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문제 정의
- 본 연구에서는 산사자의 유용 생리활성 검토를 위한 연구의 일환으로, 산사자의 methanol 추출물 및 이의 다양한 분획물을 조제하여 다양한 병원성 및 식중독 미생물에 대한 항균 활성을 평가하였으며, 그 결과 산사자 추출물의 ethylacetate 및 butanol 분획에서 우수한 항미생물성 활성을 확인하였고, 특히 이 분획물들이 항생제 내성 병원성 Pseudomonas aeruginosa6^ 대해 강력한 항균 활성을 나타냄을 확인하였다. 본 연구결과는 산사자를 이용한 항생제 내성 병원성 P.
- 본 연구결과는 산사자를 이용한 항생제 내성 병원성 P. aeruginosa 및 Candida sp의 제어가능성을 제시하고 있다.
- 중 하나이다. 본 연구에서는 산사자의 유용 생리활성 검토를 위한 연구의 일환으로, 산사자의 methanol 추출물 및 이의 n-hexane, ethylacetate, butanol 분획물 및 물 잔류물을 조제하여 항생제 다제내성 Pseudomonas aeruginosa 및 Candida sp를 포함하는 다양한 병원성 및 식중독 미생물에 대한 항균활성을 평가하였다. 산사자의 methanol 추출물은 그람 양성 및 음성의 다양한 세균에 대해 항균활성을 나타내었고, 이의 분획물 중 ethylacetate 및 butanol 분획물은 Listeria monocytogenese Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureuse Bacillus subtilis, Salmonella typhimuriume Proteus vulgaris, Escherichia ci는 물론 10종의 항생제 내성 병원성 Pseudomonas aeruginosae 대해서도 우수한항세균 활성을 나타내었다(최소생육억제농도 1.
제안 방법
- w/w)를 사용하였다. 산사자 methanol 추출물의 조제는 시료 1 k methanol 10리터를 가하여 24시간 상온 추출하였으며 3회 반복 추출하였다. 추출액은 50에서 감압 농축하여 분말로 제조하고 사용 전까지 저온 밀봉 보관하였다.
- 2)로 거른 후 감압 건조하여 분말화 하였다. 각각의 시료는 dimethylsulfoxide(DMSO)에 녹인 후 적당한 농도로 희석하여 항균 활성 평가에 사용하였다.
- 항세균 및 항진균 활성 평가는 기존의 보고한 방법 [13, 26] 과 동일하게 이용하였으며, 각각 Nutrient agar(Difco Co., USA) 및 Sabouraud dextrose(Difco Co. USA) 배지 상에서 다양한 시료 5 pL를 멸균 disc-paper(지름 6.5 mm)에 가한후 세균의 경우 24시간, 진균의 경우 48시간 배양 후, 생육 저 지환의 크기를 측정하여 평가하였다[26]. 대조구로는 항세균제 인 ampicillin및 streptomycin sulfate와 항진균제 인 miconazole 및 amphotericin B(Sigma Co.
- 5 mm)에 가한후 세균의 경우 24시간, 진균의 경우 48시간 배양 후, 생육 저 지환의 크기를 측정하여 평가하였다[26]. 대조구로는 항세균제 인 ampicillin및 streptomycin sulfate와 항진균제 인 miconazole 및 amphotericin B(Sigma Co., USA)를 각각 1 |ig/disc 농도로 사용하였으며, 육안으로 생육저지환의 지름을 mm 단위로 측정하였고 3회 이상 평가 후 대표 결과로 나타내었다[13]. 항균 활성이 인정되는 시료는 최소생육 억제농도(MIC: minimal inhibitory concentration)를 측정하였으며, 0.
- , USA)를 각각 1 |ig/disc 농도로 사용하였으며, 육안으로 생육저지환의 지름을 mm 단위로 측정하였고 3회 이상 평가 후 대표 결과로 나타내었다[13]. 항균 활성이 인정되는 시료는 최소생육 억제농도(MIC: minimal inhibitory concentration)를 측정하였으며, 0. 0.
- 5. 2.5, 5.0 및 7.5 mg/mL 농도의 시료들을 처리하여 24~48시간 배양한 후 생육억제를 육안판정하여 결정하였다.
- 산사자 추출물 및 분획물들의 안전성 평가의 일환으로 인간 적혈구(4%)를 이용하여 용혈 활성을 평가하였다[27]. PBS 로 3회 수세한 인간 적혈구 100를 96-well micro plate에 가하고 시료용액 100 μI를 가한 다음 37에서 30분간 반응시켰다.
- 산사자의 methanol 추출물과 이의 순차적 유기용매 분획물을 조제하였다. 산사자의 methanol 추출효율은 40.
- 다양한 식중독 및 병원성 세균들에 대한 항세균 활성을 평가하기 위해 준비된 시료들을 500 μg/disc 농도로 처리하였다. 그 결과, 산사자 methanol 주줄물은 P.
대상 데이터
- 2007년 경북 안동에서 구입한 국내산 산사자(수분함량 18% w/w)를 사용하였다. 산사자 methanol 추출물의 조제는 시료 1 k methanol 10리터를 가하여 24시간 상온 추출하였으며 3회 반복 추출하였다.
- 산사자 methanol 추출물 및 이의 분획물들의 항균 활성평가에 사용한 세균 및 진균들은 한국미생물자원센터 (KCTC), 한국농용미생물보존센터 (KACC) 및 일본 Institute for Fermentation, Osaka(IFO)에서 분양 받아 사용하였다(Table 1). P.
- 이후, 반응액을 10분간 원심분리(1,500 rpm)하여 상등액 100 |1L를 새로운 microtiter plate로 옮긴 후 용혈에 따른 헤모글로빈 유출 정도를 414 nm에서 측정하였다. 시료의 용매 대조구로는 DMSO(2%), 실험 대조구로는 triton X- 100(0.1%)을 사용하였다. 용혈활성은 다음의 수식을 이용하여 계산하였다.
이론/모형
- 총 flavonoid의 함량 측정은 Davis 방법의 변법 [13]에 따라 측정하였으며 표준시 약으로는 rutin을 사용하였다. 총 polyphenol 함량은 Singleton 등의 방법 [25]에 따라 측정 하였으며, 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다.
- 총 polyphenol 함량은 Singleton 등의 방법 [25]에 따라 측정 하였으며, 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. 모든 결과는 3회 반복 측정 후 평균값으로 나타내었다.
성능/효과
- 조제하였다. 산사자의 methanol 추출효율은 40.4±1.1% 이었으며, 주출물에 대한 n-hexane, ethylacetate, butanol 및 물 잔류물의 분획 효율은 각각 1.0, 5.1, 20.9 및 72.2%로 산사자 추출물의 대부분은 butanol 분획 및 물 잔류물로 이행되었다. 산사자 추출물 및 분획물의 총 polyphenol 함량은 methanol 주줄물 및 n-hexane, ethylacetate, butanol 및 물 잔류물에서 각각 7.
- 2%로 산사자 추출물의 대부분은 butanol 분획 및 물 잔류물로 이행되었다. 산사자 추출물 및 분획물의 총 polyphenol 함량은 methanol 주줄물 및 n-hexane, ethylacetate, butanol 및 물 잔류물에서 각각 7.17, 1.33, 22.99, 14.62 및 0.78 mg/g로나타나ethylacetate 및 butanol 분획이 대부분의 polyphenol 류들을 포함하고 있었다. 또한 총 flavonoid 함량은 추출물 및 분획물에서 각각 8.
- 78 mg/g로나타나ethylacetate 및 butanol 분획이 대부분의 polyphenol 류들을 포함하고 있었다. 또한 총 flavonoid 함량은 추출물 및 분획물에서 각각 8.02, 15.97, 52.43, 20.61 및 4.03 mg/ g을 포함하여 ethylacetate 분획, butanol 분획, n-hexane 분획 순£로 flavonoid류들을 포함하고 있음을 알 수 있었다.
- 그 결과, 산사자 methanol 주줄물은 P. aeruginosae- E. coli를 제외한 모든 균에 대해 전반적으로 우수한 활성을 나타내었다(Table 2). 특히 알러지상 식중독균인 P.
- coli를 제외한 모든 균에 대해 전반적으로 우수한 활성을 나타내었다(Table 2). 특히 알러지상 식중독균인 P. vulgaris 에대해서는 생육억제환의 크기가 17 mm로 매우 강력한 항균 활성을 나타내었다. 분획물 시료에서는 ethylacetate 분획물이 실험에 이용된 세균 모두에 대해 항균 활성을 나타내었으며, P.
- vulgaris 에대해서는 생육억제환의 크기가 17 mm로 매우 강력한 항균 활성을 나타내었다. 분획물 시료에서는 ethylacetate 분획물이 실험에 이용된 세균 모두에 대해 항균 활성을 나타내었으며, P. vulgaris, S. typhimurium 및 L. monocytogenes 에대해 각각 20.5, 16.0 및 15.0 mm의 매우 큰 생육 억제 환을 나타내었다. 한편 butanol 분획은 P.
- 0 mm의 매우 큰 생육 억제 환을 나타내었다. 한편 butanol 분획은 P. aernginosc를 제외한 세균들에서 항균활성이 나타났으며, 전반적으로 ethylacetate 분획물보다는 약한 활성을 나타내었다. n-hexane 분획물과 물 잔류물은 상대적으로 한정된 항균활성을 나타내었으며, 대조구로 사용된 ampicillin(l pg/disc)은 사용 균주 모두에서 10.
- aernginosc를 제외한 세균들에서 항균활성이 나타났으며, 전반적으로 ethylacetate 분획물보다는 약한 활성을 나타내었다. n-hexane 분획물과 물 잔류물은 상대적으로 한정된 항균활성을 나타내었으며, 대조구로 사용된 ampicillin(l pg/disc)은 사용 균주 모두에서 10.5~3 mm의 생육저지환을 나타내어 매우 강력한 항세균활성을 가짐을 보여주었다. 각각의 균주에 대한 ethylacetate 및 butanol 분획에 대한 최소생육저해농도(MIC)를 측정한 결과는 Table 3에 나타내었다.
- aeruginosa 균주들이 streptomycin sulfate 내성 상태였다. 그러나, 산사자 methanol 추출물은 항생제 내성 P. aeruginosa CCARM 2010, CCARM 2020, CCARM 2030 및 KACC 10187에 대해 8.0-8.5 mm 정도의 생육 억제 활성을 나타내었다. 가장 우수한 항균활성은 ethylacetate 및 butanol 분획에서 확인되었으며, 이 분획물들은 항생제 다제내성 병원성 P- aeruginosa 균주 모두에 대해 우수한 항균력을 나타내었다.
- 5 mm 정도의 생육 억제 활성을 나타내었다. 가장 우수한 항균활성은 ethylacetate 및 butanol 분획에서 확인되었으며, 이 분획물들은 항생제 다제내성 병원성 P- aeruginosa 균주 모두에 대해 우수한 항균력을 나타내었다. 각각의 분획물들의 최저생육억제농도 평가 결과, P.
- 가장 우수한 항균활성은 ethylacetate 및 butanol 분획에서 확인되었으며, 이 분획물들은 항생제 다제내성 병원성 P- aeruginosa 균주 모두에 대해 우수한 항균력을 나타내었다. 각각의 분획물들의 최저생육억제농도 평가 결과, P. aeruginosa CCARM 2010을 제외한 항생제 내성 균주와 PAO-1 균주는 MIC값이 2.5-5.0 mg/mL 농도로 확인되었으며 , 기타의 P- aeruginosa 균주들은 MIC값이 5.0-7.5 mg/ mL 농도로 나타났다(Table 5). 이는 산사자의 ethylacetate 및 butanol 분획물은 기존 내성 항생제와는 다른 기작으로 P.
- 5 mg/mL 의 MIC를 나타내어 (result not shown), 산사자가 Candida sp. 제어에도 이용 가능함을 알 수 있었다.
- 1% 농도에서 100% 용혈현상이 나타났다. n-hexane분획물을 제외한 산사자의 추출물 및 분획물들은 250 gg/mL 농도에서 용혈현상이 나타나지 않았으며, n-hexane 분획물은 약 3.2%의 용혈 이 나타났다(Fig. lb). 이러한 용혈현상은 농도 의존적이었으며, 500 ng/mL 농도에서는 약 9.
- 본 연구에서는 산사자의 유용 생리활성 검토를 위한 연구의 일환으로, 산사자의 methanol 추출물 및 이의 n-hexane, ethylacetate, butanol 분획물 및 물 잔류물을 조제하여 항생제 다제내성 Pseudomonas aeruginosa 및 Candida sp를 포함하는 다양한 병원성 및 식중독 미생물에 대한 항균활성을 평가하였다. 산사자의 methanol 추출물은 그람 양성 및 음성의 다양한 세균에 대해 항균활성을 나타내었고, 이의 분획물 중 ethylacetate 및 butanol 분획물은 Listeria monocytogenese Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureuse Bacillus subtilis, Salmonella typhimuriume Proteus vulgaris, Escherichia ci는 물론 10종의 항생제 내성 병원성 Pseudomonas aeruginosae 대해서도 우수한항세균 활성을 나타내었다(최소생육억제농도 1.0~7.5 mg/ mL). 또한 ethylacetate 및 butanol 분획물은 일부의 Candida 에 대해서도 항균활성을 나타내었다.
- 5 mg/ mL). 또한 ethylacetate 및 butanol 분획물은 일부의 Candida 에 대해서도 항균활성을 나타내었다. 한편 n-hexane 분획물을 제외한 산사자 methanol 추출물 및 분획물들은 500 μg/mL 농도까지 인간적혈구에 대한 용혈현상을 보이지 않았으며 , n-hexane 분획물은 500 μg/mL 농도에서 약 9.
후속연구
- 5 mg/ mL 농도로 나타났다(Table 5). 이는 산사자의 ethylacetate 및 butanol 분획물은 기존 내성 항생제와는 다른 기작으로 P. aerwgosa생육을 억제하며, 활성물질의 정제가 이루어진다면 산사자가 P. aeruginosa 생육억제제로 개발 가능함을 암시하고 있다.
- 그러나 n-hexane 분획물을 제외한 시료의 경우, 500 |ig/mL 농도에서도 용혈현상이 전혀 나타나지 않으며 산사자 추출물의 nhexnae 분획물의 분획율이 1% 수준이므로 일반적인 사용에 있어서 산사자의 독성은 없을 것으로 판단되었다. 본 연구 결과는 산사자의 ethylacetate 및 butanol 분획물이 항생제 내성 균주들을 포함한 다양한 세균 및 Candida에 우수한 항균 활성을 가짐을 나타내며 , 이들로부터 항생제 내성 균주에 대한 항균제 개발가능성을 제시하고 있다. 현재 기존 항생제와 산사자 ethylacetate 분획물의 동시처리에 의한 항생제 내성균주 제어 가능성을 검토 중에 있으며, ethylacetate 및 butanol 분획물로부터 항균 활성물질의 정제가 필요하다.
- 9% 의 미미한 용혈활성을 나타내었다. 이러한 결과는 산사 자가 다양한 세균의 제어는 물론 항생제 내성 Pseudomonas aeruginosa 제어를 위한 생물자원으로 개발 가능함을 제시하고 있다.
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