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문제 정의
- 10,11) 그러나 이러한 일련의 보고에도 불구하고, PDE에 의한 조골세포내 cAMP의 조절은 아직 충분히 밝혀지지 않았다. 따라서 본 연구자는 조골세포내 PTH에 의한 adenylate cyclase의 활성화가 PDE에 의해 조절되는 기전을 조사하였기에 보고하는 바이다.
- 이는 PTH가 adenylate cyclase를 자극하여 조골세포내 cAMP의 농도를 일시적으로 상승시키는 한편, 동시에 PDE4를 활성화시킴으로써 cAMP의 항상성을 유지하는 것으로 생각된다. 이상의 결과는 조골세포에서 PDE4가 PTH 신호의 중요한 조절자로 작용할 가능성을 제시하는 것이라 할 수 있다.
- 조골세포내 cAMP는 다양한 신호전달 경로의 활성화에 관여함이 알려져 있다. 그 중 MAPK인 ERK와 p38의 신호전달경로가 PDE4에 의한 cAMP의 농도변화에 영향을 받는지 조사하였다. 먼저 ERK는 PTH 처리뿐 아니라 PDE4 저해제의 처리로도 활성화가 증가하였으며, PTH와 PDE4 저해제의 병용처리가 가장 강한 활성화를 보였다(Fig.
제안 방법
- 원심 분리한 후 10% FBS 함유 α-MEM으로 약 3~5×104 세포/100 mm plastic dish가 되도록 접종하였다.
- Polymerase chain reaction(PCR)은 아래의 프라이머를 사용하여 94 3분간 처리한 후, 94℃ 30초, 58℃ 45초 72℃ 1분의 과정을 32회 또는 28회(GAPDH) 반복하였다.
- 이를 5% skim milk가 함유된 PBST 용액으로 blocking하고, 1차 항체로서 anti-RANKL(1:1000, Santa cruiz), p-p38(1:2000, Cell signaling), p38(1:2000, Cell signaling), p-ERK(1:2000, Cell signaling), ERK(1:2000, Cell signaling) 또는 β-actin(1:4000, Sigma) 항체와 각각 반응시켰다.
- 초기 배양한 조골세포 5×103 세포/well와 골수세포 1×105 세포/well을 10% FBS가 함유된 α-MEM으로 PTH(100 nM), rolipram(10 mM), 또는 PTH와 rolipram의 존재하에서 7일간 공배양했다.
- 생후 0~1일의 ICR mouse로부터 두개골 피부를 벗긴 후 두개골을 적출하였다. 이때 후두골 근육 부착부분은 제거하였다.
- 경골 부분의 피부를 절개하여 부착 근육을 떼어냈다. 경골 원심부를 절단하고 슬개골을 탈골시켜 경골을 적출하였다. 뼈 양끝을 조금 잘라 한 쪽 끝에 25G의 주사바늘을 꽂고 α-MEM을 흘려보내 골수세포를 시험관에 모았다.
- 배양이 끝난 세포는 10% formalin으로 10분간 고정한 후 ethanol-aceton(1 : 1)로 1분간 재고정하여 TRAP(tartrateresistant acid phosphatase) staining을 했다. 3개 이상의 핵을 가진 TRAP+ 세포를 다핵 파골세포로 판정했다.
- PDE4 활성은 동일 실험을 10 mM rolipram 존재하에서 수행하고, rolipram 비반응성 활성을 전체 PDE 활성에서 뺀 값으로 얻었다. 단백질 농도는 BSA를 대조군으로 Bio-Rad protein reagent(Hercules, CA)를 사용하여 측정하였다.
- 이를 5% skim milk가 함유된 PBST 용액으로 blocking하고, 1차 항체로서 anti-RANKL(1:1000, Santa cruiz), p-p38(1:2000, Cell signaling), p38(1:2000, Cell signaling), p-ERK(1:2000, Cell signaling), ERK(1:2000, Cell signaling) 또는 β-actin(1:4000, Sigma) 항체와 각각 반응시켰다. PBST로 5회 세정하고 HRP(Horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체와 반응시킨 후 ECL Advance(Amersham. CO.)로 발색시켜 분석하였다.
- 7) 먼저 PTH에 의한 adenylate cyclase의 상승이 PDE를 활성화 시키는지 여부를 조사하였다. 조골세포에서 PTH의 처리는 유의적으로 PDE를 활성화시켰으며, PDE4 저해제를 이용한 실험에서 PTH에 의해 증가된 PDE 활성의 약 80%가 PDE4에 해당함이 밝혀졌다(Fig.
- 12) PTH 처리로 인한 PDE4 isotype의 발현량 변화를 RT-PCR 방법으로 분석하였다(Fig. 1B). 기존의 보고와 일치되게 조골세포는 PDE4A, 4B와 4D를 발현하였으며, PTH 처리로 PDE4A는 큰 변화 없는 반면, PDE4B와 PDE4D는 그 발현량이 각각 처리후 약 5배, 1.
- 13) 따라서 PDE에 의한 조골세포내 cAMP의 항상성 유지 기전이 RANKL 발현에 미치는 영향을 항 RANKL 항체로 조사하였다. PTH와 PDE4 저해제의 병용투여는 PTH에 의한 RANKL 단백질 발현을 증강시켰다(Fig.
- 3A). 조골세포에 의한 RANKL의 발현은 파골세포 형성과 비례적 관계가 있으므로 공배양계를 사용하여 PDE4에 의한 cAMP의 항상성 유지가 파골세포 형성에 미치는 영향을 조사하였다. PTH와 PDE4 저해제의 사용은 단독 처리에 비해 파골세포를 유의하게 증가시키는 것으로 나타났다(Fig.
대상 데이터
- 원심 분리한 후 10% FBS 함유 α-MEM으로 약 3~5×104 세포/100 mm plastic dish가 되도록 접종하였다. 5% CO2, 37℃에서 3-4일간 배양한 세포를 이후 조골세포로 실험에 사용하였다.
- ICR mouse(6~9주, 수컷)를 경추 탈골한 후 70% 에탄올로 소독하였다. 경골 부분의 피부를 절개하여 부착 근육을 떼어냈다.
데이터처리
- 실험결과는 평균+표준편차로 표기하였고, Student's t-test로 분석하여 p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
성능/효과
- 또한 조골 및 파골세포는 밀접한 관계를 맺고 있어, 파골세포의 분화는 조골세포에 의해 엄격하게 조절된다.1,2) 즉, 조골세포는 파골세포 분화인자인 M-CSF(Macrophage Colony-Stimulating Factor, or CSF-1) 및 RANKL(Receptor Activator of Nuclear Factor-kappaB Ligand, OPGL, ODF, or TRANCE)을 통해 파골세포의 분화를 조절함으로써 체내 골형성과 골파괴의 동적인 평형을 유지한다.2-5)
- 7) 먼저 PTH에 의한 adenylate cyclase의 상승이 PDE를 활성화 시키는지 여부를 조사하였다. 조골세포에서 PTH의 처리는 유의적으로 PDE를 활성화시켰으며, PDE4 저해제를 이용한 실험에서 PTH에 의해 증가된 PDE 활성의 약 80%가 PDE4에 해당함이 밝혀졌다(Fig. 1A). 이는 PTH가 adenylate cyclase를 자극하여 조골세포내 cAMP의 농도를 일시적으로 상승시키는 한편, 동시에 PDE4를 활성화시킴으로써 cAMP의 항상성을 유지하는 것으로 생각된다.
- 1B). 기존의 보고와 일치되게 조골세포는 PDE4A, 4B와 4D를 발현하였으며, PTH 처리로 PDE4A는 큰 변화 없는 반면, PDE4B와 PDE4D는 그 발현량이 각각 처리후 약 5배, 1.8배로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. PDE4C는 PTH 처리로 아무 변화를 보이지 않았다.
- 그 중 MAPK인 ERK와 p38의 신호전달경로가 PDE4에 의한 cAMP의 농도변화에 영향을 받는지 조사하였다. 먼저 ERK는 PTH 처리뿐 아니라 PDE4 저해제의 처리로도 활성화가 증가하였으며, PTH와 PDE4 저해제의 병용처리가 가장 강한 활성화를 보였다(Fig. 2A). 이는 PDE4가 PTH 처리뿐 아니라 조골세포의 basal cAMP 농도도 동시에 조절함을 의미하는 결과이다.
- 2A). 또한 p38의 활성화 역시 PTH, PDE4 저해제 단독처리로 증가하였으며, PTH와 PDE4 저해제의 병용처리로 가장 증가하였다. 활성화 시간은 PTH처리와 동일하게 5~15분에서 피크를 보였다(Fig.
- 조골세포에 의한 RANKL의 발현은 파골세포 형성과 비례적 관계가 있으므로 공배양계를 사용하여 PDE4에 의한 cAMP의 항상성 유지가 파골세포 형성에 미치는 영향을 조사하였다. PTH와 PDE4 저해제의 사용은 단독 처리에 비해 파골세포를 유의하게 증가시키는 것으로 나타났다(Fig. 3B). 이는 조골세포내 PDE4에 의한 cAMP의 항상성 유지가 RANKL 발현을 통해 PTH에 의한 파골세포 형성을 조절함을 의미한다.
- 이는 조골세포내 PDE4에 의한 cAMP의 항상성 유지가 RANKL 발현을 통해 PTH에 의한 파골세포 형성을 조절함을 의미한다. 이상의 결과로 PTH는 조골세포내 PDE4를 활성화시킴으로써 RANKL에 의한 파골세포의 과분화를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 본 연구를 통해 PTH에 대한 조골세포내 항상성 유지의 새로운 기전이 제시되었으며, 이를 이용한 골대사 장애 치료제 등의 개발도 가능할 것으로 생각된다.
- PTH는 조골세포내 PDE의 활성을 증가시켰으며, 이는 대부분 PDE4의 활성증가에 기인하였다. PTH는 4개의 PDE4 isotype 중 PDE4B와 PDE4D mRNA의 발현을 증가시켰으며, 이러한 발현 증가가 PDE4 활성 증가로 이어진 것으로 추정되었다. PDE4 저해제는 PTH에 의한 하류신호전달 분자인 ERK와 p38의 활성화를 증가시켰으며, RANKL 단백질 발현의 증강을 통해 파골세포 분화도 촉진시키는 것으로 나타났다.
- PTH는 4개의 PDE4 isotype 중 PDE4B와 PDE4D mRNA의 발현을 증가시켰으며, 이러한 발현 증가가 PDE4 활성 증가로 이어진 것으로 추정되었다. PDE4 저해제는 PTH에 의한 하류신호전달 분자인 ERK와 p38의 활성화를 증가시켰으며, RANKL 단백질 발현의 증강을 통해 파골세포 분화도 촉진시키는 것으로 나타났다. 이상의 결과는 첫째, PTH에 의한 신호를 PDE4가 음성적으로 조절하며, 둘째, PTH는 조골세포내 PDE4를 활성화시킴으로써 RANKL에 의한 파골세포의 과분화를 억제함을 시사하는 것이라 할 수 있다.
- PDE4 저해제는 PTH에 의한 하류신호전달 분자인 ERK와 p38의 활성화를 증가시켰으며, RANKL 단백질 발현의 증강을 통해 파골세포 분화도 촉진시키는 것으로 나타났다. 이상의 결과는 첫째, PTH에 의한 신호를 PDE4가 음성적으로 조절하며, 둘째, PTH는 조골세포내 PDE4를 활성화시킴으로써 RANKL에 의한 파골세포의 과분화를 억제함을 시사하는 것이라 할 수 있다.
후속연구
- 이상의 결과로 PTH는 조골세포내 PDE4를 활성화시킴으로써 RANKL에 의한 파골세포의 과분화를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 본 연구를 통해 PTH에 대한 조골세포내 항상성 유지의 새로운 기전이 제시되었으며, 이를 이용한 골대사 장애 치료제 등의 개발도 가능할 것으로 생각된다.
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