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문제 정의
- 본 연구에서는 국내 다양한 지역의 양계장으로부터 폐기물로 버려지는 폐깃털을 효율적으로 분해할 수 있는 케라틴 단백질 분해세균을 다수 확보하고, 우수 미생물을 선발하여 이들 균주를 이용하여 아미노산을 추출한 다음 화학적 분해법에 의해 추출된 아미노산과 특성을 비교함으로써 생물학적 분해법에 의해 추출된 아미노산의 친환경 비료로써의 사용 가능성을 평가하고자 하였다.
제안 방법
- 16S rRNA 유전자 분석을 통하여 염기서열을 결정한 후 DDBJ/NCBI/RDP/GenBank database의 BLAST program을 이용하여 계통분류학적 유연관계를 분석하였다. 각 염기서열의 alignment는 CLUSTAL X algorithm를 이용하여 병렬로 정렬하였고, 계통도의 작성은 근린 결합법(24)에 의거하여 계통분류학적 위치를 결정하였다(29).
- 16S rRNA의 PCR 증폭산물은 1% agarose gel, 0.5× TAE buffer (0.045 M Tris-borate, 0.001 M EDTA)에서 100 V, 25 mA로 30분 동안 전기영동(Mupid-21, Gel documentation system, Bio-Rad, USA)한 후, ethidtum bromide (EtBr)로 15분간 염색하여 UV하에서 증폭 여부를 확인하고, QIAquick® PCR Purification kit (QIAGEN Inc.)를 이용하여 정제하였다.
- 아미노산 생성량이 가장 높게 나타난 Chryseobacterium sp. FBF-7 균주를 이용한 생물학적 분해법과 Ca(OH)2 처리에 의한 화학적 분해법에 의해 추출된 아미노산의 조성을 비교 검토하였다. Chryseobacterium sp.
- FBW-3 균주를 2% 우모분이 함유된 무기염 배지에 각각 접종한 후 미생물 효소분해에 의해 추출된 총 아미노산 함량과 수산화칼슘(Ca(OH)2) 처리에 의한 화학적 분해법에 의해 추출된 총 아미노산 함량을 각각 비교⋅검토하였다.
- 0% 우모분이 첨가된 무기염배지에 각각 접종하여 25°C에서 150rpm으로 3일간 회전진탕배양한 후, 배양액을 4°C, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다(31). 각각의 분해법으로 추출된 아미노산의 함량과 조성은 아미노산 분석기(L-8900 Amino Acid Analyzer, Hitachi, Ltd., Japan)를 이용하여 분석하였다.
- 단백질 분해능이 우수한 88균주 중 난분해성 케라틴 단백질 분해세균을 선발하기 위하여 2% 우모분이 첨가된 무기염배지에 상기의 단백질 분해세균을 각각 접종하고, 37°C에서 3일간 진탕배양하면서 각 균주의 우모 분해능을 조사하였다.
- 단백질 분해세균의 선별을 위하여 기초배지(0.03% K2HPO4, 0.03% KH2PO4, 0.01% Na2CO3, 1.5% agar, pH 7.5±0.2)에 1.0% skim milk를 첨가한 평판배지를 이용하여 단백질 분해능을 판별하였다.
- 생물학적 분해를 이용한 아미노산 추출은 본 연구에서 최종 선발된 우수 균주를 2.0% 우모분이 첨가된 무기염배지에 각각 접종하여 25°C에서 150rpm으로 3일간 회전진탕배양한 후, 배양액을 4°C, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다(31).
- 수산화칼슘 처리에 의한 화학적 분해로 우모로부터 아미노산을 추출하기 위하여 Ca(OH)2를 처리한 후, 95°C에서 6시간 동안 가열시켜 우모를 가수분해한 후 phosphoric acid로 pH가 6-7인 약산성이 되도록 중화하고 감압 여과하여 가수분해물인 액상의 아미노산을 추출한 후, 4°C, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다.
- 여과지에 걸러진 깃털을 60°C 건조기(drying oven Mov-212, SANYO, Japan)에서 8시간 건조시킨 후 깃털의 건중량을 백분율로 나타내어(17) 우모분 분해능을 산출하였다.
- 우모 분해능 시험을 위하여 무기염배지(0.05% NH4Cl, 0.05% NaCl, 0.03% K2HPO4, 0.03% KH2PO4, 0.01% MgCl2⋅6H2O, 0.01% yeast extract, pH 7.5±0.2)에 케라틴 단백질 우모분(chicken feather meal)을 2.0% 첨가한 배지를 사용하였다(27).
- )를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 증폭산물의 16S rRNA 염기서열 결정에는 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems)를 이용하여 cycle sequencing을 수행한 후, ABI PRISM 310 Genetic Analyser (Applied Bio systems)로 염기서열을 결정하였다.
- 채취한 각 시료로부터 순수 분리된 균주를 1.0% skim milk agar plate에 접종하여 28°C, 2일간 배양한 후 10 mm 이상의 큰 투명환을 생성하는 균주를 단백질 분해능이 우수한 균주로 판정하고 1차 분리하였다.
- 채취한 시료로부터 세균을 분리하기 위하여 NA 평판배지(1.0% bacto beef extract, 1.0% bacto peptone, 0.5% NaCl, 1.2% agar, pH 7.5±0.2)를 사용하였다.
- 케라틴 단백질 분해미생물로 선발된 균주의 계통학적 위치를 검토하기 위하여 평판배지에 형성된 콜로니를 주형 DNA로하여 16S rRNA PCR 증폭하였다. 16S rRNA PCR 증폭에 사용된 primer는 E.
- 폐깃털은 양계장 내에 1년 이상 야적한 부산물을 채취하였고, 계분퇴비는 양계장 바닥 내 9개 지점으로부터 100 g씩 채취한 후 polyethylene vinyl bag에 넣어 실험실로 운반하여 4°C에 보존한 후 24시간 이내에 실험하였다.
- 효소 단위는 tyrosine 표준도표를 이용하여 기본 조건하에서 1분간 기질로부터 1 μg의 tyrosine을 유리하는 효소의 총량을 1 unit로 하여 protease activity를 나타내었다.
- Protease 활성 측정을 위해 배지에서 3일간 배양된 배양액을 4°C, 8,000 rpm에서 20분 동안 원심분리한 후 회수한 상등액을 조효소액으로 사용하였다. 효소의 활성 측정은 casein을 기질로 이용하는 방법을 사용하였다. 조효소액 0.
대상 데이터
- 16S rRNA PCR 증폭에 사용된 primer는 E. coli 16S rDNA 부분의 conserved sequence를 기초로 하여 합성된 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) primer와 1492R (5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGC-3′) primer를 사용하였다.
- FBF-7, Stenotrophomonas maltophilia FBS-4 그리고 Lysinibacillus sp. FBW-3를 최종 선발하였다. 이들 균주를 이용한 생물학적 분해법과 Ca(OH)2를 이용한 화학적 분해법에 의해 추출된 아미노산의 특성을 비교한 결과, Chryseobacterium sp.
- FBW-3의 염기서열은 GenBank에 각각 accession no. FJ938215, GQ287630 그리고 GQ287636로 등록하였다.
- 케라틴 단백질 분해세균을 분리하기 위하여 충남 보령과 홍성에 소재한 양계장으로부터 폐깃털 9시료와 양계장 부산물을 이용하여 퇴비발효가 진행되고 있는 계분퇴비 9시료를 채취하였으며, 전북 익산의 육계 가공공장으로부터 발생되는 폐수 시료를 포함해 총 19개의 시료를 채취하였다. 폐깃털은 양계장 내에 1년 이상 야적한 부산물을 채취하였고, 계분퇴비는 양계장 바닥 내 9개 지점으로부터 100 g씩 채취한 후 polyethylene vinyl bag에 넣어 실험실로 운반하여 4°C에 보존한 후 24시간 이내에 실험하였다.
이론/모형
- Phylogentic relationships of feather-degrading bacteria based on similarities of 16S rRNA. The phylogenetic tree was constructed using the neighbor-joining method. Bootstrap values and shown at nodes.
- 16S rRNA 유전자 분석을 통하여 염기서열을 결정한 후 DDBJ/NCBI/RDP/GenBank database의 BLAST program을 이용하여 계통분류학적 유연관계를 분석하였다. 각 염기서열의 alignment는 CLUSTAL X algorithm를 이용하여 병렬로 정렬하였고, 계통도의 작성은 근린 결합법(24)에 의거하여 계통분류학적 위치를 결정하였다(29).
성능/효과
- γ-Proteobacteria 계통군에는 Enterobacter aerogenes, Stenotrophomonas maltophilia가 속하였으며, Actinobacteria 계통군에는 Phycibacter jejuensis, Brevibacterium luteolum, Micrococcus lylae가 속하였고 그리고 Bacteroidetes 계통군에는 Chryseobacterium 속에 속하는 균주가 확인되어 계통학적으로 다양한 우모 분해세균이 양계장 부산물 내에 서식하는 것으로 판단되었다(Fig. 1).
- 이상의 결과로부터 Chryseobacterium sp. FBF-7 균주는 화학적 분해법에 의해 추출된 아미노산 함량과 유사한 함유량을 나타내었으며, 특히 필수 아미노산 함량이 화학적 분해법보다 더 높게 추출되는 특성을 나타내었다.
- FBF-7에 의해 생성된 필수 아미노산 함유량은 619.3 μmol/ml로 총 아미노산의 37%를 함유하였으며, 화학적 분해법에 의한 경우, 596.9 μmol/ml의 필수 아미노산을 생산하여 총 아미노산 함유량의 32%를 차지하는 것으로 나타났다.
- Chryseobacterium sp. FBF-7에 의해 총 17종의 아미노산이 추출되었으며, aspartic acid (11%), glutamic acid (11%), glycine (10%), valine (11%) 그리고 proline (10%)이 주요 아미노산으로 추출되는 특성을 나타내었다. 화학적 처리에 의해 추출된 아미노산의 경우, glutamic acid (10%), glycine (22%), alanine (10%) 그리고 valine (10%), proline (13%)이 주요 아미노산으로 추출되는 것으로 나타났다.
- Chryseobacterium sp. FBF-7에 의해 추출된 아미노산의 조성을 검토한 결과, valine, glutamic acid, aspartic acid, glycine 그리고 proline이 주요 아미노산이었으며, 특히 aspartic acid, threonine, serine, cysteine 그리고 tyrosine이 화학적 추출법보다 더 높게 추출되는 특징을 나타내었다.
- FBF-7에 의해 추출된 총 아미노산 함량이 1661.6 μmol/ml로 선발 균주 중 가장 높게 나타났으며, 화학적 분해법에 의해 추출된 총 아미노산 함량과 유사하였다.
- 5×109 CFU/ml의 높은 생육능을 나타내었다. Protease 활성을 측정한 결과, FBS-4 균주는 1,402 unit/ml/min를, FBW-3 균주는 1,276 unit/ml/min를 그리고 FBF-7 균주가 2,585 unit/ml/min의 매우 높은 활성을 나타내었다.
- 계분퇴비 시료로부터 분리한 FBS-4 균주는 γ-proteobacteria 계통군의 Stenotrophomonas 속에 속하였으며 Stenotrophomonas 속의 근연종들과 상동성을 조사한 결과, Stenotrophomonas maltophiliaT (X95923)와 99.78%의 높은 상동성을 나타내었다(15).
- 78%의 높은 상동성을 나타내었다(15). 또한, 닭 가공공장에서 채취한 폐수 시료로부터 분리한 FBW-3 균주는 Firmicutes 계통군의 Lysinibacillus 속에 속하였으며 Lysinibacillus 속에 속하는 근연종들과 상동성을 조사한 결과, Lysinibacillus boronitoleransT (AB199591)와 97.70%, Lysinibacillus fusiformisT (L14013)와 97.11%, Lysinibacillus sphaericusT (L14010)와 96.96%의 상동성을 나타내어 FBW-3 균주는 Lysinibacillus 속의 신종으로 제안되었다(1).
- 단백질 분해능이 우수한 88균주 중 난분해성 케라틴 단백질 분해세균을 선발하기 위하여 2% 우모분이 첨가된 무기염배지에 상기의 단백질 분해세균을 각각 접종하고, 37°C에서 3일간 진탕배양하면서 각 균주의 우모 분해능을 조사하였다. 배양 3일 후 65% 이상의 높은 우모 분해능을 나타내는 균주를 선발한 결과, 폐깃털로부터 분리한 단백질 분해세균 중 10균주, 계분퇴비로부터 20균주, 폐수로부터 1균주가 높은 우모 분해능을 나타내어 총 31균주를 케라틴 단백질 분해 우수균주로 확보하였다(Table 1).
- 양계장으로부터 채취한 폐깃털 및 계분퇴비와 닭 가공공장의 폐수시료로부터 순수 분리된 총 183 균주를 대상으로 skim milk 평판배지 상에서 직경이 10-17 mm 이상의 큰 투명환을 나타내는 단백질 분해세균을 1차 선별한 결과, 폐깃털로부터 37균주, 계분퇴비로부터 43균주 그리고 폐수로부터 8균주 총 88균주가 단백질 분해 우수균주로 선별되어 분리균주의 약 50%가 단백질 분해능을 나타내는 특성을 나타내었다. 선별된 단백질 분해 우수균주의 protease 활성을 측정한 결과 약 99-2,585 unit/ml/min의 높은 활성을 나타내었다. 이와 같은 결과로부터 양계장 부산물 시료는 단백질 분해미생물 유전자원 수집을 위한 우수한 시료임을 확인해 주었다.
- 수집된 우모 분해세균에 대해 16S rRNA 염기서열을 해석하여 계통학적 특성을 검토한 결과, Firmicutes (21균주), γ-proteobacteria (4균주), Actinobacteria (4균주) 그리고 Bacteroidetes (2균주) 계통군에 속하는 다양한 세균이 확보되었다.
- 양계장 부산물로부터 확보한 우모 분해세균 31균주에 대해 16S rRNA 염기서열을 결정하여 계통학적 특성을 검토한 결과, Firmicutes 계통군에 속하는 균주는 21균주로 수집된 총 우모 분해세균의 68%를 차지하였으며, γ-proteobacteria 계통군에 속하는 균주는 4균주, Actinobacteria 계통군에 속하는 균주는 4균주 그리고 Bacteroidetes 계통군에는 2균주가 확인되었다.
- 양계장으로부터 채취한 폐깃털 및 계분퇴비와 닭 가공공장의 폐수시료로부터 순수 분리된 총 183 균주를 대상으로 skim milk 평판배지 상에서 직경이 10-17 mm 이상의 큰 투명환을 나타내는 단백질 분해세균을 1차 선별한 결과, 폐깃털로부터 37균주, 계분퇴비로부터 43균주 그리고 폐수로부터 8균주 총 88균주가 단백질 분해 우수균주로 선별되어 분리균주의 약 50%가 단백질 분해능을 나타내는 특성을 나타내었다. 선별된 단백질 분해 우수균주의 protease 활성을 측정한 결과 약 99-2,585 unit/ml/min의 높은 활성을 나타내었다.
- 우모분이 첨가된 무기염배지 내에서 이들 우수 균주의 생육능을 조사한 결과, 2.1×108-1.5×109 CFU/ml의 높은 생육능을 나타내었다.
- 선별된 단백질 분해 우수균주의 protease 활성을 측정한 결과 약 99-2,585 unit/ml/min의 높은 활성을 나타내었다. 이와 같은 결과로부터 양계장 부산물 시료는 단백질 분해미생물 유전자원 수집을 위한 우수한 시료임을 확인해 주었다.
- 케라틴 단백질 우모 분해세균 31 균주 중 우모 분해율을 검토한 결과, FBS-4 균주의 분해율은 90%, FBW-3 균주은 85% 그리고 FBF-7 균주는 75%의 높은 분해율을 나타내어 우수균주로 최종 선발하였다. 우모분이 첨가된 무기염배지 내에서 이들 우수 균주의 생육능을 조사한 결과, 2.
- FBF-7에 의해 추출된 아미노산의 경우 aspartic acid, threonine, serine, cysteine, valine, tyrosine, phenylalanine, lysine, histidine 그리고 arginine은 화학적 분해법보다 높게 추출되는 특성을 나타내었다. 특히, aspartic acid (38%), threonine (287%), serine (303%), cysteine (262%) 그리고 tyrosine (88%)은 화학적 분해법보다 더 높게 추출되는 특징을 나타내었다(Fig. 4).
- 2에 나타내었다. 폐깃털 시료로부터 분리한 FBF-7 균주는 Bacteroidetes 계통군의 Chryseobacterium 속에 속하였으며 Chryseobacterium 속의 근연종들과 상동성을 검토한 결과, Chryseobacterium gambriniT (AM232810)와 99.15%, Chryseobacterium stagniT (DQ314742)와 99.08%의 상동성을 나타내었다(7). 계분퇴비 시료로부터 분리한 FBS-4 균주는 γ-proteobacteria 계통군의 Stenotrophomonas 속에 속하였으며 Stenotrophomonas 속의 근연종들과 상동성을 조사한 결과, Stenotrophomonas maltophiliaT (X95923)와 99.
- 한편, 화학적 분해법에 의해 추출된 필수 아미노산 함량은 596.9 μmol/ml로 총 아미노산 함유량의 32%를 차지하는 것으로 나타났다(Fig. 3).
- FBF-7에 의해 총 17종의 아미노산이 추출되었으며, aspartic acid (11%), glutamic acid (11%), glycine (10%), valine (11%) 그리고 proline (10%)이 주요 아미노산으로 추출되는 특성을 나타내었다. 화학적 처리에 의해 추출된 아미노산의 경우, glutamic acid (10%), glycine (22%), alanine (10%) 그리고 valine (10%), proline (13%)이 주요 아미노산으로 추출되는 것으로 나타났다.
후속연구
- Chryseobacterium sp. FBF-7 균주를 이용하여 케라틴 단백질 우모로부터 생산된 아미노산은 친환경 토양 개량제 및 작물생육촉진을 위한 아미노산 비료로써의 활용 가치가 매우 높을 것으로 기대된다.
- 특히 최종 선발된 우모 분해 우수세균 Chryseobacterium sp. FBF-7에 의해 추출된 추출 아미노산 함량은 기존 화학적 분해법에 의해 추출되는 함량과 유사하고 필수 아미노산 생성량도 높게 나타나 산업공정에서 전통적으로 이용되고 있는 화학촉매를 대체할 수 있는 상업용 효소로 개발 가능하다고 판단된다. Chryseobacterium sp.
- 본 연구를 통하여 확보된 케라틴 단백질 분해세균은 계통학적으로 다양한 미생물로 구성되어 있어 다양한 분야의 효소산업에 이용될 수 있는 유전자원으로 잠재적 가치가 클 것으로 기대한다. 특히 최종 선발된 우모 분해 우수세균 Chryseobacterium sp.
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