분자진화 기술을 통한 Vibrio metschnikovii 유래 고활성 알칼리성 단백질 분해효소 생산균주 개발 Strain Development for the Over-production of Alkaline Protease from Vibrio metschnikovii by Molecular Evolution원문보기
알칼리성 단백질 분해효소 고생산 돌연변이 균주 Vibrio metschnikovii L12-23, N4-8, KS1으로부터 알칼리성 단백질 분해효소를 암호화하는 vapK (Vibrio alkaline protease K) 유전자들을 PCR에 의하여 분리한 다음 DNA shuffling, error-prone PCR 방법과 같은 분자진화 기술을 통해 고활성 단백질 분해효소를 생산하는 재조합 V. metschnikovii 균주를 제작하였다. DNA shuffling 방법을 통해 변형시킨 vapK-1 유전자와 이 유전자를 주형으로 error-prone PCR 기법을 통해 재 변형된 vapK-2 유전자를 cloning한 후 V. metschnikovii KS1 균주에 역도입하여 재조합 균주를 제조하였다. 재조합 균주들의 단백질 분해 능력을 조사한 결과 vapK-2 유전자가 2 copy 도입된 재조합 균주의 경우 야생형 균주인 V. metschnikovii RH530에 비해 43.6배 높은 단백질 분해활성을 보였으며 숙주인 V. metschnikovii KS1에 비해 약 3.9배 향상된 단백질 분해 활성을 확인할 수 있었다. 변형된 vapK-1과 vapK-2 유전자를 야생형 vapK 유전자의 염기서열을 비교 분석한 결과 단백질 분해 능력의 활성에 영향을 미치는 active site를 제외한 부분에서 변화가 일어났음을 확인 할 수 있었다. 변형된 유전자 vapK-1을 two copy를 포함한 재조합 플라스미드를 가진 V. metschnikovii KS1을 30 L fermentor로 배양 하였을 때 배양 후 35 시간에 18,000 PU/ml의 활성을 보였으며, 이는 향후 산업용 균주로서 사용될 수 있는 가능성을 제시하였다.
알칼리성 단백질 분해효소 고생산 돌연변이 균주 Vibrio metschnikovii L12-23, N4-8, KS1으로부터 알칼리성 단백질 분해효소를 암호화하는 vapK (Vibrio alkaline protease K) 유전자들을 PCR에 의하여 분리한 다음 DNA shuffling, error-prone PCR 방법과 같은 분자진화 기술을 통해 고활성 단백질 분해효소를 생산하는 재조합 V. metschnikovii 균주를 제작하였다. DNA shuffling 방법을 통해 변형시킨 vapK-1 유전자와 이 유전자를 주형으로 error-prone PCR 기법을 통해 재 변형된 vapK-2 유전자를 cloning한 후 V. metschnikovii KS1 균주에 역도입하여 재조합 균주를 제조하였다. 재조합 균주들의 단백질 분해 능력을 조사한 결과 vapK-2 유전자가 2 copy 도입된 재조합 균주의 경우 야생형 균주인 V. metschnikovii RH530에 비해 43.6배 높은 단백질 분해활성을 보였으며 숙주인 V. metschnikovii KS1에 비해 약 3.9배 향상된 단백질 분해 활성을 확인할 수 있었다. 변형된 vapK-1과 vapK-2 유전자를 야생형 vapK 유전자의 염기서열을 비교 분석한 결과 단백질 분해 능력의 활성에 영향을 미치는 active site를 제외한 부분에서 변화가 일어났음을 확인 할 수 있었다. 변형된 유전자 vapK-1을 two copy를 포함한 재조합 플라스미드를 가진 V. metschnikovii KS1을 30 L fermentor로 배양 하였을 때 배양 후 35 시간에 18,000 PU/ml의 활성을 보였으며, 이는 향후 산업용 균주로서 사용될 수 있는 가능성을 제시하였다.
Alkaline protease-overproducing strains of Vibrio metschnikovii were developed by using the molecular evolution from the classical mutants V. metschnikovii L12-23, N4-8, and KS1. Each vapK (Vibrio alkaline protease K) was obtained from the genomic DNAs of mutants by PCR to carry out the DNA shufflin...
Alkaline protease-overproducing strains of Vibrio metschnikovii were developed by using the molecular evolution from the classical mutants V. metschnikovii L12-23, N4-8, and KS1. Each vapK (Vibrio alkaline protease K) was obtained from the genomic DNAs of mutants by PCR to carry out the DNA shuffling. The modified vapK-1 obtained by DNA shuffling was used again as a template for the error-prone PCR to make the vapK-2. Both genes were cloned in the plasmid pKF3 to construct the recombinant plasmids which have one or two copies of the modified genes. The recombinant plasmids were back-transformed to V. metschnikovii KS1 to construct recombinant V. metschnikovii that expresses the alkaline protease. About 3.9-fold more protease activity was measured in the strain which has the plasmid containing two copies of vapK-2 when compared to strain KS1. When compared to wild type V. metschnikovii RH530, 43-fold more activity was achieved. Comparison of amino acids among vapK, vapK-1, and vapK-2 revealed that the active sites was highly conserved and not changed. However, many amino acids except the active sites were changed. These results suggested that the changes in amino acids might play an important role in the increase of protease activity by allowing the easy access of substrate to active sites of the protease. The fermentation of alkaline protease from the V. metschnikovii KS1 harboring the plasmid that contains two copies of vapK-1 showed the possibility of this strain to be used as industrial producer.
Alkaline protease-overproducing strains of Vibrio metschnikovii were developed by using the molecular evolution from the classical mutants V. metschnikovii L12-23, N4-8, and KS1. Each vapK (Vibrio alkaline protease K) was obtained from the genomic DNAs of mutants by PCR to carry out the DNA shuffling. The modified vapK-1 obtained by DNA shuffling was used again as a template for the error-prone PCR to make the vapK-2. Both genes were cloned in the plasmid pKF3 to construct the recombinant plasmids which have one or two copies of the modified genes. The recombinant plasmids were back-transformed to V. metschnikovii KS1 to construct recombinant V. metschnikovii that expresses the alkaline protease. About 3.9-fold more protease activity was measured in the strain which has the plasmid containing two copies of vapK-2 when compared to strain KS1. When compared to wild type V. metschnikovii RH530, 43-fold more activity was achieved. Comparison of amino acids among vapK, vapK-1, and vapK-2 revealed that the active sites was highly conserved and not changed. However, many amino acids except the active sites were changed. These results suggested that the changes in amino acids might play an important role in the increase of protease activity by allowing the easy access of substrate to active sites of the protease. The fermentation of alkaline protease from the V. metschnikovii KS1 harboring the plasmid that contains two copies of vapK-1 showed the possibility of this strain to be used as industrial producer.
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제안 방법
metschnikovii KS1을 이용하여 30 L 발효조에서 배양하여 단백질 분해효소 생산성을 알아보았다. 30 L 발효조 배양을 위해서 재료 및 방법에 언급된 바와 같이 1차 seed culture를 100 ml의 LSC 배지가 들어있는 flask에서 수행하였으며, 그 후 2차 seed culture로서 2.5 L의 발효조에서 PM 배지를 이용하여 배양하였다. 이를 30 L 발효조에 옮겨 30℃에서 통기량 2.
metschnikovii 균주를 제작하였다. DNA shuffling 방법을 통해 변형시킨 vapK-1 유전자와 이 유전자를 주형으로 error-prone PCR 기법을 통해재 변형된 vapK-2 유전자를 cloning한 후 V. metschnikovii KS1 균주에 역도입하여 재조합 균주를 제조하였다. 재조합 균주들의 단백질 분해 능력을 조사한 결과 vapK-2 유전자가 2 copy 도입된 재조합 균주의 경우 야생형 균주인 V.
DNA shuffling에 의해 얻어진 변형 vapK 유전자를 주형으로 하여 error-prone PCR을 수행하였다. Error-prone PCR은 GeneMorphTM PCR Mutagenesis kit (Stratagene Co.
DNA shuffling에 의해 얻은 변형 vapK 유전자들을 pGEMTeasy vector에 cloning 한 후 이를 대장균에 형질전환 시켰다. 나타난 형질전환체로부터 단백질 분해효소 선별배지에서 큰 투명환(clear halo)을 보이는 대장균으로부터 재조합 플라스미드를 분리한 후 이를 제한효소 NotI으로 절단하여 변형 vapK 단편을 분리(vapK-1라 명명)한 다음, 이를 같은 제한효소로 절단된 플라스미드 pKF3로 삽입하여 pKF31을 제작하였다.
Escherichia coli는 재조합 플라스미드의 형질전환 숙주로 사용되었으며 경우에 따라서 chloramphenicol과 ampicillin을 각각 12.5 μg/ml, 50 μg/ml 농도로 첨가하여 사용 하였다.
사용한 제한 효소와 변형효소는 New England Biolab(USA)에서 구입하였으며 플라스미드 분리를 위한 kit는 QIAGEN (USA)에서 구입하여 사용하였다. Oligonucleotide는 Bioneer (Korea)에서 합성하였으며, DNA sequencing은 Macrogen (Korea)에 의뢰하였다. PCR은 1 min denaturation at 94℃, 1 min annealing at 54℃, and 1 min elongation at 72℃ for 40 cycles 조건에서 Perkin-Elmer thermal cycler(model 480)을 사용하였으며, Taq polymerase는 Promega(USA)에서 구입하였다.
PCR은 1 min denaturation at 94℃, 1 min annealing at 54℃, and 1 min elongation at 72℃ for 40 cycles 조건에서 Perkin-Elmer thermal cycler(model 480)을 사용하였으며, Taq polymerase는 Promega(USA)에서 구입하였다.
제작된 pKF31을 제한효소 SmaI으로 절단하고, 이에 Klenow 효소를 처리(15)하여 blunt end로 만든 vapK-1 단편을 결합시켜, 2 copy의 vapK-1이 삽입된 pDKF310 제작하였다. vapK-1을 주형으로 하여 error-prone PCR 방법에 의해 얻어진 단편(vapK-2라 명명)을 얻어 동일한 방법으로 vapK-2 단편이 1 copy 삽입된 pKFep5와 2 copy 삽입된 pDKFep5를 제조하였다(Fig. 3).
DNA shuffling에 의해 얻은 변형 vapK 유전자들을 pGEMTeasy vector에 cloning 한 후 이를 대장균에 형질전환 시켰다. 나타난 형질전환체로부터 단백질 분해효소 선별배지에서 큰 투명환(clear halo)을 보이는 대장균으로부터 재조합 플라스미드를 분리한 후 이를 제한효소 NotI으로 절단하여 변형 vapK 단편을 분리(vapK-1라 명명)한 다음, 이를 같은 제한효소로 절단된 플라스미드 pKF3로 삽입하여 pKF31을 제작하였다. 제작된 pKF31을 제한효소 SmaI으로 절단하고, 이에 Klenow 효소를 처리(15)하여 blunt end로 만든 vapK-1 단편을 결합시켜, 2 copy의 vapK-1이 삽입된 pDKF310 제작하였다.
0으로 조절하였다. 단백질 분해효소 고활성 선별 배지는 LB 배지에 2.5% agar와 1-2% skim milk를 첨가하여 사용하였다. Escherichia coli는 재조합 플라스미드의 형질전환 숙주로 사용되었으며 경우에 따라서 chloramphenicol과 ampicillin을 각각 12.
단백질 분해효소 활성 측정방법은 Yanagida 등(18)의 방법을 변형하여 사용하였다. 2% casein이 포함된 100 mM sodium carbonate 용액(pH 10.
본 연구에서는 이미 제조된 고활성 알칼리성 단백질 분해효소 고생산 돌연변이주들로부터 vapK 유전자를 증폭한 후 DNA shuffling에 의해 고역가 단백질 분해효소를 암호화하는 유전자 vapK-1을 만들고 이로부터 다시 error-prone PCR을 통한 재조합 유전자 vapK-2를 제조하였다. 이들 유전자를 고생산 균주인 V.
알칼리성 단백질 분해효소 고생산 돌연변이 균주 Vibrio metschnikovii L12-23, N4-8, KS1으로부터 알칼리성 단백질 분해효소를 암호화하는 vapK (Vibrio alkaline protease K) 유전자들을 PCR에 의하여 분리한 다음 DNA shuffling, error-prone PCR 방법과 같은 분자진화 기술을 통해 고활성 단백질 분해효소를 생산하는 재조합 V. metschnikovii 균주를 제작하였다. DNA shuffling 방법을 통해 변형시킨 vapK-1 유전자와 이 유전자를 주형으로 error-prone PCR 기법을 통해재 변형된 vapK-2 유전자를 cloning한 후 V.
야생형의 V. metschnikovii RH530과 classical mutagenesis를 통해 얻은 VapK 고활성 돌연변이주 L12-23, N4-8, KS1균주(3)의 genomic DNA를 분리한 다음 이를 주형으로 하여 vapK specific primer VFulF (5′-TTTCGGTTTTTTCTGCCG)와 VFulR (5′-CAGACCGTGTACAAGAAG)를 이용하여 vapK 유전자를 PCR로 증폭하였다.
야생형인 V. metschnikovii RH530과 classical mutagenesis를 통해 얻은 VapK 고생산 균주인 L12-23, N4-8 그리고 KS1의 vapK 유전자를 PCR로 얻은 다음, 이를 이용하여 DNA shuffling을 수행하여 변형된 vapK 유전자들을 얻었다. 이 유전자들을 클로닝하고 대장균에 형질전환한 후 skim milk를 포함하는 LB 배지에 배양하였을 때(Fig.
얻어진 두 유전자 vapK-1과 vapK-2 유전자와 아미노산 서열을 vapK와 비교하였다. Figure 4에서 나타난 바와 같이 VapK의 active site인 D169, H202 그리고 S358는 Pseudemonas sp.
그러나 이들 부위를 제외하고 DNA shuffling과 error-prone PCR을 통해 얻어진 고활성의 단백질 분해 유전자인 vapK-1, vapK-2를 야생형의 vapK의 DNA와 아미노산 염기서열을 비교 분석한 결과, DNA shuffling을 통해 얻어진 vapK-1은 14개의 염기가 변형되고 그로 인해 10개의 아미노산이 치환됐음이 관찰 되었으며, error-prone PCR을 통해 얻어진 vapK-2의 경우는 18개의 염기가 변형되고 그로 인해 17개의 아미노산이 치환됐음이 관찰되었다. 이들 아미노산의 변화가 단백질 분해효소 활성에 끼치는 영향을 알아보기 위하여 Homology modeling에 의한 단백질의 3차 구조를 비교하였다(http://umass.edu/microbio/rasmol). 그 결과 vapK-1과 vapK-2는 야생형 vapK에 비해 기질 결합 부위가 상대적으로 느슨해진 것으로 나타났으며, 이는 기질이 효소와 보다 더 효율적으로 결합할 수 있게 함으로써 결과적으로 효소활성 증가가 된 것으로 사료된다(자료 미제시).
본 연구에서는 이미 제조된 고활성 알칼리성 단백질 분해효소 고생산 돌연변이주들로부터 vapK 유전자를 증폭한 후 DNA shuffling에 의해 고역가 단백질 분해효소를 암호화하는 유전자 vapK-1을 만들고 이로부터 다시 error-prone PCR을 통한 재조합 유전자 vapK-2를 제조하였다. 이들 유전자를 고생산 균주인 V. metschnikovii KS1에 역도입하여 알칼리성 단백질 분해효소 고생산 재조합 균주를 제조한 후 그 특성을 연구하고 30 L 발효에 의해 그 생산성을 확인하였다.
재조합 대장균에서 선별된 고활성 변이 vapK 유전자를 vapK-1이라 명명하였다. 이후 vapK-1이 1 copy 삽입된 플라스미드 pKF31과 2 copy 삽입된 플라스미드 pDKF310을 제조하여 단백질 분해효소 고생산 균주인 V. metschnikovii KS1으로 역도입 하였다. 한편 얻어진 vapK-1을 주형으로 하여 error-prone PCR을 수행하였다.
한편 얻어진 vapK-1을 주형으로 하여 error-prone PCR을 수행하였다. 재변이가 예상되는 증폭된 vapK 유전자 후보들은 앞선 방법과 동일하게 대장균에 형질전환하여 고활성 변이 유전자를 선별하였으며, 이를 vapK-2라 명명하고, vapK-2 유전자가 1 copy 삽입된 pKFep5와 2 copy 삽입된 pDKFep5는 앞선 방법과 동일하게 숙주인 V. metschnikovii KS1으로 역도입하였다(Fig. 3).
나타난 형질전환체로부터 단백질 분해효소 선별배지에서 큰 투명환(clear halo)을 보이는 대장균으로부터 재조합 플라스미드를 분리한 후 이를 제한효소 NotI으로 절단하여 변형 vapK 단편을 분리(vapK-1라 명명)한 다음, 이를 같은 제한효소로 절단된 플라스미드 pKF3로 삽입하여 pKF31을 제작하였다. 제작된 pKF31을 제한효소 SmaI으로 절단하고, 이에 Klenow 효소를 처리(15)하여 blunt end로 만든 vapK-1 단편을 결합시켜, 2 copy의 vapK-1이 삽입된 pDKF310 제작하였다. vapK-1을 주형으로 하여 error-prone PCR 방법에 의해 얻어진 단편(vapK-2라 명명)을 얻어 동일한 방법으로 vapK-2 단편이 1 copy 삽입된 pKFep5와 2 copy 삽입된 pDKFep5를 제조하였다(Fig.
제작된 재조합 플라스미드 pKF31, pDKF310, pKFep5 그리고 pDKFep5를 가진 재조합 V. metschnikovii KS1과 야생균주인 V. metschnikovii RH530, 숙주 균주인 V. metschnikovii KS1의 단백질분해 활성 정도를 비교· 분석하였다.
제조된 재조합 균주 중 vapK-2 유전자를 2 copy 가진 재조합 V. metschnikovii KS1을 이용하여 30 L 발효조에서 배양하여 단백질 분해효소 생산성을 알아보았다. 30 L 발효조 배양을 위해서 재료 및 방법에 언급된 바와 같이 1차 seed culture를 100 ml의 LSC 배지가 들어있는 flask에서 수행하였으며, 그 후 2차 seed culture로서 2.
metschnikovii KS1으로 역도입 하였다. 한편 얻어진 vapK-1을 주형으로 하여 error-prone PCR을 수행하였다. 재변이가 예상되는 증폭된 vapK 유전자 후보들은 앞선 방법과 동일하게 대장균에 형질전환하여 고활성 변이 유전자를 선별하였으며, 이를 vapK-2라 명명하고, vapK-2 유전자가 1 copy 삽입된 pKFep5와 2 copy 삽입된 pDKFep5는 앞선 방법과 동일하게 숙주인 V.
이를 WizardTM Clean-Up system (Promega)을 이용하여 세척 후 회수하였다. 회수된 유전자를 이용하여 vapK specific primer와 함께 다시 PCR 반응을 거쳐 vapK 유전자를 증폭하여 변형된 유전자를 얻었다(Fig. 1).
대상 데이터
본 실험에서 사용된 균주 및 플라스미드는 Table 1에 나타내었으며 재조합 V. metschnikovii KS1은 단백질 분해효소 생산을 위한 재조합 숙주로 사용되었다(3). V.
Chromosomal DNA는 Mamur법(14)을 응용하여 분리하였다(14). 사용한 제한 효소와 변형효소는 New England Biolab(USA)에서 구입하였으며 플라스미드 분리를 위한 kit는 QIAGEN (USA)에서 구입하여 사용하였다. Oligonucleotide는 Bioneer (Korea)에서 합성하였으며, DNA sequencing은 Macrogen (Korea)에 의뢰하였다.
metschnikovii RH530과 classical mutagenesis를 통해 얻은 VapK 고생산 균주인 L12-23, N4-8 그리고 KS1의 vapK 유전자를 PCR로 얻은 다음, 이를 이용하여 DNA shuffling을 수행하여 변형된 vapK 유전자들을 얻었다. 이 유전자들을 클로닝하고 대장균에 형질전환한 후 skim milk를 포함하는 LB 배지에 배양하였을 때(Fig. 2A) 가장 큰 투명환을 보인 균주를 선별하였다(Fig. 2B). 이 균주로부터 재조합 플라스미드를 분리하여 변형 vapK 유전자를 분리한 결과 V.
이론/모형
기타 일반적인 분자생물학적인 방법은 Sambrook 등(15)의 것을 참고하여 사용하였다. V. metschnikovii의 형질전환은 Chung 등(5)의 방법에 따라 electroporation법을 사용하였다.
PCR은 1 min denaturation at 94℃, 1 min annealing at 54℃, and 1 min elongation at 72℃ for 40 cycles 조건에서 Perkin-Elmer thermal cycler(model 480)을 사용하였으며, Taq polymerase는 Promega(USA)에서 구입하였다. 기타 일반적인 분자생물학적인 방법은 Sambrook 등(15)의 것을 참고하여 사용하였다. V.
metschnikovii를 제조하기 위한 형질전환법도 보고하였다(5). 이와 같은 기존 연구를 바탕으로 본 연구에서는 고활성, 고생산 재조합 균주를 제조하기 위해 DNA shuffling과 error-prone PCR 등을 이용한 분자진화법(molecular evolution)을 사용하였다. 분자진화법은 다수의 유전자원으로부터 원하는 특성만을 조합하여 combinatorial chimera를 제조할 수 있는 기술로서 치료용 단백질의 개량, 산업용효소의 개량 및 역가 향상 등에 광범위하게 사용된다(17).
성능/효과
metschnikovii KS1의 단백질분해 활성 정도를 비교· 분석하였다. 그 결과 classical mutagenesis에 의해 제작된 VapK 고생산 숙주인 KS1 (1,808 PU/ml)에 비해 적게는 1.6배(2,953 PU/ml)에서 많게는 3.9배(6,980 PU/ml)의 높은 단백질 분해 활성도를 보였다(Table 2). 또한 이는 야생균주인 V.
edu/microbio/rasmol). 그 결과 vapK-1과 vapK-2는 야생형 vapK에 비해 기질 결합 부위가 상대적으로 느슨해진 것으로 나타났으며, 이는 기질이 효소와 보다 더 효율적으로 결합할 수 있게 함으로써 결과적으로 효소활성 증가가 된 것으로 사료된다(자료 미제시). 그러나 보다 정확하게는 단백질을 정제하여 보다 심도 있는 연구가 수행되어야 할 것으로 생각된다.
이는 vapK-2의 경우 이 변화가 단백질 분해 능력 및 효소 안정성에는 영향을 주지 않고 효소역가 향상이 일어났다는 것을 시사한다. 그러나 이들 부위를 제외하고 DNA shuffling과 error-prone PCR을 통해 얻어진 고활성의 단백질 분해 유전자인 vapK-1, vapK-2를 야생형의 vapK의 DNA와 아미노산 염기서열을 비교 분석한 결과, DNA shuffling을 통해 얻어진 vapK-1은 14개의 염기가 변형되고 그로 인해 10개의 아미노산이 치환됐음이 관찰 되었으며, error-prone PCR을 통해 얻어진 vapK-2의 경우는 18개의 염기가 변형되고 그로 인해 17개의 아미노산이 치환됐음이 관찰되었다. 이들 아미노산의 변화가 단백질 분해효소 활성에 끼치는 영향을 알아보기 위하여 Homology modeling에 의한 단백질의 3차 구조를 비교하였다(http://umass.
변형된 vapK-1과 vapK-2 유전자를 야생형 vapK 유전자의 염기서열을 비교· 분석한 결과 단백질 분해 능력의 활성에 영향을 미치는 active site를 제외한 부분에서 변화가 일어났음을 확인 할 수 있었다.
변형된 vapK-1과 vapK-2 유전자를 야생형 vapK 유전자의 염기서열을 비교· 분석한 결과 단백질 분해 능력의 활성에 영향을 미치는 active site를 제외한 부분에서 변화가 일어났음을 확인 할 수 있었다. 변형된 유전자 vapK-1을 two copy를 포함한 재조합 플라스미드를 가진 V. metschnikovii KS1을 30 L fermentor로 배양 하였을 때 배양 후 35 시간에 18,000 PU/ml의 활성을 보였으며, 이는 향후 산업용 균주로서 사용될 수 있는 가능성을 제시하였다.
6배의 높은 단백질 분해 활성도를 보였다. 이 결과는 전통적인 무작위 돌연변이법에 의해 KS1 균주가 야생형보다 약 11.3배 높은 역가를 보이는 것과 비교할 때, DNA shuffling, error-prone PCR 및 재조합 DNA을 통한 방법은, 무작위 돌연변이법을 통한 누적된 변이로 인해 더 이상 단백질 분해 활성도를 향상시키지 못했던 점을 극복하는 효율적 방법임을 나타낸다.
이러한 알칼리성 분해효소를 생산하는 고활성 균주를 개발하기 위하여 폐수로부터 균주를 분리하여 보고하였다(12, 13). 이 균주는 그람 음성균으로서 통 기성(facultative) 호알칼리성 균주인 Vibrio metschnikovii RH530으로 명명되었다. 이 균주는 광범위한 pH (7.
2B). 이 균주로부터 재조합 플라스미드를 분리하여 변형 vapK 유전자를 분리한 결과 V. metschnikovii의 vapK 고유의 프로모터 부위를 포함한 1.6 kb의 vapK 유전자 후보들을 얻을 수 있었다. 이는 vapK가 가지고 있는 V.
5, 60℃에서 최적활성을 보이는 6개의 서로 다른 단백질 분해효소와 1개의 알칼리성 metalloprotease를 분비하는 것으로 보고되었다(13). 이 중 주효소인 VapT와 VapK 효소가 정제되고 동정되었으며 특히 VapK는 분자량 약 29 kDa으로서 강력한 알칼리성 효소활성을 보이는 것으로 밝혀졌다. 이 단백질을 암호화하는 유전자 vapK가 클로닝 되어 그 특징이 밝혀졌고, 세탁세제로의 적합성을 나타내는 계면활성제 POE (polyoxyethylene oxide)와 AOS (α-olefin sulfonate) 등에 강한 내성을 보이며, 강력한 단백질 불활성 제제인 SDS와 urea에도 내성을 보이는 것으로 보고되었다(4, 5).
6 kb의 vapK 유전자 후보들을 얻을 수 있었다. 이는 vapK가 가지고 있는 V. metschnikovii 고유의 프로모터가 대장균에서도 안정적으로 작동한다는 것을 나타내며, 또한 단백질 분해효소 고생산 재조합 플라스미드 선별이 대장균에서 가능하다는 것을 나타낸다. 재조합 대장균에서 선별된 고활성 변이 vapK 유전자를 vapK-1이라 명명하였다.
metschnikovii KS1 균주에 역도입하여 재조합 균주를 제조하였다. 재조합 균주들의 단백질 분해 능력을 조사한 결과 vapK-2 유전자가 2 copy 도입된 재조합 균주의 경우 야생형 균주인 V. metschnikovii RH530에 비해 43.6배 높은 단백질 분해활성을 보였으며 숙주인 V. metschnikovii KS1에 비해 약 3.9배 향상된 단백질 분해 활성을 확인할 수 있었다. 변형된 vapK-1과 vapK-2 유전자를 야생형 vapK 유전자의 염기서열을 비교· 분석한 결과 단백질 분해 능력의 활성에 영향을 미치는 active site를 제외한 부분에서 변화가 일어났음을 확인 할 수 있었다.
후속연구
그 결과 vapK-1과 vapK-2는 야생형 vapK에 비해 기질 결합 부위가 상대적으로 느슨해진 것으로 나타났으며, 이는 기질이 효소와 보다 더 효율적으로 결합할 수 있게 함으로써 결과적으로 효소활성 증가가 된 것으로 사료된다(자료 미제시). 그러나 보다 정확하게는 단백질을 정제하여 보다 심도 있는 연구가 수행되어야 할 것으로 생각된다.
최대 균체 생장은 A560에서 측정하였을 때 약 35였다. 이러한 고생산은 1.2 kL 배양시에는 배양후 25시간에 약 23,000 PU/ml을 보였으며(자료 미제시)이는 향후 세탁세제 산업에 이용될 수 있는 고생산 균주로서 충분히 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
단백질 분해효소의 활용분야는?
지난 수 년 동안 산업용 효소의 상업적 연구가 증가함에 따라 각 분야에 필요한 고활성 효소를 고생산하는 연구가 필수적으로 대두 되었다. 특히 전 세계적으로 산업적 측면에서 중요한 위치를 차지하고 있으며 산업용효소 판매량의 약 60%를 차지하고 있는 단백질 분해효소는 세탁세제, 피혁가공, 식품 산업 등 각종 산업분야에 널리 응용 되고 있다. 단백질 분해효소는 동·식물, 미생물, 곰팡이, 효모 등에서 만들어 지고 있지만 동물, 식물 유래의 단백질 분해효소는 산업적 수요를 충당하기에 양적인 면에 있어서 제한되어 있다.
알칼리성 단백질 분해효소가 세탁세제에 사용되기 위해 필요한 조건은?
그 중 세탁세제에 필수적으로 첨가되는 성분으로서 광범위하게 사용되는 알칼리성 단백질 분해효소는 그 수요가 폭발적으로 증가 함에 따라 고활성, 고역가의 생산 균주를 제조하는 연구가 많이 보고 되었다(8). 알칼리성 단백질 분해효소가 세탁세제에 사용되기 위해서는 알칼리 pH에서 고활성을 유지하고 안정해야 하며, 세제에 첨가되는 각종 계면활성제들에 대해 내성을 지녀 그 활성을 유지해야 하고, 고온이나 저온에서 활성을 유지하면서 장기간 보존 가능해야 한다. 특히 다양한 기질에 대한 광범위한 특이성을 가질수록 그 활용도는 높아진다(2).
Vibrio metschnikovii RH530의 활성범위는?
이 균주는 그람 음성균으로서 통 기성(facultative) 호알칼리성 균주인 Vibrio metschnikovii RH530으로 명명되었다. 이 균주는 광범위한 pH (7.0-11.0)와 저온(20-30°C)에서 고온(65°C)까지 활성을 보이며 특히 pH 10.5, 60°C에서 최적활성을 보이는 6개의 서로 다른 단백질 분해효소와 1개의 알칼리성 metalloprotease를 분비하는 것으로 보고되었다(13). 이 중 주효소인 VapT와 VapK 효소가 정제되고 동정되었으며 특히 VapK는 분자량 약 29 kDa으로서 강력한 알칼리성 효소활성을 보이는 것으로 밝혀졌다.
참고문헌 (18)
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