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문제 정의
- 소 망막으로부터 내피세포를 분리하고, 세포 생존율은 MTT assay로 확인하였다. Wound migration assay는 BRECs의 이동력을 확인하기 위해 수행하였다. Tube formation은 on-gel system을 통해 확인하였다.
- 본 연구는 BRECs에서 AGEs로 유도된 세포의 이동 및 침윤에 있어서 AuNP의 역할에 관한 연구이다. 소 망막으로부터 내피세포를 분리하고, 세포 생존율은 MTT assay로 확인하였다.
- 본 연구는 BRECs에서 고농도의 AuNP 처리시 AGEBSA로 유도된 세포 침윤 및 이동성에 대한 연구와 caspase-3을 통한 apoptosis를 밝히고자 하였다.
- 본 연구에서는 소망막내피세포(bovine retinal endothelial cells, BRECs)에서 AGE-BSA로 유도된 세포의 이동 및 침윤과 같은 신생혈관 형성 기작에 AuNP의 영향을 확인하고자 하였다.
가설 설정
- (B) AuNP inhibited BRECs survival in a dose-dependent manner. (C) The addition of AuNP with AGE-BSA in BRECs decreased cell proliferation. Each bar represents the mean±S.
제안 방법
- 그런 다음 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 24시간 후에 배지를 제거하고 혈관을 떼어낸다음 세포 부유물과 죽은 세포를 MEM 배지로 제거한 다음 매 3일마다 IMDM 배지로 교환해 주었다.
- 3시간 후 배양액을 버리고 dimethylsulfoxide (Sigma, USA)를 200 μL well-1씩을 넣어 5분간 실온 방치하여 푸른색 결정인 formazan을 용해시킨 후 분광광도계(microplate spectorphotometer: BioRad, USA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교하였다.
- AuNP의 이러한 BRECs 세포 이동성 및 맥관형성 억제가 어떠한 기전에 의해 일어나는지 확인하기 위해 apoptosis의 대표적인 caspase-3 효소 활성을 측정하였다(Fig. 4). 그 결과, AGE-BSA의 존재여부와 상관없이 AuNP는 caspase-3 활성의 증가를 유도하였다.
- BRECs에서 AGE-BSA의 신생혈관 형성 효과를 확인하기 위해 AGE-BSA 처리 전 무혈청 배지에서 세포 생존율을 측정하였다. BRECs가 무혈청 배지에서 자라게 했을 경우 24시간 내에 그 수가 감소하였다.
- PBS로 2회 세척 후 시간별로 BRECs의 이동을 보는 cell migration assay를 시행하였다. BRECs의 이동성은 위상차현미경으로 관찰하였고, 상처 가장자리에서 세포 단일층의 증식을 막는 5-flurouracil (Sigma, USA)의 존재 하에 시행되었다.
- 05) 억제하였다. Fig. 1C는 AuNP 의 항혈관 형성능을 측정하기 위해, AGE-BSA로 유도된 BRECs 증식을 MTT assay를 실시하였다. AGE-BSA와 300 nM의 AuNP를 동시에 처리한 결과, AGE-BSA 단독 처리한 경우와 비교하여 세포의 증식이 유의적인(p<0.
- 2004). PBS로 2회 세척 후 시간별로 BRECs의 이동을 보는 cell migration assay를 시행하였다. BRECs의 이동성은 위상차현미경으로 관찰하였고, 상처 가장자리에서 세포 단일층의 증식을 막는 5-flurouracil (Sigma, USA)의 존재 하에 시행되었다.
- AuNP inhibits AGE-BSA induced cell migration in BRECs. The quantitative assessments of cell migration, in which AuNP blocked the AGE-BSA induced the cell migration calculated from the control. Each bar represents the mean ±S.
- Wound migration assay는 BRECs의 이동력을 확인하기 위해 수행하였다. Tube formation은 on-gel system을 통해 확인하였다. AuNP의 apoptosis 유도는 caspase-3 assay를 통해 확인하였다.
- 그리고 안구를 멸균수로 2회 세척한 후 2.5 μg mL-1의 amphotericin-B (Sigma, USA)와 100 U mL-1의 penicillin-G (Sigma, USA), 100 μg mL-1의 streptomycin (Calbiochem, Germany)이 들어있는 1%의 항생제로 세척한 후 모양체근 뒤로 절개를 하였다.
- 세포 이동에 있어서 AuNP와 AGE-BSA의 효과를 알기 위해 wound migration assay를 실시하였다. 본 실험은 다양한 조건에서 세포 이동을 양적으로 표현한 것으로 AGE-BSA에 의한 세포의 이동능력은 AuNP 단독 처리한 경우와 비교하여 높게 나타났다(Fig.
- 세혈관이 있는 조직을 최종적으로 Isvove’s modified dulbeccos’s medium (IMDM: Sigma, USA) 배지에서 배양하는데 이 배지에는 추가적으로 fetal bovine serum (FBS: Gibco, USA)과 150 μg mL-1의 heparin (Sigma, USA), 10μg mL-1의 ascorbic acid, 100 U mL-1의 penicillin-G, 100g mL-1의 streptomycin, 2.5 μg mL-1의 amphotericin-B를 추가하였다.
- 본 연구는 BRECs에서 AGEs로 유도된 세포의 이동 및 침윤에 있어서 AuNP의 역할에 관한 연구이다. 소 망막으로부터 내피세포를 분리하고, 세포 생존율은 MTT assay로 확인하였다. Wound migration assay는 BRECs의 이동력을 확인하기 위해 수행하였다.
- 신생혈관 형성에 있어서 AuNP의 역할을 알아보기 위해 tube formation assay를 실시하였다(Fig. 3). 그 결과, AGE-BSA를 처리한 BRECs는 모세혈관망을 형성하였음을 알 수 있었다.
- 5 μg mL-1의 amphotericin-B (Sigma, USA)와 100 U mL-1의 penicillin-G (Sigma, USA), 100 μg mL-1의 streptomycin (Calbiochem, Germany)이 들어있는 1%의 항생제로 세척한 후 모양체근 뒤로 절개를 하였다. 안구의 앞쪽 절반과 수정체와 유리체를 제거하고 망막은 망막색소상피층(retinal pigment epithelial, RPE)으로부터 조심스럽게 적출하였다. 멸균된 100 mm dish로 옮긴 후 남아있는 RPE층을 부드러운 약수저로 제거하였다.
대상 데이터
- BRECs의 분리는 Frye and Patrick (2002)의 방법에 따라 수행하였다. 소 안구를 광주의 삼호축산 도살장에서 구입하여 냉동과 무균상태로 실험실로 가져왔다. 그리고 안구를 멸균수로 2회 세척한 후 2.
데이터처리
- 실험 결과의 유의성 검증은 Student’s t test 방법에 따라 실시하였으며, p⁄0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- Tube formation은 on-gel system을 통해 확인하였다. AuNP의 apoptosis 유도는 caspase-3 assay를 통해 확인하였다. AGE-BSA은 세포증식 및 이동에 있어서 증가함을 보여주었다.
- BRECs의 분리는 Frye and Patrick (2002)의 방법에 따라 수행하였다. 소 안구를 광주의 삼호축산 도살장에서 구입하여 냉동과 무균상태로 실험실로 가져왔다.
- MTT assay는 Mosmann (1983) 방법에 따라 시행하였다. BRECs를 2×103 cells mL-1 세포 수로 계수한 다음 96 well plate (Nunc, Denmark)에 200 μL씩 분주하여 24시간 동안 배양하고 0.
성능/효과
- AGE-BSA와 300 nM의 AuNP를 동시에 처리한 결과, AGE-BSA 단독 처리한 경우와 비교하여 세포의 증식이 유의적인(p<0.05) 감소를 보였다.
- AuNP의 apoptosis 유도는 caspase-3 assay를 통해 확인하였다. AGE-BSA은 세포증식 및 이동에 있어서 증가함을 보여주었다. 또한 AuNP는 AGE-BSA 존재 유무에 상관없이 세포의 증식, 이동, 신생혈관 형성을 억제하였고, caspase-3을 통해 apoptosis를 유도하였다.
- 그 결과, AGE-BSA의 존재여부와 상관없이 AuNP는 caspase-3 활성의 증가를 유도하였다. AuNP에 의해 유도된 apoptosis는 caspase-3 억제제인 Ac-DEVDCHO를 처리한 결과 효과적으로 억제되었다.
- BRECs는 24시간 동안 여러 농도(100, 200, 300, 400, 500 nM)로 AuNP를 처리한 결과, 300, 400, 500 nM의 AuNP 농도에서 BRECs의 성장을 유의적으로(p<0.05) 억제하였다.
- 3). 그 결과, AGE-BSA를 처리한 BRECs는 모세혈관망을 형성하였음을 알 수 있었다. 이와 반대로 AuNP를 단독 처리한 결과 모세혈관망의 배열을 현저히 억제하였다.
- 4). 그 결과, AGE-BSA의 존재여부와 상관없이 AuNP는 caspase-3 활성의 증가를 유도하였다. AuNP에 의해 유도된 apoptosis는 caspase-3 억제제인 Ac-DEVDCHO를 처리한 결과 효과적으로 억제되었다.
- 그러나 AuNP와 AGE-BSA를 동시에 처리한 경우, AGE-BSA 단독 처리한 경우와 비교하여 세포의 이동능력이 유의적인(p<0.05) 감소를 보였다.
- 05) 감소를 보였다. 따라서 위 결과는 300 nM의 AuNP 처리가 BRECs에서 AGE-BSA에 의한 세포의 이동능력을 억제함을 알 수 있었다.
- AGE-BSA은 세포증식 및 이동에 있어서 증가함을 보여주었다. 또한 AuNP는 AGE-BSA 존재 유무에 상관없이 세포의 증식, 이동, 신생혈관 형성을 억제하였고, caspase-3을 통해 apoptosis를 유도하였다. 이러한 결과, AuNP는 AGE로 유도된 신생혈관 형성 및 세포의 이동성을 억제하는 약재제로서, 당뇨성 합병증에 있어서 잠재적으로 중요한 분자가 될 것이다.
- 또한 AuNP와 AGE-BSA를 동시에 처리한 경우, AGE-BSA 단독 처리한 경우와 비교하여 모세혈관망의 배열이 유의적인(p<0.05) 감소를 보였다.
- 이는 AuNP가 BRECs에 직접 작용하여 억제한다는 것을 알려준다. 또한 세포독성을 일으키지 않는 AuNP 농도에서는 BRECs에서 망막의 신생혈관 형성을 조절하는데 최소한 AGE-BSA의 성장과 이동 촉진 활성을 억제함으로서 세포 생존과 혈관형성 이동능력을 억제하였다. 추후 이러한 작용기전연구가 더 진행되어야 할 것으로 사료된다.
- 세포 이동에 있어서 AuNP와 AGE-BSA의 효과를 알기 위해 wound migration assay를 실시하였다. 본 실험은 다양한 조건에서 세포 이동을 양적으로 표현한 것으로 AGE-BSA에 의한 세포의 이동능력은 AuNP 단독 처리한 경우와 비교하여 높게 나타났다(Fig. 2). 그러나 AuNP와 AGE-BSA를 동시에 처리한 경우, AGE-BSA 단독 처리한 경우와 비교하여 세포의 이동능력이 유의적인(p<0.
- 2005). 본 연구에서 AGE-BSA는 BRECs에서 세포 생존, 이동, 신생혈관 형성의 증가를 가져왔다. 비록 세포 수의 증가가 20 μg mL-1의 농도까지의 AGE-BSA에서 관찰되었지만, 그 이상에서는 감소하였다.
- 나노입자의 항혈관형성 활성에 대한 기작은 분명치 않다. 본 연구에서 고농도의 AuNP는 BRECs의 증식을 농도 의존적으로 억제하였다. 이는 AuNP가 BRECs에 직접 작용하여 억제한다는 것을 알려준다.
- 또한 AuNP는 AGE-BSA 존재 유무에 상관없이 세포의 증식, 이동, 신생혈관 형성을 억제하였고, caspase-3을 통해 apoptosis를 유도하였다. 이러한 결과, AuNP는 AGE로 유도된 신생혈관 형성 및 세포의 이동성을 억제하는 약재제로서, 당뇨성 합병증에 있어서 잠재적으로 중요한 분자가 될 것이다.
- 05) 감소를 보였다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때, AuNP가 AGE-BSA에 의해 유발된 BRECs의 이동성 억제 및 침윤 억제작용을 하고 있는 것으로 사료된다.
- 2003). 혈관 주변 세포의 제거는 다양한 세포 부착 방법과 트립신의 처리를 하여 얻었고, 그 결과 주변세포의 제거를 할 수 있었다. 그리고 여러 과정을 통해 BRECs를 얻었다(Frye and Patrick 2002).
후속연구
- 2002). 앞으로의 연구는 당뇨의 합병증을 치료하는 새로운 물질을 찾는 것이다.
- 또한 세포독성을 일으키지 않는 AuNP 농도에서는 BRECs에서 망막의 신생혈관 형성을 조절하는데 최소한 AGE-BSA의 성장과 이동 촉진 활성을 억제함으로서 세포 생존과 혈관형성 이동능력을 억제하였다. 추후 이러한 작용기전연구가 더 진행되어야 할 것으로 사료된다.
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