집먼지 진드기 항원으로 아토피 피부염을 유발한 NC/Nga 생쥐에 미치는 $\\gamma$-PGA의 효과 The Effect of $\\gamma$-PGA on NC/Nga Mice, a Mouse Model for Mite Antigen-induced Atopic Dermatitis원문보기
$\gamma$-PGA는 우리 전통 콩 발효식품인 청국장의 끈적끈적한 점액성 성분의 하나로, 매우 다양한 기능을 가지고 있는 천연물질이다. 이러한 $\gamma$-PGA의 아토피발진 억제 효과를 알아보고자 NC/Nga 생쥐를 사용하여 in vivo 실험을 하였다. BMAC로 유도된 NC/Nga 아토피 피부발진 생쥐에 분자량 300 kDa인 $\gamma$-PGA(PGA-HM)와 이를 저분자화 시킨 저분자 $\gamma$-PGA(PGA-LM)을 경구 투여한 결과 PGA-LM 투여군에서 clinical skin severity score가 유의성 있게 감소하였다. 혈청 IgE 수준은 PGA-LM이 대조군에 비하여 유의적으로 감소하였고, 혈청 IgG1 수준은 대조군에 비하여 감소하였으나 두 군 모두 유의성이 없었다. $CD4^+CD25^+foxp3^+$ Treg 세포가 유도되는 것을 확인하기 위하여, PGA-HM와 PGA-LM를 투여한 NC/Nga 아토피 피부발진 생쥐의 등 부위에서 mRNA를 분리히여 real-time PCR로 foxp3 mRNA 유전자 발현량을 측정한 결과는 대조군에 비하여 PGA-LM 투여군이 약 2배 이상 증가를 나타내었다. 또한 등피부 조직의 조직검사에서도 epidermis의 두께, 비만세포 침윤, 그리고 $CCR3^+$ 세포수 등이 대조군에 비하여 현저히 억제됨을 관찰할 수 있었다. 이상의 결과로 PGA-HM보다 PGA-LM이 BMAC로 아토피 피부염이 유발된 NC/Nga 생쥐에 $CD4^+CD25^+foxp3^+$ Treg 세포를 활성화하여 IgE 및 염증 사이토카인의 생산 및 $CCR3^+$호산구의 활성화가 억제되어 아토피조절 효과를 나타내는 것으로 사료되었다.
$\gamma$-PGA는 우리 전통 콩 발효식품인 청국장의 끈적끈적한 점액성 성분의 하나로, 매우 다양한 기능을 가지고 있는 천연물질이다. 이러한 $\gamma$-PGA의 아토피발진 억제 효과를 알아보고자 NC/Nga 생쥐를 사용하여 in vivo 실험을 하였다. BMAC로 유도된 NC/Nga 아토피 피부발진 생쥐에 분자량 300 kDa인 $\gamma$-PGA(PGA-HM)와 이를 저분자화 시킨 저분자 $\gamma$-PGA(PGA-LM)을 경구 투여한 결과 PGA-LM 투여군에서 clinical skin severity score가 유의성 있게 감소하였다. 혈청 IgE 수준은 PGA-LM이 대조군에 비하여 유의적으로 감소하였고, 혈청 IgG1 수준은 대조군에 비하여 감소하였으나 두 군 모두 유의성이 없었다. $CD4^+CD25^+foxp3^+$ Treg 세포가 유도되는 것을 확인하기 위하여, PGA-HM와 PGA-LM를 투여한 NC/Nga 아토피 피부발진 생쥐의 등 부위에서 mRNA를 분리히여 real-time PCR로 foxp3 mRNA 유전자 발현량을 측정한 결과는 대조군에 비하여 PGA-LM 투여군이 약 2배 이상 증가를 나타내었다. 또한 등피부 조직의 조직검사에서도 epidermis의 두께, 비만세포 침윤, 그리고 $CCR3^+$ 세포수 등이 대조군에 비하여 현저히 억제됨을 관찰할 수 있었다. 이상의 결과로 PGA-HM보다 PGA-LM이 BMAC로 아토피 피부염이 유발된 NC/Nga 생쥐에 $CD4^+CD25^+foxp3^+$ Treg 세포를 활성화하여 IgE 및 염증 사이토카인의 생산 및 $CCR3^+$ 호산구의 활성화가 억제되어 아토피조절 효과를 나타내는 것으로 사료되었다.
As one of the mucous components of Cheonggukjang, traditional fermented soybean paste, $\gamma$-PGA is a natural substance with diverse functions. In this paper, an in-vivo experiment has been performed using NC/Nga mice in order to find out the efficacy of $\gamma$-PGA in huma...
As one of the mucous components of Cheonggukjang, traditional fermented soybean paste, $\gamma$-PGA is a natural substance with diverse functions. In this paper, an in-vivo experiment has been performed using NC/Nga mice in order to find out the efficacy of $\gamma$-PGA in human atopic dermatitis. The NC/Nga mice with BMAC-induced atopic dermatitis were administered $\gamma$-PGA (PGA-HM) with 300 kDa and low-molecular $\gamma$-PGA (PGA-LM), respectively. As a result, a significant decrease in clinical skin severity score was detected in the group that was administered PGA-LM. In terms of serum IgE levels, a significant decline was observed in PGA-LM, compared to the control group. The serum IgG1 levels also decreased more in PGA-LM than in the control group. However, no significant difference was observed in both groups. To witness the induction of $CD4^+CD25^+foxp3^+$ Treg cells, mRNA was sampled from the back of PGA-HM- and PGA-LM-administered NC/Nga mice with atopic dermatitis. In terms of the production amount of foxp3 mRNA, which was measured in real-time PCR, the group that was administered PGA-LM was twice as high as the control group. According to a biopsy on the skin on the backs of the mice, the experimental group was also far lower than the control group in terms of epidermis thickness, mast cell infiltration and the number of $CCR3^+$ cells. Therefore, it has been confirmed that the atopic dermatitis symptoms decreased more in the PGA-LM-administered NC/Nga mice than the PGA-HM-administered group by facilitating $CD4^+CD25^+foxp3^+$ Treg cells and suppressing the activity of eosinophils and production of IgE and pro-inflammatory cytokines.
As one of the mucous components of Cheonggukjang, traditional fermented soybean paste, $\gamma$-PGA is a natural substance with diverse functions. In this paper, an in-vivo experiment has been performed using NC/Nga mice in order to find out the efficacy of $\gamma$-PGA in human atopic dermatitis. The NC/Nga mice with BMAC-induced atopic dermatitis were administered $\gamma$-PGA (PGA-HM) with 300 kDa and low-molecular $\gamma$-PGA (PGA-LM), respectively. As a result, a significant decrease in clinical skin severity score was detected in the group that was administered PGA-LM. In terms of serum IgE levels, a significant decline was observed in PGA-LM, compared to the control group. The serum IgG1 levels also decreased more in PGA-LM than in the control group. However, no significant difference was observed in both groups. To witness the induction of $CD4^+CD25^+foxp3^+$ Treg cells, mRNA was sampled from the back of PGA-HM- and PGA-LM-administered NC/Nga mice with atopic dermatitis. In terms of the production amount of foxp3 mRNA, which was measured in real-time PCR, the group that was administered PGA-LM was twice as high as the control group. According to a biopsy on the skin on the backs of the mice, the experimental group was also far lower than the control group in terms of epidermis thickness, mast cell infiltration and the number of $CCR3^+$ cells. Therefore, it has been confirmed that the atopic dermatitis symptoms decreased more in the PGA-LM-administered NC/Nga mice than the PGA-HM-administered group by facilitating $CD4^+CD25^+foxp3^+$ Treg cells and suppressing the activity of eosinophils and production of IgE and pro-inflammatory cytokines.
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문제 정의
본 실험에서는 PGA-HM과 PGA-LM의 아토피 피부염 억제작용을 확인하기 위하여 NC/Nga 생쥐를 이용하여 실험하였다. 제모한 NC/Nga 생쥐의 피부에 BMAC1- 도포하여 아토피 피부발진을 유발하였다.
본 연구는 PGA-HM 과 PGA-LM 투여로 활성화된 CD4+CD25+foxp3+ Treg 세포가 BMAC로 유도된 NC/Nga 아토피 생쥐의 피부발진 부위로 이동하여 피부발진을 억제하는지를 증명하기 위하여, 등피부를 biopsy하여 real-time PCR로 foxp3 mRNA유전자 발현량을 측정하였다(Fig. 4). 그 결과 대조군에 대한 foxp3 mRNA의 유전자발현의 상대 정량 값(RQ)은 BMAC를 도포하지 않은 정상 NC/Nga 생쥐군 0.
본 연구에서는 평균 분자량이 300 kDa의 고분자(high molecular) *PGA (이하 PGA-HM이라 한다)를 저분 자화시켜 저분자(low molecular) r-PGA(이하 PGA-LM이라 한다)를 만들고, in vivo에서 NC/Nga 생쥐에 Biostir mite antigen cream (BMAC)을 3주간 도포하여 피부발진을 유발시킨 후 양성대조군으로 FK506 0.3%를 도포하였고, PGA- HM과 PGA-LM을 경구 투여한 후 면역글로블린 측정 , 면역조직화학분석 및 foxp3+ mRNA 유전자 발현 측정 등을 분석하여 아토피 피부발진에 미치는 영향을 실험적으로 규명하고자 하였다.
제안 방법
BMAC는 주 2회 3주간(10~13주령 ) 등과 목 부분에 고르게 도포하였고, 도포 2~3시간 전에 4% SDS를 분무하여 피부증을 파괴하였다. 2주 후(12주령) 등 부위에 피부염이 충분히 유발되면서 긁는 행동이 심화되면 육안 평가를 실시하였다. BMAC 도포 2주 후 동시에 PGA-HM과 PGA-LM(각각 2 mg/25 g/day)을 12주부터 15주까지 3주간 오전 11시에 1회 경구 투여하였다.
7주령의 NC/Nga 생쥐를 1주일 동안 적응시키고 이미 피부염 이 발생된 18주령의 NC/Nga 생쥐와 2주 동안 동시 사육하여 항원 감작시킨 후 capillary 관을 이용하여 눈에서 100 μL의 혈액을 채혈하였다. 그 후 마취제인 chloral hydrate(10%)로 마취한 후 귀와 등쪽 목 부위를 깨끗하게 제모제로 제모한 후, 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치 하였다.
2주 후(12주령) 등 부위에 피부염이 충분히 유발되면서 긁는 행동이 심화되면 육안 평가를 실시하였다. BMAC 도포 2주 후 동시에 PGA-HM과 PGA-LM(각각 2 mg/25 g/day)을 12주부터 15주까지 3주간 오전 11시에 1회 경구 투여하였다. 또한 양성 대조 약물로 FK506 (tacrolimus) 0.
그 후 마취제인 chloral hydrate(10%)로 마취한 후 귀와 등쪽 목 부위를 깨끗하게 제모제로 제모한 후, 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치 하였다. BMAC는 주 2회 3주간(10~13주령 ) 등과 목 부분에 고르게 도포하였고, 도포 2~3시간 전에 4% SDS를 분무하여 피부증을 파괴하였다. 2주 후(12주령) 등 부위에 피부염이 충분히 유발되면서 긁는 행동이 심화되면 육안 평가를 실시하였다.
임상평가는 NC/Nga 생쥐의 피부염은 아토피성 피부염에서 일반적으로 사용되는 Dogru M[8]의 방법을 약간 변형하여 사용하였다. BMAC를 바르고 약물 투여 종료 후 15주령에서 육안평가를 실시하였다. 육안평가 항목은 소양 행동을 동반한 홍반(erythema/hemorrhage), 인설 및 가피 (dryness/scarring), 부종(edema), 표피 박탈/미란(excoriation/ erosion), 태선화(lichenification) 5가지 항목으로 하고, 육안평가 결과는 각각 평가한 점수의 총합으로 나타내었다.
NC/Nga 생쥐의 ALN을 적출하여 면역 조직화학염색을 한 후 조직에 침윤된 C* CR3 호산구 세포(strong brown color, arrow)를 광학현미경으로 관찰하였다. 그 결과 Fig.
NC/Nga 생쥐의 눈에서 8주, 12주, 15주에 각각 capillary 관을 이용하여 약 100 μL의 혈액을 채혈한 후 6, 500 rpm에서 20분 동안 원심분리한 후 30 μL의 혈청을 분리하였다. 혈청은 -70℃에 냉동 보관하였다.
NC/Nga 생쥐의 등부위의 피부조직을 적출하여 10% paraform-aldehyde에서 24시간 동안 포르말린에 고정한 후 파라핀으로 포매하였고, 5 μM 두께로 block을 만들었다. 이렇게 분리한 조직부분은 염증을 일으키는 표피(epidermis), 진피 (dermis), 각질형성세포(keratinocytes), 호중구(neutrophils)/ 호산구(eosinophil) 그 외 다른 세포와 부종을 식별하는 hematoxyline/eosin(H&E) 염색과 비 만세 포를 염 색 하는 toluidine blue 염색으로 비만세포의 침윤을 광학현미경 (Nikon, Japan, x200)으로 관찰하였다[13].
15 min, 6(TC에서 1 min 수행하였다. PGA-HM과 PGA-LM 투여군들과 대조군은 internal standard로 G3PD니를 사용하여 target group의 Quantitative PCR y=x(l+e)n, x = starting quantity, y=yield n=number of cycles e=efficiency로 계산하여 RQ(relative quantitative)를 측정하였다.
PGA-LM 투여로 아토피유발 NC/Nga 생쥐의 등피부 발진 부위에서 foxp3 mRNA 유전자 발현량이 대조군에 비하여 약 2배 이상 증가를 나타내는 것을 확인한 후, PGA-HM 과 PGA-LM이 등피부 조직에 미치는 영향을 알아보기 위하여 등피부를 적출한 후 H&E 염색과 dermis에 침윤된 비만세포(mast cell)를 관찰하기 위하여 toluidine blue 염색을 실시하였다(Fig. 5, Fig. 6). 그 결과 Fig.
사용된 foxp3 probe는 GCCACTCCAGCT- CCCGGCAACTTCT(FAM)을 사용하였으며 (probe는 Bio- systems사에서 제공되는 product임), Sper-Taqman PCR Master mix(ABI)를 사용하였고, primer의 최종 농도가 200 nN이 되 게 반응시 켰다. RT-PCR의 조건으로는 pre- denaturatioiie 50℃에서 2 min, 94℃에서 10 min, 그리고 40 cycles을 95, C에서 0.15 min, 6(TC에서 1 min 수행하였다. PGA-HM과 PGA-LM 투여군들과 대조군은 internal standard로 G3PD니를 사용하여 target group의 Quantitative PCR y=x(l+e)n, x = starting quantity, y=yield n=number of cycles e=efficiency로 계산하여 RQ(relative quantitative)를 측정하였다.
다시 2회 수세 후 완충용액으로 세척한 다음 antibody Avidin-HRP conjugated 100 μL를 처리하고 1시간 실온에서 방치한 후 다시 세척하였다. TMB 기질을 100 μL씩 분주하고 암소에서 30분 방치한 후 100 μL의 stop용액을 처리하여 ELISA reader 450nm에서 각각 IgE와 IgGl에 대한 흡광도를 측정하였다[26].
μL의 혈액을 채혈하였다. 그 후 마취제인 chloral hydrate(10%)로 마취한 후 귀와 등쪽 목 부위를 깨끗하게 제모제로 제모한 후, 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치 하였다. BMAC는 주 2회 3주간(10~13주령 ) 등과 목 부분에 고르게 도포하였고, 도포 2~3시간 전에 4% SDS를 분무하여 피부증을 파괴하였다.
등피부 조직과 axillary lymph node(ALN)에서 RNA 분리 - Atopic dermatitis-like skin NC/Nga 생쥐의 등피부 조직과 ALN를 적출하여 각각에 RNAzolB 500 mL를 넣고 용해될 때까지 homogenizer로 분쇄하였다. 이 혼합 부유액에 chloroform 50 mL를 첨가한 후 15초 동안 다시 혼합하였다.
사용된 foxp3 probe는 GCCACTCCAGCT- CCCGGCAACTTCT(FAM)을 사용하였으며 (probe는 Bio- systems사에서 제공되는 product임), Sper-Taqman PCR Master mix(ABI)를 사용하였고, primer의 최종 농도가 200 nN이 되 게 반응시 켰다. RT-PCR의 조건으로는 pre- denaturatioiie 50℃에서 2 min, 94℃에서 10 min, 그리고 40 cycles을 95, C에서 0.
이러한 y-pga의 아토피발진 억제 효과를 알아보고자 NC/Nga 생쥐를 사용하여 in vivo 실험을 하였다. BMAC로 유도된 NC/Nga 아토피 피부발진 생쥐에 분자량 300 kDa인 Y-PGA(PGA-HM:와 이를 저분자화 시킨 저분자 Y-PGA(PGA-LM)을 경구 투여한 결과 PGA-LM 투여군에서 clinical skin severity score가 유의성 있게 감소하였다.
이렇게 분리한 조직부분은 염증을 일으키는 표피(epidermis), 진피 (dermis), 각질형성세포(keratinocytes), 호중구(neutrophils)/ 호산구(eosinophil) 그 외 다른 세포와 부종을 식별하는 hematoxyline/eosin(H&E) 염색과 비 만세 포를 염 색 하는 toluidine blue 염색으로 비만세포의 침윤을 광학현미경 (Nikon, Japan, x200)으로 관찰하였다[13].
이러한 결과는 NC/Nga 생쥐에 PGA-LM 투여로 CD4+CD25+foxp3+ Treg 세포가 유도되어 Treg 세포에 의한 Th2 세포의 면역조절 작용으로 IL-5의 분비가 억제되어 CCR3+세포의 증식과 활성화가 억제되어 아토피 피부발진의 완화를 가져오는 것으로 생각된다[2]. 이상의 결과로 아토피 피부염을 유발한 NC/Nga 생쥐에서 PGA-HM과 PGA-LM을 경구투여한 후 면역글로블린 측정, 면역조직화학분석 및 foxp3+ mRNA 유전자 발현 측정 등을 분석하였다. 그 결과 PGA-HM보다 PGA-LM이 아토피 피부발진 NC/Nga 생쥐 모델에서 Treg를 유도하여 IgE 및 염증 사이토카인의 생산 및 CCR3+ 호산구의 증식과 활성화가 억제되어 아토피조절 효과를 나타내는 것으로 생각되었다.
3%를 매주 5회 발진된 등 부위에 도포하였다. 임상평가는 NC/Nga 생쥐의 피부염은 아토피성 피부염에서 일반적으로 사용되는 Dogru M[8]의 방법을 약간 변형하여 사용하였다. BMAC를 바르고 약물 투여 종료 후 15주령에서 육안평가를 실시하였다.
전보(in vitro)[15]에서는 NC/Nga 생쥐의 비장에서 B 세포와 T 세포를 순수 분리하여 항알레르기 작용에 대한 실험을 실시하였다. 그 결과 PGA-HM과 PGA-LMe IL-1& Ⅱ.
0)를 이용해 microwave oven에 15분 동안 전 처리하였다. 조직내 과산화호소의 작용을 억제하기 위하여 3% H2O2에 10분 동안 처리한 후, 조직 내의 항원과 비특이적 단백질결합을 억제하기 위해 정상 혈청으로 단백질을 차단시켰다. 그리고 일차 단일항체에 1시간 동안 부착시킨 다음 완충액으로 수세하였다.
증류수(distilled water)에 PGA-HM을 10%(w/v)가 되도록 녹여 sonicator(Branson사)에 60분간 high level(40 kl0로 sonication하예35] 분자량 30 kDa 이하 분리 가능한 밀리포어 필터로 여과하여 여과액을 deep iieezer에서 24 hr 동안 냉동시킨 후 freeze dryer(Ilshin사)에 넣어 3~4일 동결 건조하고 결정화시켜 사용하였다.
1% tween 20함유 Trisbuffered saline(TBST)용액으로 수세한 후 잘 건조하였다. 현미경은 형광위상차현미경을 사용하여 X400 배율로 관찰하였다 [18].
대상 데이터
3%를 등 부위에 도포하였고[40], 실험군에는 PGA-HM과 PGA-LM을매일 2 mg/25 g/day의 농도로 경구 투여한 후 4주 후 피부염 지수를 측정하였다. Fig. 2A는 12주령 이 된 NC/Nga 생쥐의 등부위를 깨끗하게 제모한 사진이며 , Fig. 2B는 제모한 후 BMAC를 1주간 도포한 후 사진으로 가피가 모두 벗겨지고 피부 염증이 나타나기 시작하였다. BMAC를 3주간 도포한 결과 피부염과 긁는 행동이 심화되었다.
5% tween 20이 포함된 ointment base로 제작된 것을 사용하였다(Biostir, Hiroshima, Japan). IgE, IgGl ELISA kit는 Shibayagi사(Shibukawa, Japan)제품, r-PGA는 바이웰(주)에서 구입하였으며 평균 분자량은 300 kDa이다. CD4+ T isolation kit는 MACS(Mill.
Japan)사에서 공급받았다. 각 실험군마다 6마리씩 사용하였다. BMAC는 Dermatophagoides farinae crude extract (mite antigen, lyophilized)를 진드기 항원으로 제조된 것으로 진드기 항원을 0.
모든 NC/Nga 생쥐는 15주령에서 면역화학조직염색을 위하여 ALN을 적출하여 10% 포르말린 용액에 고정한 후 파라핀 블룩을 만든 후 rat anti-mouse CCR3 mAh를 사용하였다. 조직절편을 4 μM 두께로 세절한 후 probe-on plus slide에 부착시켜 건조시켰다.
실험에 사용된 동물은 수컷 7주령의 SPF(specific pathogen- free) NC/Nga mouse(15~20 g)로 Charles River Japan (Yokohama, Japan)사에서 공급받았다. 각 실험군마다 6마리씩 사용하였다.
데이터처리
Each point represents the mean±SE of 6 mice. Statistically significant values compared with the BMAC-Control group data were analyzed by Student's /-test (*p*<0.01, *p*v*0.001).
Each point represents mean ± SE of 6 mice. Statistically significant values compared with the BMAC-Control group were analyzed by Student's Z-test (**p<0.05, **pv0.01, ***p<0.001).
다양한 실험으로부터 얻은 결과는 mean ± standard error로 기록하였고, 유의성 검증은 Student's t-est분석방법을 이용하여 결정하였다.
이론/모형
혈청은 -70℃에 냉동 보관하였다. NC/Nga 생쥐의 혈청내 IgE와 IgGl 농도 즉정은 Enzyme-linked immuno-sorbent assay kit(Shibayagi, Japan)로 측정하였다. 각 well에 NC/ Nga 생쥐에서 채혈한 혈청 5 μL(l/10 dilution)와 dilution buffer 45 μL를 혼합하여 각 well에 분주하고, 2시간 동안 25℃ 실온에서 방치한 후 2회 washing 완충용액으로 세척한 다음 antibody biotin-corjugated를 넣고 2시간 방치하였다.
Quantitative real-time PCR(RT-PCR) - Real time quantitative PCR(RT-PCR)[24]은 Applied Biosystems 7500 Real- Time PCR system(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였다. 사용된 foxp3 probe는 GCCACTCCAGCT- CCCGGCAACTTCT(FAM)을 사용하였으며 (probe는 Bio- systems사에서 제공되는 product임), Sper-Taqman PCR Master mix(ABI)를 사용하였고, primer의 최종 농도가 200 nN이 되 게 반응시 켰다.
성능/효과
이러한 y-pga의 아토피발진 억제 효과를 알아보고자 NC/Nga 생쥐를 사용하여 in vivo 실험을 하였다. BMAC로 유도된 NC/Nga 아토피 피부발진 생쥐에 분자량 300 kDa인 Y-PGA(PGA-HM:와 이를 저분자화 시킨 저분자 Y-PGA(PGA-LM)을 경구 투여한 결과 PGA-LM 투여군에서 clinical skin severity score가 유의성 있게 감소하였다. 혈청 IgE 수준은 PGA-LM이 대조군에 비하여 유의적으로 감소하였고, 혈청 IgGl 수준은 대조군에 비하여 감소하였으나 두군 모두 유의성 이 없었다.
2B는 제모한 후 BMAC를 1주간 도포한 후 사진으로 가피가 모두 벗겨지고 피부 염증이 나타나기 시작하였다. BMAC를 3주간 도포한 결과 피부염과 긁는 행동이 심화되었다. Fig.
6B, arrow)의 침윤 등이 정상군에 비하여 현저하게 증가되었다[11]. BMAC를 도포하여 아토피 피부발진을 유도한 NC/Nga 생쥐에 양성대조군으로 FK506 0.3%를 피부발진 부위에 도포한 Fig. 5C와 Fig. 6C는 대조군에 비하여 정상군에 가깝게 epidermis의 두께 (arrow)가 줄어들었고, 그 주변에 hyperkeratosis, acanthosis, hypergranulosis 그리고 비만세포(Fig. 6C, arrow)의 침윤이 현저하게 감소하였다. 그러나 Fig.
혈청 IgE 수준은 PGA-LM이 대조군에 비하여 유의적으로 감소하였고, 혈청 IgGl 수준은 대조군에 비하여 감소하였으나 두군 모두 유의성 이 없었다. CD4+CD25+foxp3+ Treg 세포가 유도되는 것을 확인하기 위하여 , PGA-HM와 PGA-LM를 투여한 NC/Nga 아토피 피부발진 생쥐의 등 부위에서 mRNA를 분리하여 real-time PCR로 foxp3 mRNA 유전자 발현량을 측정한 결과는 대조군에 비하여 PGA-LM 투여군이 약 2배 이상 증가를 나타내었다. 또한 등피부 조직의 조직검사에서도 epidermis의 두께, 비만세포 침윤, 그리고 CCR3+ 세포 수 등이 대조군에 비하여 현저히 억제됨을 관찰할 수 있었다.
Fig. 2E는 보는 바와 같이 BMAC를 NC/Nga mouse에 3 주간 도포하고 최종 5주 후 등피부에 나타난 소양행동을 동반한 홍반, 부종, 인설, 가피 , 태선화 등의 단계를 0(none), 1 (mild), 2(moderate), 3(severe)로 개체마다 평가 기록하여 피부발진 점수로 평가한 결과 대조군의 skin clinical score는 5.8±0.85로 BMAC를 도포하지 않은 정상군(NC/Nga-WT)의 0.3±0.25에 비하여 5배 이상 skin clinical score 값이 증가하였고, FK506 0.3% 도포군은 1 ±0.415. 대조군에 비해 4배 이상 유의성 있게 감소하였다(p<0.
6D, arrow)의 침윤 등이 대조군과 차이가 없었다. Fig. 5E와 Fig. 6E는 PGA-LM을 3주간 투여한 결과로, 대조군에 비하여 epidermis의 두께가 현저하게 줄었고, hyperkeratosis, acanthosis, hypergranulosis 그리고 비만세포(Fig. 6E, arrow) 의 침윤 등이 감소하였다.
6). 그 결과 Fig. 5A와 Fig. 6A는 SPF 조건에서 사육한 15주령의 정상 NC/Nga 생쥐의 피부조직으로 epidermis가 얇게 분포하고 비만세포는 거의 관찰이 안 되는 것을 알 수 있다. 그러나 Fig.
광학현미경으로 관찰하였다. 그 결과 Fig. 7에서 보듯이 BMAC를 도포하지 않은 정상 NC/Nga 생쥐군(Fig. 7A)<H] 비하여 대조군(Fig. 7B)의 ALN에서 CCR3+ 호산구 세포들이 ALN 조직사이에 침윤되어 현저하게 증가하였다. 또한 0.
이상의 결과로 아토피 피부염을 유발한 NC/Nga 생쥐에서 PGA-HM과 PGA-LM을 경구투여한 후 면역글로블린 측정, 면역조직화학분석 및 foxp3+ mRNA 유전자 발현 측정 등을 분석하였다. 그 결과 PGA-HM보다 PGA-LM이 아토피 피부발진 NC/Nga 생쥐 모델에서 Treg를 유도하여 IgE 및 염증 사이토카인의 생산 및 CCR3+ 호산구의 증식과 활성화가 억제되어 아토피조절 효과를 나타내는 것으로 생각되었다. Selliah 등[41]의 연구결과를 보면 in vzTro에서 고분자 물질보다 저분자 물질을 투입했을 때 자극받은 T 세포의 anti- CD3 mAb가 눈에 띄게 증가하였다.
4). 그 결과 대조군에 대한 foxp3 mRNA의 유전자발현의 상대 정량 값(RQ)은 BMAC를 도포하지 않은 정상 NC/Nga 생쥐군 0.612±0.064에 비하여 대조군 0.992±0.021, FK506 0.3% 도포군 0.991±0.083, PGA-HM 투여군 0.991±0.083으로 차이가 나타나지 않았으나 PGA-LMe foxp3 mRNA 유전자 발현의 RQ값이 2.284±0.221로 대조군에 비하여 약 2배 이상 유의성 있게 증가하였다(p<0.001).
6C, arrow)의 침윤이 현저하게 감소하였다. 그러나 Fig. 5D와 Fig. 6D는 BMAC를 NC/Nga 생쥐의 등 부위에 도포하여 아토피 피부발진을 유도한 NC/Nga 생쥐모델에 PGA-HM을 3주간 경구 투여한 결과로, 대조군에 비하여 epidermis의 두께가 약간 줄어들었으나, epidermis의 두께(arrow)와 그 주변에 hyperkeratosis, acanthosis, hypergranulosis 그리고 비만세포 (Fig. 6D, arrow)의 침윤 등이 대조군과 차이가 없었다. Fig.
3Qig/mL)과 큰 차이 없이 증가되었다. 그리고 3주간 FK506과 PGA-HM과 PGA-LM을 투여한 양성대조군과 실험군들은 12주 이후 감소하여 15주에는 대조군에 비하여 FK506은 201.3±2.2(μg/mL)를, PGA-LM 투여군은 232.9±16.1(μg/mL)로 혈장내 IgE 수준이 유의성 있게 감소하였다(p<0.05, p<0.01). PGA-HMe 265.
-10, mRNA 유전자 발현을 증가시켜 염증유전자 발현을 억제하였다. 그리고 IFN-Y+의 증가 및 조절 T 세포가 증가하는 결과를 얻었다.
3%의 FK506을 도포한 것으로 대조군에 비하여 현저하게 피부 발진이 줄어 정상군에 가깝게 억제되었다. 또한 Fig. 2D는 PGA-LM을 12주부터 15주간 경구 투여한 실험군은 대조군에 비하여 긁는 행동 및 피부염 또한 현저하게 감소하였다. 그러나 PGA-HMe 상대적으로 긁는 행동은 감소하였지만 피부염은 크게 감소하지 않았다(Data not shown).
001). 또한 PGA-LM을 투여한 실험군도 3.2±0.기로 대조군에 비해 2배 이상 유의성 있게 감소하였다(p<0.05). 그러나 PGA-HM 투여군은 5.
01). 또한 PGA-LM투여군은 대조군에 비해 IgGl 수준이 통계학적으로 유의성 없는 감소가 나타났다. PGA-HMe 대조군과 차이가 없었다.
CD4+CD25+foxp3+ Treg 세포가 유도되는 것을 확인하기 위하여 , PGA-HM와 PGA-LM를 투여한 NC/Nga 아토피 피부발진 생쥐의 등 부위에서 mRNA를 분리하여 real-time PCR로 foxp3 mRNA 유전자 발현량을 측정한 결과는 대조군에 비하여 PGA-LM 투여군이 약 2배 이상 증가를 나타내었다. 또한 등피부 조직의 조직검사에서도 epidermis의 두께, 비만세포 침윤, 그리고 CCR3+ 세포 수 등이 대조군에 비하여 현저히 억제됨을 관찰할 수 있었다. 이상의 결과로 PGA-HM보다 PGA-LM이 BMAC로아토피 피부염이 유발된 NC/Nga 생쥐에 CD4+CD25+foxp3+ Treg 세포를 활성화하여 IgE 및 염증 사이토카인의 생산 및 CCR3+ 호산구의 활성화가 억제되어 아토피조절 효과를 나타내는 것으로 사료되었다.
항아토피 효과가 있다고 보고하였다. 본 실험의 결과도 PGA-HM보다 PGA-LM이 아토피 피부염의 관능평과와 더불어 IgE의 발현도 유의적인 효과를 나타내었다. 이는 PGA-LM이 IgE 매개형 아토피 피부염에 효과적일 것이라 생각된다.
본 연구결과는 PGA-LM를 투여한 실험군에서 foxp3 mRNA의 유전자발현의 RQ값이 대조군에 비하여 약 2배 이상 유의성 있게 증가하였다. 이는 PGA-LM에 의하여 유도된 Treg 세포가 피부발진부위로 recruitment되어 Th2 세포, 호산구세포, 비만세포, 그리고 염증세포의 증식 및 활성을 억제하여 피부발진이 감소한 결과를 가져온 것으로 생각된다.
또한 등피부 조직의 조직검사에서도 epidermis의 두께, 비만세포 침윤, 그리고 CCR3+ 세포 수 등이 대조군에 비하여 현저히 억제됨을 관찰할 수 있었다. 이상의 결과로 PGA-HM보다 PGA-LM이 BMAC로아토피 피부염이 유발된 NC/Nga 생쥐에 CD4+CD25+foxp3+ Treg 세포를 활성화하여 IgE 및 염증 사이토카인의 생산 및 CCR3+ 호산구의 활성화가 억제되어 아토피조절 효과를 나타내는 것으로 사료되었다.
BMAC로 유도된 NC/Nga 아토피 피부발진 생쥐에 분자량 300 kDa인 Y-PGA(PGA-HM:와 이를 저분자화 시킨 저분자 Y-PGA(PGA-LM)을 경구 투여한 결과 PGA-LM 투여군에서 clinical skin severity score가 유의성 있게 감소하였다. 혈청 IgE 수준은 PGA-LM이 대조군에 비하여 유의적으로 감소하였고, 혈청 IgGl 수준은 대조군에 비하여 감소하였으나 두군 모두 유의성 이 없었다. CD4+CD25+foxp3+ Treg 세포가 유도되는 것을 확인하기 위하여 , PGA-HM와 PGA-LM를 투여한 NC/Nga 아토피 피부발진 생쥐의 등 부위에서 mRNA를 분리하여 real-time PCR로 foxp3 mRNA 유전자 발현량을 측정한 결과는 대조군에 비하여 PGA-LM 투여군이 약 2배 이상 증가를 나타내었다.
후속연구
이는 PGA-LM에 의하여 유도된 Treg 세포가 피부발진부위로 recruitment되어 Th2 세포, 호산구세포, 비만세포, 그리고 염증세포의 증식 및 활성을 억제하여 피부발진이 감소한 결과를 가져온 것으로 생각된다. 그러나 PGA-LM이 Treg 세포를 활성화시키는데 있어서 NFAT와 Smad3의 시너지 작용에 의한 기전인지는 더 연구가 필요하다고 생각된다.
참고문헌 (55)
Aversa, G., J. Punnonen, B. G. Cocks, R. de Waal Malefyt, F. Vega, S. M. Jr., Zurawski, G. Zurawski, and J. E. de Vries. 1993. An interleukin 4 (IL-4) mutant protein inhibits both IL-4 or IL-13-induced human immunoglobulin G4 (IgG4) and IgE synthesis and B cell proliferation: support for a common component shared by IL-4 and IL-13 receptors. J. Exp. Med. 178: 2213-2218.
Bordi, F., C. Cametti, and G. Paradossi. 1996. A comparative study of the high-frequency dielectric properties of poly (alpha-glutamate) and poly (gamma-glutamate) aqueous solutions. Biopolymers 40: 485-494.
Brunkow, M. E., E. W. Jeffery, K. A. Hjerrild, B. Paeper, L. B. Clark, S. A. Yasayko, J. E. Wilkinson, D. Galas, S. F. Ziegler, and F. Ramsdell. 2001. Disruption of a new forkhead/winged-helix protein, scurfin, results in the fatal lymphoproliferative disorder of the scurfy mouse. Nat Genet. 27: 68-73.
Dieckmann, D., C. H. Bruett, H. Ploettner, M. B. Lutz, and G. Schuler. 2002. Human CD4(+)CD25(+) regulatory, contact-dependent T cells induce interleukin 10-producing, contact-independent type 1-like regulatory T cells [corrected]. J. Exp. Med. 196: 247-253.
Ferrick, D. A., M. D. Schrenzel, T. Mulvania, B. Hsieh, W. G. Ferlin, and H. Lepper. 1995. Differential production of interferon-gamma and interleukin-4 in response to Th1- and Th2-stimulating pathogens by gamma delta T cells in vivo. Nature 373: 255-257.
Gutermuth, J., M. Ollert, J. Ring, H. Behrendt, and T. Jakob. 2004. Mouse models of atopic eczema critically evaluated. Int. Arch. Allergy Immunol. 135: 262-276.
Hahm, J. H., T. Y. Lee, J. S. Lee, C. Park, M. H. Sung, and H. Poo. 2004. Antitumor effect of Poly-γ-glutamic acid by modulating cytokine production and NK cell activity. International Meeting of the Federation of Korean Microbiological Societies, p. 21-22.
Hashimoto, Y., I. Arai, Y. Nakanishi, T. Sakurai, A. Nakamura, and S. Nakaike. 2004. Scratching of their skin by NC/Nga mice leads to development of dermatitis. Life Sci. 76: 783-794.
Jang, S. N., K. L. Kim,, S. M. Kang. 2009. Effects of PGA-LM on CD4+/CD25+/foxp3+ Treg cell activation in isolated CD4+ T cells in NC/Nga mice. Kor. J. Microbiol. Biotechnol. 37: 160-169.
Johrens, K., I. Anagnostopoulos, H. Durkop, and H. Stein. 2006. Different T-bet expression patterns characterize particular reactive lymphoid tissue lesions. Histopathology. 48: 343-352.
Kondo, E. and K. Yamada. 1957. End results of focal debridement in bone and joint tuberculosis and its indications. J. Bone Joint Surg. Am. 39-A: 27-31.
Kotani, M., M. Matsumoto, A. Fujita, S. Higa, W. Wang, M. Suemura, T. Kishimoto, and T. Tanaka. 2000. Persimmon leaf extract and astragalin inhibit development of dermatitis and IgE elevation in NC/Nga mice. J. Allergy Clin. Immunol. 106: 159-166.
Kuhn, J. and S. Binder. 2002. RT-PCR analysis of 5' to 3'- end-ligated mRNAs identifies the extremities of cox2 transcripts in pea mitochondria. Nucleic Acids Res. 30: 439-446.
Lee, J. S., H. Poo, C. J. Kim, Y. H. Choi, C. Park, T. Y. Lee. and M. H. Sung. 2004. Effect of poly-gamma-glutamic acid as an adjuvant and immune response stimulatory factor in vitro and in vivo. The 16th Annual Meeting of the Korean Society for Molecular and Cellular Biology, pp. 14-15.
Leung, D. Y. 2000. Atopic dermatitis: new insights and opportunities for therapeutic intervention. J. Allergy Clin. Immunol. 105: 860-876.
Liu, J., J. D. Farmer, W. S. Jr., Lane, J. Friedman, I. Weissman, and S. L. Schreiber. 1991. Calcineurin is a common target of cyclophilin-cyclosporin A and FKBP-FK506 complexes. Cell 66: 807-815.
Loser, K., W. Hansen, J. Apelt, S. Balkow, J. Buer, and S. Beissert. 2005. In vitro-generated regulatory T cells induced by Foxp3-retrovirus infection control murine contact allergy and systemic autoimmunity. Gene Ther. 12: 1294-1304.
Matsuda, H., N. Watanabe, G. P. Geba, J. Sperl, M. Tsudzuki, J. Hiroi, M. Matsumoto, H. Ushio, S. Saito, P. W. Askenase, and C. Ra. 1997. Development of atopic dermatitis-like skin lesion with IgE hyperproduction in NC/Nga mice. Int. Immunol. 9: 461-466.
Matsumoto, M., M. Kotani, A. Fujita, S. Higa, T. Kishimoto, M. Suemura, and T. Tanaka. 2002. Oral administration of persimmon leaf extract ameliorates skin symptoms and transepidermal water loss in atopic dermatitis model mice, NC/Nga. Br. J. Dermatol. 146: 221-227.
Matsumoto, M., C. Ra, K. Kawamoto, H. Sato, A. Itakura, J. Sawada, H. Ushio, H. Suto, K. Mitsuishi, Y. Hikasa, and H. Matsuda. 1999. IgE hyperproduction through enhanced tyrosine phosphorylation of Janus kinase 3 in NC/Nga mice, a model for human atopic dermatitis. J. Immunol. 162: 1056-1063.
Miyamoto, K., S. Miyake, and T. Yamamura. 2001. A synthetic glycolipid prevents autoimmune encephalomyelitis by inducing TH2 bias of natural killer T cells. Nature 413: 531-534.
Montagne, A., O. Grepinet, M. Peloille, F. Lantier, and A. C. Lalmanach. 2001. Quantification of ovine cytokine gene expression by a competitive RT-PCR method. J. Immunol. Methods. 253: 83-93.
Nakamura, K., A. Kitani, and W. Strober. 2001. Cell contactdependent immunosuppression by CD4(+)CD25(+) regulatory T cells is mediated by cell surface-bound transforming growth factor beta. J. Exp. Med. 194: 629-644.
O'Keefe, S. J., J. Tamura, R. L. Kincaid, M. J. Tocci, and E. A. O'Neill. 1992. FK-506 and CsA-sensitive activation of the interleukin-2 promoter by calcineurin. Nature 357: 692-694.
Perez-Camero, G., F. Congregado, J. J. Bou, and S. Munoz- Guerra. 1999. Biosynthesis and ultrasonic degradation of bacterial poly(gamma-glutamic acid). Biotechnol. Bioeng. 63: 110-115.
Piccirillo, C. A., J. J. Letterio, A. M. Thornton, R. S. McHugh, M. Mamura, H. Mizuhara, and E. M. Shevach. 2002. CD4(+)CD25(+) regulatory T cells can mediate suppressor function in the absence of transforming growth factor beta1 production and responsiveness. J. Exp. Med. 196: 237-246.
Robinson, D. S., Q. Hamid, S. Ying, A. Tsicopoulos, J. Barkans, A. M. Bentley, C. Corrigan, S. R. Durham, and A. B. Kay. 1992. Predominant TH2-like bronchoalveolar Tlymphocyte population in atopic asthma. N. Engl. J. Med. 326: 298-304.
Rousset, F., J. Robert, M. Andary, J. P. Bonnin, G. Souillet, I. Chretien, F. Briere, J. Pene, and J. E. de Vries. 1991. Shifts in interleukin-4 and interferon-gamma production by T cells of patients with elevated serum IgE levels and the modulatory effects of these lymphokines on spontaneous IgE synthesis. J. Allergy Clin. Immunol. 87: 58-69.
Sasakawa, T., Y. Higashi, S. Sakuma, Y. Hirayama, Y. Sasakawa, Y. Ohkubo, and S. Mutoh. 2004. Topical application ofFK506 (tacrolimus) ointment inhibits mite antigeninduced dermatitis by local action in NC/Nga mice. Int. Arch. Allergy Immunol. 133: 55-63.
Selliah, N., W. H. Brooks, and T. L. Roszman. 1996. Proteolytic cleavage of alpha-actinin by calpain in T cells stimulated with anti-CD3 monoclonal antibody. J. Immunol. 156: 3215-3221.
Shih, I. L. and Y. T. Van. 2001. The production of poly- (gamma-glutamic acid) from microorganisms and its various applications. Bioresour. Technol. 79: 207-225.
Takakura, M., F. Takeshita, M. Aihara, K. Q. Xin, M. Ichino, K. Okuda, and Z. Ikezawa. 2005. Hyperproduction of IFNgamma by CpG oligodeoxynucleotide-induced exacerbation of atopic dermatitis-like skin lesion in some NC/Nga mice. J. Invest. Dermatol. 125: 1156-1162.
Takano, N., I. Arai, and M. Kurachi. 2006. A method to induce stable atopic dermatitis-like symptoms in NC/Nga mice housed with skin-lesioned mice. Br. J. Dermatol. 154: 426-430.
Tanaka, A., S. Muto, K. Jung, A. Itai, and H. Matsuda. 2007. Topical application with a new NF-kappaB inhibitor improves atopic dermatitis in NC/NgaTnd mice. J. Invest. Dermatol. 127: 855-863.
Taniguchi, Y., K. Kohno, S. Inoue, S. Koya-Miyata, I. Okamoto, N. Arai, K. Iwaki, M. Ikeda, and M. Kurimoto. 2003. Oral administration of royal jelly inhibits the development of atopic dermatitis-like skin lesions in NC/Nga mice. Int. Immunopharmacol. 3: 1313-1324.
Tone, Y., K. Furuuchi, Y. Kojima, M. L. Tykocinski, M. I. Greene, and M. Tone. 2008. Smad3 and NFAT cooperate to induce Foxp3 expression through its enhancer. Nat. Immunol. 9: 194-202.
Van der Kleij, H. P., A. D. Kraneveld, A. H. van Houwelingen, M. Kool, A. C. Weitenberg, F. A. Redegeld, and F. P. Nijkamp. 2004. Murine model for non-IgEmediated asthma. Inflammation 28: 115-125.
Vestergaard, C., H. Yoneyama, M. Murai, K. Nakamura, K. Tamaki, Y. Terashima, T. Imai, O. Yoshie, T. Irimura, H. Mizutani, and K. Matsushima. 1999. Overproduction of Th2-specific chemokines in NC/Nga mice exhibiting atopic dermatitis-like lesions. J. Clin. Invest. 104: 1097-1105.
Wang, G., T. Savinko, H. Wolff, M. C. Dieu-Nosjean, L. Kemeny, B. Homey, A. I. Lauerma, and H. Alenius. 2007. Repeated epicutaneous exposures to ovalbumin progressively induce atopic dermatitis-like skin lesions in mice. Clin. Exp. Allergy 37: 151-161.
Watanabe, A., H. Mishima, P. M. Renzi, L. J. Xu, Q. Hamid, and J. G. Martin. 1995. Transfer of allergic airway responses with antigen-primed CD4+ but not CD8+ T cells in brown Norway rats. J. Clin. Invest. 96: 1303-1310.
Yawalkar, N., M. Uguccioni, J. Scharer, J. Braunwalder, S. Karlen, B. Dewald, L. R. Braathen, and M. Baggiolini. 1999. Enhanced expression of eotaxin and CCR3 in atopic dermatitis. J. Invest. Dermatol. 113: 43-48.
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