였으며, 이후 75℃에서 18 h 동안 용액 순환 시스템을 이용하여 고분자를 합성하였다.
- PDMS (Sylgard 184, Dow Corning, USA) prepolymer 와 가교제의 비율을 무게비 10 : 2로 하여 제조하였다. 3일간 건조 후 가로, 세로의 길이가 각각 1.
- PDMS 표면에 코팅된 PMMA-b-PEG 고분자의 모폴 로지를 확인하기 위해 1,000배 확대된 전계방출 주사 전사 현미경 (FESEM, SUPRA 55VP, Carl Zeiss, Germany, NICEM)이미지를 얻었다. 코팅된 고분자 층의 두께를 측정하기 위해서는 원자힘 현미경(AFM, XE-100, Park Systems, Korea)장비를 이용하였다.
- PMMA-b-PEG 를 사용하여 표면 코팅된 PDMS 의 생체적합성을 확인해 보기 위해서 세포독성 테스트를 진행하였다. 코팅된 시료에 혈청이 포함되어 있지 않은 추출용 배지를 넣고 하루 동안 방치하여 얻어진 추출 용액과 일주일 동안 방치하여 얻은 추출 용액으로 동일한 실험을 수행하였다.
- 05 wt%의 테트라메틸실란(TMS)을포함한 (CD3)2SO를 용매로 하여 1H-NMR (500 MHz, Avance 500, Bruker)을 이용해 확인하였다. PMMA-b-PEG 의 분자량은 겔 투과 크로마토그래피(GPC, KF 804 column, intelligent refractive index detector (RI930), intelligent HPLC pump (PU980), Jasco)를 이용하여 측정하였다.
- 그 후 배양액을 제거하고 멸균된 PBS 와 멸균수로 각각 1번씩 세척했다. 그리고 새로운 배지 50 ㎕와 추출물 50 ㎕를넣어 같은 배양조건으로 24 h 배양한 뒤 MTT assay를 수행하였다. 두 번째 방법은 3 X 103/well 개의 세포를 100 ㎕의 배지와 함께 96 well plate에 넣음과 동시에 새로운 배지 50 ㎕와 추출물 50 ㎕를 첨가하여 24 h 배양한 뒤 MTT assay 를 수행하였다.
- 그리고 새로운 배지 50 ㎕와 추출물 50 ㎕를넣어 같은 배양조건으로 24 h 배양한 뒤 MTT assay를 수행하였다. 두 번째 방법은 3 X 103/well 개의 세포를 100 ㎕의 배지와 함께 96 well plate에 넣음과 동시에 새로운 배지 50 ㎕와 추출물 50 ㎕를 첨가하여 24 h 배양한 뒤 MTT assay 를 수행하였다. 최종 데이터인 흡광도는 UV-visible 흡광도계 (Power-wave XS, Biotek, USA)를이용하여 570 nm 파장에서 측정하였다.
- 이 연구에서는 PMMA-b-PEG 고분자박막을 PDMS 표면에 고정시키고 장기간의 표면 특성관찰을 통한 박막의 표면 안정성을 확인하였다. 또한 생체 주입용 소재로 응용하기에 앞서 필요한 세포독성평가를 실시하였다.
- 합성된 PMMA-b-PEG의 경우 물을 제외하고, 에탄올, 메탄올, 벤젠, THF, DMSO, DMF, Chloroform등의 유기용매에는 용해성을 나타내었다. 물과 에탄올의 혼합액은 3 : 1, 1 : 1, 1 : 3의 비율로 제조하여 용해도 조사를 하였다. 각 혼합액에 따른 용해 시간의 차이는 보였으나, 모두 용해되는 것을 확인할 수 있었다.
- 평가에 이용된 NIH-3T3 fibroblast 세포(ATCC) 는 fetal bovine serum (FBS) 이 포함된 RPMI 1640배지 내에서 배양되었다. 세포독성 평가는 2가지 방법으로 진행되었으며, NIH-3T3 fibroblast 단일세포층을 형성한 후 추출물을 첨가하는 방법과 세포와 함께 추출물을 넣어 동시에 배양하는 방법을 사용하였다. 첫 번째 방법에서의 단일 세포층 형성은 3 X 103/well 개의 세포를 100㎕의 배지와 함께 96 well plate에 넣어 37℃, 5% CO2 배양기 내에서 24 h 동안 배양하였다.
- 있다. 소수성의 PMMA를 기본 주쇄로 하여 합성조건에 따라 측쇄의 변화를 줌으로써 친수성을 조절하도록 하였다. 측쇄는 CH3 또는 OH 기를 말단으로 가지도록 하여 OH 기가 밀집함으로써 발생할 수 있는 말단기간 결합을 최소화하고자 하였다.
- 접촉각 측정을 통해 양친성 고분자 코팅의 효과를 확인한 후, 코팅된 PDMS 표면의 모폴로지를 알아보기 위해 FE-SEM 으로 관찰하였다. 다양한 농도의 고분자로 코팅한 후 건조상태에서 보관한 시료 표면을 1, 000배 확대해 보면, PMMA-b-PEG 1% 농도로 코팅한 경우에는 표면 미세 균열이 거의 없었으나 농도가 증가할 수록균열이 심해지면서 10% 농도에서는 물고기 비늘 모양의 코팅 표면을 관찰할 수 있었다(Figure 4).
- 제조된 PMMA-b-PEG의 구조분석, 모노머 구성비는 내부 기준 시료인 0.05 wt%의 테트라메틸실란(TMS)을포함한 (CD3)2SO를 용매로 하여 1H-NMR (500 MHz, Avance 500, Bruker)을 이용해 확인하였다. PMMA-b-PEG 의 분자량은 겔 투과 크로마토그래피(GPC, KF 804 column, intelligent refractive index detector (RI930), intelligent HPLC pump (PU980), Jasco)를 이용하여 측정하였다.
- 주변 환경에 따른 표면 성질 변화를 확인하기 위하여 37℃ 에서 공기 중에 노출시켜 보관한 군과 phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4) 용액상에 보관한 군으로 나누어 일주일간 관찰하였으며 측정 오차를 줄이기 위해 각 농도별로 코팅된 10개의 시료를 사용하여 평균값을 얻어냈다. PBS 용액상에 보관한 군은 증류수로 세척한 후 측정하였다.
- 얻었다. 코팅된 고분자 층의 두께를 측정하기 위해서는 원자힘 현미경(AFM, XE-100, Park Systems, Korea)장비를 이용하였다. 표면 미세형태 이미지는 공기 중에서 비접촉(non-contact) 방법으로 silicon nitride 컨틸레버 (NCHR, Park systems, Korea)를 사용하여 얻어졌다.
- 코팅된 시료에 혈청이 포함되어 있지 않은 추출용 배지를 넣고 하루 동안 방치하여 얻어진 추출 용액과 일주일 동안 방치하여 얻은 추출 용액으로 동일한 실험을 수행하였다. 독성 성분이 천천히 빠져나올 가능성도 있기 때문에, 두 추출 용액으로부터의 결과를 통해 독성 성분이 배출되는지 그리고 배출된다면 어떤 속도로 녹아 나오는지를 동시에 알아보기 위한 실험을 설계하였다.
- 표면의 화학적 특성 변화를 관찰하기 위해 증류수를 떨어뜨린 후 접촉각 측정기를 사용하여 접촉각을 측정하였다. 주변 환경에 따른 표면 성질 변화를 확인하기 위하여 37℃ 에서 공기 중에 노출시켜 보관한 군과 phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.
대상 데이터
- 평가를 진행하였다. 멸균된 유리병에 PDMS를 1.5 g 씩 넣어 굳힌 후 고분자를 농도별로 코팅한 시료에, 혈청이 들어있지 않은 RPMI 1640배지 (Gibco) 500 ㎕를첨가하여 추출물로 사용하였다. 24 h 추출물과 7일간 추출물 두 가지를 가지고 동일한 실험을 수행했다.
- PMMA-b-PEG 코팅용액은 에탄올과 증류수를 1 : 1로 (v/v) 혼합한 용매에 고분자를 녹여 준비하였다. 최적의 코팅 농도를 찾기 위해 1, 2, 5, 10 wt%의 고분자 용액이 실험에 사용되었다. 미리 준비된 PDMS시료에 각 농도의 고분자 용액을 50 ㎕씩 떨어뜨린 후 1,000 RPM으로 30 s 간 스핀 코팅한 후 상온에서 30 min 동안 건조시켰다.
- 두 번째 방법은 3 X 103/well 개의 세포를 100 ㎕의 배지와 함께 96 well plate에 넣음과 동시에 새로운 배지 50 ㎕와 추출물 50 ㎕를 첨가하여 24 h 배양한 뒤 MTT assay 를 수행하였다. 최종 데이터인 흡광도는 UV-visible 흡광도계 (Power-wave XS, Biotek, USA)를이용하여 570 nm 파장에서 측정하였다.
- 시료와 대조군은 6개의 well 에서 중복 측정하여 평균값을 얻었다. 평가에 이용된 NIH-3T3 fibroblast 세포(ATCC) 는 fetal bovine serum (FBS) 이 포함된 RPMI 1640배지 내에서 배양되었다. 세포독성 평가는 2가지 방법으로 진행되었으며, NIH-3T3 fibroblast 단일세포층을 형성한 후 추출물을 첨가하는 방법과 세포와 함께 추출물을 넣어 동시에 배양하는 방법을 사용하였다.
데이터처리
- 모든 작업은 무균 작업대 안에서 이루어졌으며, 양성 대조군으로 일반적인 organotin 1% 용액이 사용되었다. 시료와 대조군은 6개의 well 에서 중복 측정하여 평균값을 얻었다. 평가에 이용된 NIH-3T3 fibroblast 세포(ATCC) 는 fetal bovine serum (FBS) 이 포함된 RPMI 1640배지 내에서 배양되었다.
- 표면 미세형태 이미지는 공기 중에서 비접촉(non-contact) 방법으로 silicon nitride 컨틸레버 (NCHR, Park systems, Korea)를 사용하여 얻어졌다. 얻어진 이미지는 Park systems의 XEI 프로그램을 통해 분석하여 시료들의 평균두께를 측정하였다.
이론/모형
- 기존에 알려진 방법들 중 ISO 10993-5 (의료기기의 생물 안정성 평가-제5부 : 세포 독성 시험-체외시험) 에따라 평가를 진행하였다. 멸균된 유리병에 PDMS를 1.
- 코팅을 위한 PMMA-b-PEG는 이전에 보고된 자유라디칼 고분자 합성법으로 제조하였다(Figure 1) [18]. Methyl methacrylate (MMA, 197 mmol) poly(oxyethylene) methacrylate (POEM, 13.
- 코팅된 고분자 층의 두께를 측정하기 위해서는 원자힘 현미경(AFM, XE-100, Park Systems, Korea)장비를 이용하였다. 표면 미세형태 이미지는 공기 중에서 비접촉(non-contact) 방법으로 silicon nitride 컨틸레버 (NCHR, Park systems, Korea)를 사용하여 얻어졌다. 얻어진 이미지는 Park systems의 XEI 프로그램을 통해 분석하여 시료들의 평균두께를 측정하였다.
성능/효과
- 5B). PMMA-b-PEG 도포 용액의 농도가 높음에 따라 박막의 두께가 점진적으로 증가함을 알 수 있었고, 50~600 nm 의 두께 분포를 보였다 (Figure 5). 초기 저농도에서는 다소 급격한 두께의 증가가 있었으며 농도가 높아짐에 따라 직선적인 비례 관계를 확인할 수 있었다 (Figure 5(A)).
- 물과 에탄올의 혼합액은 3 : 1, 1 : 1, 1 : 3의 비율로 제조하여 용해도 조사를 하였다. 각 혼합액에 따른 용해 시간의 차이는 보였으나, 모두 용해되는 것을 확인할 수 있었다.
- 건조상태에 보관한 PDMS 는 일주일 동안 평균 103° 정도로 큰 변화 없이 측정되었으나, PMMA-b-PEG 고분자의 경우 코팅 직후에 50~80°에 걸쳐 코팅 농도가 증가할수록 낮은 접촉각을 나타내었으며 일주일이 지난 후에는 70~80° 정도로 일정하게 유지되는 경향을 보였다(Figure 3(A)). 코팅 초기의 접촉각 분포는 코팅농도가 증가할수록 PDMS 표면에 위치한 양친성 고분자의 친수기들이 많아지는데 기인한 것으로 보인다.
- 습윤상태에서 보관된 PMMA-b-PEG 고분자 코팅의 경우 건조상태에서와 비슷한 경향을 나타내고 있으며 농도간의 편차가 더 줄어들어 80° 근처에서 모두 평형이 유지되었다. 결론적으로 PDMS 표면에 PMMA-b-PEG를 코팅함에 따라 10° 이상의 소수성 감소 효과를 보였고, 이런 표면성질의 변화는 일주일 이상지속되었다. 또한 공기 중에서뿐만 아니라 체내와 같은 습윤환경에서도 마찬가지로 감소된 표면의 소수성 이잘 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
- FE-SEM 으로 관찰하였다. 다양한 농도의 고분자로 코팅한 후 건조상태에서 보관한 시료 표면을 1, 000배 확대해 보면, PMMA-b-PEG 1% 농도로 코팅한 경우에는 표면 미세 균열이 거의 없었으나 농도가 증가할 수록균열이 심해지면서 10% 농도에서는 물고기 비늘 모양의 코팅 표면을 관찰할 수 있었다(Figure 4). 이러한 표면의 불균일성은 코팅 고분자의 두께 및 밀집도에 기인하는 것으로 판단되었다.
- 따라서 물 용매상에서는 불용성을 띠는 PMMA-b-PEG 의 특성을 고려하여 볼 때, 액상 고분자 박막층의 PMMA-b-PEG 용해도가 현저히 감소하게 됨으로 인하여 PMMA-b-PEG 의 국소적인 응집이 일어나는 것으로 판단될 수 있다.
- 수 있었다. 또한 공기 중에서뿐만 아니라 습윤환경에서도 감소된 소수성이 일주일 이상 지속되는 것으로 보아 고분자의 흡착이 안정적으로 유지됨을 확인할 수 있었다. PMMA-b-PEG 박막으로부터 얻어진 추출물을 이용한 세포독성 테스트에서는 아무런 세포 독성이 관찰되지 않았다.
- 결론적으로 PDMS 표면에 PMMA-b-PEG를 코팅함에 따라 10° 이상의 소수성 감소 효과를 보였고, 이런 표면성질의 변화는 일주일 이상지속되었다. 또한 공기 중에서뿐만 아니라 체내와 같은 습윤환경에서도 마찬가지로 감소된 표면의 소수성 이잘 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 표면 성질의 변화는 양친성 빗 모양 고분자인 PMMA-b-PEG 분자의 소수성 PMMA 주사슬이, 소수성 상호작용에 의해 PDMS 표면에 흡착되면서 PEG 가지들이 표면에 노출된 결과로 해석된다.
- 이러한 표면 성질의 변화는 양친성 빗 모양 고분자인 PMMA-b-PEG 분자의 소수성 PMMA 주사슬이, 소수성 상호작용에 의해 PDMS 표면에 흡착되면서 PEG 가지들이 표면에 노출된 결과로 해석된다. 또한 변화된 표면 성질이 일주일 이상 지속되는 것으로 보아, 코팅된 고분자가 PDMS 표면에 안정적으로 흡착되어 있는 것으로 생각된다.
- 양친성 빗 모양 고분자인 PMMA-b-PEG를 스핀 코팅하여 소수성 PDMS 표면에 안정적으로 흡착시킴으로써 친수성 PEG 사슬이 도입되었고, 접촉각을 10° 이상 감소시킬 수 있었다. 또한 공기 중에서뿐만 아니라 습윤환경에서도 감소된 소수성이 일주일 이상 지속되는 것으로 보아 고분자의 흡착이 안정적으로 유지됨을 확인할 수 있었다.
- 39 ppm (-O-CH3)에서 특징적인 peak이 나타났다. 이들 peak 을 비교하여 합성된 고분자의 모노머 구성비를 구할 수 있으며, 80 wt% MMA, 12 wt% HPOEM, 그리고 8 wt% POEM이라는 결과를 얻었다. 합성된 PMMA-b-PEG의 경우 물을 제외하고, 에탄올, 메탄올, 벤젠, THF, DMSO, DMF, Chloroform등의 유기용매에는 용해성을 나타내었다.
- 코팅 고분자의 농도가 증가함에 따라 두꺼운 표면 고분자 층이 형성되고, 건조과정에서 용매 분자가 빠져나가는 시간차에 의해 단단해진 표면에서 불균일 도가 높아지는 것으로 생각되었다. 또한 물과 에탄올의 혼합 용매에 용해되어 있는 PMMA-b-PEG 용액이 박막을 형성한 후 에탄올의 증발이 물 보다 빨리 일어나게 된다.
후속연구
- 관찰되지 않았다. 따라서 PMMA-b-PEG 로 코팅된 PDMS 는 세포의 성장 과정에 있어 큰 영향을 주지 않는 것으로 사료 되었으며 생체 삽입을 위한 재료의 표면 개질 및 박막 소재로 응용이 가능하다고 판단된다.
- PMMA-b-PEG 박막으로부터 얻어진 추출물을 이용한 세포독성 테스트에서는 아무런 세포 독성이 관찰되지 않았다. 따라서 양친성 빗 모양 고분자인 PMMA-b-PEG 가 코팅된 PDMS 는 생체 주입을 위한 소재로 사용될 수 있으며, 과도한 단백질 및 세포의 흡착과 그에 따른 부반응을 방지할 수 있는 생체적합성 소재로 응용될 수 있을 것이다.
- 또한 투명하고 가공이 용이하며 낮은 제조 비용의 장점을 가지고 있을 뿐만 아니라[1], 바이오센서 제작, 생체 적용 및 미세유체 제어기술을 포함한 바이오응용 분야에 가장 널리 이용되고 있는 재료 중의 하나이다[2, 3]. 또한 세포독성 실험결과 생체적합성을 지닌 안전한 물질로 밝혀짐에 따라 생체 주입을 위한 소재로도 사용될 수 있다[4]. 그러나 이러한 장점들에도 불구하고 PDMS 의 매우 높은 소수성은 응용에 있어 걸림돌로 작용하고 있, 다 [5].
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