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문제 정의
- 이러한 성장인자인 PDGF, TGF-b, EGF나 TNF-α 등을 이용한 연구가 있어 왔다.8,9 하지만 저자들은 이러한 진피뿐만 아니라 표피조직 또한 반흔의 형성에 중요한 역할을 할 것으로 생각하고 상대적으로 연구가 적은 각질세포조직의 유전자적 분석을 시행하고자 계획하였다.
- 하지만 최근에는 표피와 진피와의 상호작용은 물론이고 표피 자체 역시 창상의 치유와 흉터 형성에 많은 역할을 미친다는 것이 알려져 있으며, 이러한 표피조직이 흉터형성에 미치는 영향을 이해하는 것이 반흔의 치료와 예방에 많은 도움을 줄 수 있을 것이다 5,6 이에 저자는 표피조직을 형성하는 각질세포를 분자레벨에서 분석하여 반흔각질세포와 정상각질세포의 유전자 차등발현을 비교하고자 하였다.
제안 방법
- 각각 4개의 비후성 반흔과 정상 피부조직으로부터 Rheinward/Green 방법과 일부 변형된 방법을 통해 각질 세포를 분리 배양하였다. 먼저 피부조직을 CMF-HBSS (calcium & magnesium-free Hank's balanced salt solution, Gibco/BRL, USA)에 담그고 3번 바꿔주었다.
- A, B, C, D DNA chip 모두에서 각각 반흔세포에서 up regulated된 유전자들을 확인할 수 있었으며 이들 각각의 유전자에 대한 정보는 cytoscapes, DAVID, NCBI and UCSC genome browser를 이용하여 각 유전자의 기능적 의미를 얻었다. 그리하여 이들 중 흉터형성에 크게 관련 있지 아니한 것으로 보이는 유전자를 제외하여 신호강도를 비교하였다(Tables I~IV).
- 충분한 RNA를 얻기 위해, mRNA로부터 합성한 cDNA를 Ampliscribe T7 Tranx-X-scription Kits (Epicentre Technologies, Madison, WI)를 이용하여 증폭하였다. 다시 역전사에 의해 RNA를 얻고, DHT 처리한 RNA들은 Cy5-dUTP (Amersham, Buckinghamshire, UK)를 사용하여 붉은 형광으로 표지하였고, ethanol 처리된 세포들은 Cy3-vdUTP (Amersham, Buckinghamshire, UK)를 사용하여 녹색 형광으로 표지하였다. cDNA chip의 제작은 chung 등의 방법대로 시행하였다.
- 형광 강도(Fluorescence intensities)는 Scanarray 4000동초점의 laser confocal scanner (GSI Lumonics, USA)를 사용하여 측정하였다. 두 형광 영상은 각각 스캔하였고 색채 영상은 녹색 계통으로 대조군의 세포 강도(cell intensity)와 적색 계통으로 비교하고자하는 군의 세포 강도(intensity)를 처리하였다. 자료는 GenePix software (version 3.
- 반흔 형성과정에서 진피가 아닌 표피의 각질세포가 어떻게 작용하는지를 알아보고자 하였으며, 이를 위해 각질세포를 배양하여 미세배열 혼성을 통한 유전자 데이터 분석을 시행하였다. Heat shock protein이 가장 강한 강도의 차이를 보였으며, 반흔 형성에 중요한 역할을 함을 유추할 수 있었다.
- 반흔세포와 정상 피부세포로부터 각질세포를 배양한 후 미세배열 혼성을 시행하여 A, B, C, D 4개의 DNA 대조군 chip을 얻었다. 이를 데이터 분석 비교하여 각각의 군에서 반흔세포의 각질세포와 정상피부의 각질세포에서의 유전자 강도 차이를 얻어 도식화하였다.
- 먼저 피부조직을 CMF-HBSS (calcium & magnesium-free Hank's balanced salt solution, Gibco/BRL, USA)에 담그고 3번 바꿔주었다. 상피조직만을 분리하기 위해 진피조직을 제거한 후 type II collagenase, (1.0 mg/mL : Sigma, USA)와 dispase grade II (2.4 mg/mL, Boehringer-Mannheim, USA)를 함유한 CMFHBSS에 37℃에서 90분간 처리하였다. 분리한 상피를 잘게 잘라서 0.
- 53 mm EDTA (ethylene diaminetetra-aceticacid, Gibco/BRL, USA)로 처리하여 각질세포를 분리하였다. 얻어진 세포는 미리 준비한 3T3 섬유아세포(fibroblast) 영양세포층(feeder layer) 위에서 성장인자를 보충한 KGM (keratinocyte growth medium, Gibco/ BRL, USA)으로 37℃, 5% CO₂환경에서 단층배양(monolayer culture)하였다. 약 4회까지 계대 배양하여 노화 (senescence)가 되기 전에 충분한 양의 배양표피를 얻었다.
- 반흔세포와 정상 피부세포로부터 각질세포를 배양한 후 미세배열 혼성을 시행하여 A, B, C, D 4개의 DNA 대조군 chip을 얻었다. 이를 데이터 분석 비교하여 각각의 군에서 반흔세포의 각질세포와 정상피부의 각질세포에서의 유전자 강도 차이를 얻어 도식화하였다. A, B, C, D DNA chip 모두에서 각각 반흔세포에서 up regulated된 유전자들을 확인할 수 있었으며 이들 각각의 유전자에 대한 정보는 cytoscapes, DAVID, NCBI and UCSC genome browser를 이용하여 각 유전자의 기능적 의미를 얻었다.
- 전체 RNA는 Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용한 일부 변형된 acid penol 방법을 통해 배양된 각질세포로부터 추출하였다. mRNA는 RNA로부터 Dynabead mRNA purification kit (Dynal AS, Oslo, Norway)를 사용하여 분리하였다.
- mRNA는 RNA로부터 Dynabead mRNA purification kit (Dynal AS, Oslo, Norway)를 사용하여 분리하였다. 충분한 RNA를 얻기 위해, mRNA로부터 합성한 cDNA를 Ampliscribe T7 Tranx-X-scription Kits (Epicentre Technologies, Madison, WI)를 이용하여 증폭하였다. 다시 역전사에 의해 RNA를 얻고, DHT 처리한 RNA들은 Cy5-dUTP (Amersham, Buckinghamshire, UK)를 사용하여 붉은 형광으로 표지하였고, ethanol 처리된 세포들은 Cy3-vdUTP (Amersham, Buckinghamshire, UK)를 사용하여 녹색 형광으로 표지하였다.
- 형광 강도(Fluorescence intensities)는 Scanarray 4000동초점의 laser confocal scanner (GSI Lumonics, USA)를 사용하여 측정하였다. 두 형광 영상은 각각 스캔하였고 색채 영상은 녹색 계통으로 대조군의 세포 강도(cell intensity)와 적색 계통으로 비교하고자하는 군의 세포 강도(intensity)를 처리하였다.
이론/모형
- 0, Axon Instruments, Inc)를 사용하여 분석하였다. 각 정렬 결과는 LOWESS algorithm (Yang et al, 2002)에 의해 within-print-tip group에 따라 표준화하였다. 그리고 잡음 신호를 줄이기 위해 1.
성능/효과
- 5 이러한 임상적 경험들이 표피의 결손과 진피섬유모세포의 세포외 기질의 합성사이에 관련이 있으며 정상 표피조직에서 흉터 형성을 억제하는 일종의 신호를 생성한다고 생각할 수 있게 하여 준다.10,11 이런 점에서 각질세포를 유전자 분석을 시행하였으며 이를 통해 heat shock protein 70이 가장 유의하게 증가됨을 확인하여 각질세포의 반흔 형성에서 중요한 역할을 할 것으로 생각하였다.
- 이를 데이터 분석 비교하여 각각의 군에서 반흔세포의 각질세포와 정상피부의 각질세포에서의 유전자 강도 차이를 얻어 도식화하였다. A, B, C, D DNA chip 모두에서 각각 반흔세포에서 up regulated된 유전자들을 확인할 수 있었으며 이들 각각의 유전자에 대한 정보는 cytoscapes, DAVID, NCBI and UCSC genome browser를 이용하여 각 유전자의 기능적 의미를 얻었다. 그리하여 이들 중 흉터형성에 크게 관련 있지 아니한 것으로 보이는 유전자를 제외하여 신호강도를 비교하였다(Tables I~IV).
- 77609로 정상 각질세포에 비해 비후성 반흔 각질세포에서 가장 유의하게 강도가 증가하였음을 확인할 수 있었으며 이외에도 heat shock 60 kDa protein1 또한 유의하게 강도가 증가 하였다. Heat shock protein (HSP)가 A군, B군, C군 모두에서 공통적으로 유전자들 중에서 가장 큰 강도의 차이를 보였고, D군에서도 유의한 강도의 차이를 보였다.
- 반흔 형성과정에서 진피가 아닌 표피의 각질세포가 어떻게 작용하는지를 알아보고자 하였으며, 이를 위해 각질세포를 배양하여 미세배열 혼성을 통한 유전자 데이터 분석을 시행하였다. Heat shock protein이 가장 강한 강도의 차이를 보였으며, 반흔 형성에 중요한 역할을 함을 유추할 수 있었다. 좀 더 자세한 기전과 다른 전사인자들과의 관계가 밝혀진다면 반흔의 예방과 치료에 새로운 방법을 제시할 수 있을 것이다.
- 공통적으로 heat shock 70 kD protein 8이 A군에서 fold change : 2.38631 그리고 B군에서 fold change : 1.77609로 정상 각질세포에 비해 비후성 반흔 각질세포에서 가장 유의하게 강도가 증가하였음을 확인할 수 있었으며 이외에도 heat shock 60 kDa protein1 또한 유의하게 강도가 증가 하였다. Heat shock protein (HSP)가 A군, B군, C군 모두에서 공통적으로 유전자들 중에서 가장 큰 강도의 차이를 보였고, D군에서도 유의한 강도의 차이를 보였다.
- 또한 HSP70은 TNF, Monocyte, Oxidative stress, Chemotherapeutic agents, Ceramide and radiation으로부터 유래되는 세포독성(Cytotoxicity)으로 부터 세포를 보호하는 역할도 한다. 본 실험에서도 비후성 반흔에서 HSP70이 증가하였는데 이는 세포자멸사가 억제되고 이로 인해 세포수의 감소가 적어져 비후성 반흔의 증가된 흉터조직을 형성하는데 영향을 미쳤을 것으로 볼 수 있다. 한편 실험에서 증가를 보인 HSP60 역시 세포자멸사에 영향을 미치는데, HSP60은 Anti-apoptotic role과 Pro-apoptotic role을 가지고 있다.
- 본 연구에서 HSP70은 정상피부에서와 비교할 때 비후성 반흔에서 가장 유의하게 증가되었으며 이는 HSP70이 창상에 의한 스트레스요인에 세포를 보호하고, 또한 제거되어야 세포의 세포자멸사에 영향을 미쳤음을 유추하여 볼 수 있다. HSP의 세포자멸사의 조정자역할로서의 기능을 이용하여 과도한 세포의 증식을 막아 반흔조직의 축적을 줄이고 세포사를 유도하는 기전을 조절하여 손상되거나 필요 없는 조직을 줄일 수 있다면 창상치유과정 및 반흔의 형성과 치료에 큰 역할을 할 수 있을 것으로 생각된다.
후속연구
- 본 연구에서 HSP70은 정상피부에서와 비교할 때 비후성 반흔에서 가장 유의하게 증가되었으며 이는 HSP70이 창상에 의한 스트레스요인에 세포를 보호하고, 또한 제거되어야 세포의 세포자멸사에 영향을 미쳤음을 유추하여 볼 수 있다. HSP의 세포자멸사의 조정자역할로서의 기능을 이용하여 과도한 세포의 증식을 막아 반흔조직의 축적을 줄이고 세포사를 유도하는 기전을 조절하여 손상되거나 필요 없는 조직을 줄일 수 있다면 창상치유과정 및 반흔의 형성과 치료에 큰 역할을 할 수 있을 것으로 생각된다.
- Heat shock protein이 가장 강한 강도의 차이를 보였으며, 반흔 형성에 중요한 역할을 함을 유추할 수 있었다. 좀 더 자세한 기전과 다른 전사인자들과의 관계가 밝혀진다면 반흔의 예방과 치료에 새로운 방법을 제시할 수 있을 것이다.
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