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문제 정의
- 그러므로 본 연구에서는 약리활성을 갖는 수삼 열수 추출물로 부터 수삼추출물을 조제하고 약용 및 식용으로 이용되어온 노루궁뎅이 버섯 균사체의 생육액체배지에 첨가하여 배양함으로써 생리활성이 증진된 심부발효물을 조제하기 위한 flask 및 jar fermenter에서의 발효조건을 확립하고자 하였다. 또한 수삼추출물 첨가농도에 따라 조제된 심부발효물의 조다 당획분을 조제하여 발효물의 특성 및 생리활성을 검토함으로써 수삼추출물이 첨가된 노루궁뎅이 균사체의 심부발효물을 조제하여 향후 새로운 유형의 수삼 소재를 개발하고 이를 기능성 식품 소재로 활용하고자 하였다.
- 5% 첨가된 MCM 액체배지에서 노루궁뎅이 균사체의 심부발효 최적 조건을 검토하였다. 노루궁뎅이 균사체 심부 발효물의 대량생산에 필요한 균사체 생육조건은 위에서 검토한 최적 조건인 배양 온도 25℃와 초기 pH 5.5를 적용하였으며, 배양 중경시적인 변화를 추적하여 산업적 적용의 기초자료를 확보하고자 하였다. 50 L jar fermenter에서 최적 발효조건으로 수삼추출물이 첨가된 MCM에서 노루궁뎅이 버섯 균사체를 배양하면서 환원당과 MDW간의 경시적인 변화를 살펴본 결과, 배양시간의 경과에 따라 잔존 환원당으로 측정한 기질 소비는 배양시간 경과에 따라 감소하였으며, 교반 속도의 증가와 함께 기질소비는 비교적 증가하였다(data not shown).
- 따라서 본 연구는 수삼추출물이 첨가된 액체배지에서 노루궁뎅이 균사체의 생물학적 전환능을 이용하여 심부발효물의 유효성분이 증진된 기능성 소재를 조제하는 것이 목적이다. 이를 위하여 50 L jar fermenter를 이용하여 최적액체배지로 선정된 MCM 에 수삼추출물을 1, 3 및 5% 첨가하고 노루궁뎅이 버섯 균사체를 최적 발효조건에서 배양하였다 (HE-GE-1, 3과 5).
- 그러므로 본 연구에서는 약리활성을 갖는 수삼 열수 추출물로 부터 수삼추출물을 조제하고 약용 및 식용으로 이용되어온 노루궁뎅이 버섯 균사체의 생육액체배지에 첨가하여 배양함으로써 생리활성이 증진된 심부발효물을 조제하기 위한 flask 및 jar fermenter에서의 발효조건을 확립하고자 하였다. 또한 수삼추출물 첨가농도에 따라 조제된 심부발효물의 조다 당획분을 조제하여 발효물의 특성 및 생리활성을 검토함으로써 수삼추출물이 첨가된 노루궁뎅이 균사체의 심부발효물을 조제하여 향후 새로운 유형의 수삼 소재를 개발하고 이를 기능성 식품 소재로 활용하고자 하였다.
- 특히, 자실체 형성을 필요로 하지 않는 용도이면 산업적으로 고체 배양보다 매우 유리한 장점을 갖는 것으로 보고되어 최근 들어 버섯을 발효조중에서 배양하는 연구가 매우 활발히 진행되고 있는 실정이다(31,32).본 연구에서도 생리활성이 강화된 노루궁뎅이 버섯 균사체의 심부 발효물을 기능성 식품의 소재로 활용하기 위하여 수삼추출물이 첨가된 액체배지에서의 노루궁뎅이 균사체의 심부발효를 위한 생육조건을 검토하였다. 한편, 최적발효조건에서 수삼추출물이 첨가되지 않은 MCM 액체배지에서 배양된 노루궁뎅이 균사체의 MDW는 배양 10일 후에 5.
- 수삼추출물 첨가농도에 따라 jar fermenter에서 제조된 노루궁뎅이 균사체 심부 발효물의 생리활성을 평가하기 위하여 심부 발효물 조다 당획분에 대한 마이토젠 활성을 비장 세포의 증식도로 검토하였다. 즉, 6주령의 BALB/c(Nara Biotech, Inc.
제안 방법
- , Rancho Dominguez, CA, USA) 및 동결건조하여 열수 추출물로 조제한 후 다시 증류수에 용해시키고 5배의 에탄올을 첨가하여 원심분리로 침전물을 회수하였다. EtOH 침전물을 소량의 증류수에 재용해하고 투석, 원심분리, 농축 및 동결건조를 거쳐 조다 당획분으로 조제하였다. 한편, 이와 같이 수삼추출물 농도에 따라 조제된 조다 당의 중성당, 산성당 및 단백질은 phenol-sulfuric acid법(22), m-hydroxydiphenyl법(23)과 Bio-Rad dye(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용한 Bradford법(24)을 이용하여 분석하였으며 표준물질은 각각 glucose, galacturonic acid 및 bovine serum albumin(BSA, Sigma Co.
- 본 연구에서는 사포닌 등의 저분자ginsenoside보다는 비사포닌 계열의 고분자 물질에 초점을 맞추었기 때문에 심부 발효물의 열수 추출물을 EtOH 처리하여 조다 당획분을 조제하였다. EtOH 침전에 의해 분획된 조다 당획분은 주로 다당류 또는 단백다당의 고분자 물질로 구성되어 있으므로(39,40), 이들 획분의 구성분으로서 중성당, 산성당 및 단백질을 분석하였다. 수삼추출물이 1% 첨가된 배지에서 배양하여 얻은 심부 발효물의 조다 당(HE-GE-CP-1)은 68.
- Flask 배양으로 확립된 최적심부발효 조건을 토대로 노루궁뎅이 균사체의 액체 배양을 통한 기능성 소재의 대량생산을 위해 수삼추출물이 0.5% 첨가된 MCM 액체배지에서 노루궁뎅이 균사체의 심부발효 최적 조건을 검토하였다. 노루궁뎅이 균사체 심부 발효물의 대량생산에 필요한 균사체 생육조건은 위에서 검토한 최적 조건인 배양 온도 25℃와 초기 pH 5.
- 골수세포의 증식활성은 시료와 Peyer's patch 세포와의 반응으로부터 회수한 상등액을 골수세포와 반응시켜 Alamar Blue™(Alamar Bio-Sciences Inc., Sacramento, CA, USA)가 골수세포에 의해 발색되는 정도(27)를 Fluoroskan II(Labsystems, Helsinki, Finland)를 이용하여 excitation 544 nm와 emission 590 nm에서 형광도로 측정한 후 생리식염수를 시료대신 사용한 대조구와 골수세포의 증식도를 비교하여 정량화하였다.
- 노루궁뎅이 버섯 균사체(Hericium erinaceum)의 심부 발효물로부터 기능성 소재를 얻기 위하여 flask 배양에서 적당한 기본 배지를 선정하였고, jar fermenter에서 선정된 mushroom complete medium(MCM)에 수삼 추출물을 첨가하여 최적발효조건을 검토하였다. 기본액체배지 중수삼추출물이 0.
- 노루궁뎅이버섯 균사체의 심부발효 생육 액체배지를 결정하기 위하여 버섯 생육배지로 많이 사용되는 10종의 액체배지(Table 1)에 수삼 열수추출물을 65°Brix로 농축한 수삼추출물을 0.5% 첨가한 후 flask에서 10일간 배양하면서 각각의 액체배지에서의 건조 균체량(MDW)을 측정하였다.
- 다음으로 Peyer’s patch 세포와 시료의 반응으로부터 회수한 상등액과 RPMI 1640-FBS를 각각 50 µL씩 첨가하고 6일간 배양하였다.
- 5% 첨가된 MCM에서의 노루궁뎅이 균사체의 최적심부발효조건을 확립하기 위하여 생육 온도는 20, 25, 30 및 35℃로 조절된 진탕배양기에서 10일간 배양한 다음 MDW를 측정하였다. 다음으로 가장 우수한 MDW를 나타낸 최적 온도에서 액체 배지의 초기 pH를 4.0, 5.0, 5.5, 6.0, 7.0으로 변화시켜, 진탕배양기에서 10일간 배양하고 MDW를 측정하여 flask 심부 발효 최적 pH를 결정하였다. 또한, 최적생육 온도 및 최적 생육 pH에서의 균사체 배양에 따른 당의 경시적인 변화는 phenol-sulfuric acid법(22)을 이용하여 490 nm에서 흡광도(UV-2450, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 측정하여 정량하였으며, 표준물질로는 glucose를 사용하였다.
- 먼저, C3H/He 마우스(Orient Bio Co., Seongnam, Korea)로부터 Peyer's patch 세포를 2×106 cells/mL RPMI 1640-FBS(5% FBS 함유)의 농도로 조제하여 96 well plate에 180 µL씩 분주하고 적당한 농도로 희석한 시료를 20 µL씩 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 5일간 배양한 후 상등액을 회수하여 골수세포 증식활성에 사용하였다.
- 5% 첨가된 10종의 액체배지(Table 1)를 각각 250 mL 삼각플라스크에 50 mL씩 분주하고 상기종균을 5%씩 접종하여 25℃로 조절된 진탕배양기에서 10일간 배양하였다. 배양 완료와 함께 각각의 액체 배지에서 배양된 균사체의 건조중량(mycelial dry weight; MDW)을 측정하여, 노루궁뎅이 균사체의 생육이 우수한 심부 발효용 액체배지를 선발하였다. 이때 MDW은 미리 항량을 구한 filter paper(Advantec No.
- 본 연구를 통하여 홍삼박을 천연 배지로 생육할 수 있는 유용 균사체 3종을 확보하였으며, 이들 중 노루궁뎅이 버섯 균사체를 수삼 추출물이 첨가된 액체배지에 배양하여 생리활성이 증진된 심부발효물을 조제하기 위한 버섯 균사체의 대량생산발효조건과 수삼추출물의 최적첨가농도를 50 L jar fermenter에서 확립하였다. 또한 기본액체배지인 MCM에 수삼추출물을 첨가함으로써 MCM만의 균사체 발효물보다 면역활성이 증가됨도 확인하여 기능성 소재로서의 활용 가능성도 확인할 수 있었다.
- 한편, 수삼추출물이 첨가된 MCM에 노루궁뎅이 균사체를 jar fermenter에서 배양하여 얻은 심부 발효물(균사체와 배양액 혼합)의 발효산물의 특성을 평가하기 위하여 구성분을 분석하였다. 본 연구에서는 사포닌 등의 저분자ginsenoside보다는 비사포닌 계열의 고분자 물질에 초점을 맞추었기 때문에 심부 발효물의 열수 추출물을 EtOH 처리하여 조다 당획분을 조제하였다. EtOH 침전에 의해 분획된 조다 당획분은 주로 다당류 또는 단백다당의 고분자 물질로 구성되어 있으므로(39,40), 이들 획분의 구성분으로서 중성당, 산성당 및 단백질을 분석하였다.
- 수삼추출물이 0.5% 첨가된 10종 액체배지에서의 노루궁뎅이 균사체 심부 발효 결과, mushroom complete medium(MCM)에서 가장 높은 MDW를 나타내었으므로 이를 기본 배지로 선정하여, 노루궁뎅이 버섯 균사체의 최적심부발효 조건을 검토하였다. 수삼추출물이 0.
- 수삼추출물이 0.5% 첨가된 MCM에서의 노루궁뎅이 균사체의 대량생산 심부 발효 조건을 50 L jar fermenter를 이용하여 확립한 후 생리활성 성분이 강화된 심부발효물(균사체와 배양액 혼합)을 조제하기 위하여 수삼추출물을 다양한 농도로 첨가하여 노루궁뎅이 균사체의 심부발효 특성을 검토하였다. 즉, 위에서 선정한 생육 최적액체배지인 MCM에 수삼을 열수 추출하여 65°Brix로 농축한 수삼추출물을 각각 1, 3 및 5%로 첨가하고 최적 발효조건인 종균 접종비 10%(v/v), 배양온도 25℃, 초기 pH 5.
- 5% 첨가된 10종 액체배지에서의 노루궁뎅이 균사체 심부 발효 결과, mushroom complete medium(MCM)에서 가장 높은 MDW를 나타내었으므로 이를 기본 배지로 선정하여, 노루궁뎅이 버섯 균사체의 최적심부발효 조건을 검토하였다. 수삼추출물이 0.5% 첨가된 MCM에서의 노루궁뎅이 균사체의 최적심부발효조건을 확립하기 위하여 생육 온도는 20, 25, 30 및 35℃로 조절된 진탕배양기에서 10일간 배양한 다음 MDW를 측정하였다. 다음으로 가장 우수한 MDW를 나타낸 최적 온도에서 액체 배지의 초기 pH를 4.
- 수삼추출물이 첨가된 MCM에 노루궁뎅이 균사체를 jar fermenter 로 배양하여 얻은 심부발효물(균사체와 배양액 혼합) 발효산물의 특성을 평가하기 위하여 심부발효물을 homogenizer(Ultra-turrax T50; Janke & Kunkel GmbH & Co., KG-IKA-Labortechnik, Staufen, Germany)로 균질화한 후 열수추출하고 원심분리(7,500×g, 30 min)로 불용성 침전물을 제거하였다.
- 수삼추출물이 첨가된 액체배지에서 식용으로 이용되고 있는 유용균사체로부터 심부발효를 통한 기능성 소재를 개발할 목적으로 우수 균주를 선발하기 위하여 수삼추출물이 0.5% 첨가된 PDB에서 10종의 버섯 균사체를 배양하였다. 배양된 각각의 균사체 5%를 홍삼박에 접종하여 20-30일간 배양하면서 균사의 생육정도 및 밀도를 육안으로 관찰한 결과, 노루궁뎅이 버섯(H.
- erinaceum) 외 9종의 식용 버섯으로 충청북도 농업기술원(Chungwon, Korea)으로 부터 분양받았다. 실험에 사용하기 위해 potato dextrose agar (PDA, Difco, Detroit, MI, USA) 사면 배지에서 상황버섯과 영지버섯은 30℃, 노루궁뎅이 버섯을 포함한 나머지는 25℃에서 10일간 배양한 후 4℃에서 보존하였으며 4주마다 계대 배양하였다. 한편, 균주 선정을 위한 배지로 서 홍삼 박은 2007년도에 증평군 일원에서 수확한 4-5년 근 수삼의 홍삼 가공 부산물로서 홍삼을 1회 추출하여 잔존 유효성분이 20-30%인 홍삼박을증평군인삼연구회(Jeungpyeong, Korea)로부터 받아 사용하였다.
- 2).이러한 결과를 토대로 가장 우수한 생육을 나타낸 수삼 추출물이 0.5% 첨가된 MCM에서의 노루궁뎅이 버섯 균사체 심부 발효에 대한 배양 온도와 pH의 최적발효조건을 flask 배양으로 검토하였다. 최적 배양 온도의 경우에는 배양 10일 후에 20℃에서도 생육상태가 양호하였으나 (5.
- 따라서 본 연구는 수삼추출물이 첨가된 액체배지에서 노루궁뎅이 균사체의 생물학적 전환능을 이용하여 심부발효물의 유효성분이 증진된 기능성 소재를 조제하는 것이 목적이다. 이를 위하여 50 L jar fermenter를 이용하여 최적액체배지로 선정된 MCM 에 수삼추출물을 1, 3 및 5% 첨가하고 노루궁뎅이 버섯 균사체를 최적 발효조건에서 배양하였다 (HE-GE-1, 3과 5). Fig.
- 즉, 6주령의 BALB/c(Nara Biotech, Inc., Pyeongtaek, Korea) 마우스를 경구탈추시킨 후 멸균적으로 비장을 적출하고 비장세포(splenocyte)를 회수하여 2×105 cells/mL의 농도로 조정하였다.
- 즉, 위에서 선정한 생육 최적 액체배지인 MCM에 수삼을 열수추출하여 65°Brix로 농축한 수삼추출물을 각각 1, 3 및 5%로 첨가하고 최적 발효조건인 종균 접종비 10%(v/v), 배양온도 25℃, 초기 pH 5.5 및 통기속도 0.4 vvm와 교반속도 120 rpm으로 5일간 심부배양하면서 경시적으로 균사체량(MDW)과 함께 pH, 산도, DO 및 환원당 등의 심부발효 특성을 검토하여 수삼추출물의 최적 농도를 결정하였다.
- 즉, 홍삼박을 상온에서 5-7시간 건조시킨 후, 2 L 배양포트(Dongwoo Co., Okcheon, Korea)에 500 g씩 담아 멸균한 후 수삼 추출물이 0.5%(v/v) 첨가된 potato dextrose broth(PDB, Difco)에서 배양한 10종의 식용버섯 균사체 종균을 홍삼박 양의 5%(v/w)가 되도록 접종하였다.
- 또한, 최적생육 온도 및 최적 생육 pH에서의 균사체 배양에 따른 당의 경시적인 변화는 phenol-sulfuric acid법(22)을 이용하여 490 nm에서 흡광도(UV-2450, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 측정하여 정량하였으며, 표준물질로는 glucose를 사용하였다. 한편, 50 L jar fermenter(Fermenter Co., Cheongwon, Korea)를 이용한 노루궁뎅이 균사체 심부 발효물의 대량생산은 수삼추출물이 0.5% 첨가된 MCM 액체배지에 위에서 확립된 flask 발효 조건의 최적 온도와 pH를 적용하여 균사체 접종량, 교반 속도 및 통기 속도를 검토하여 최적 조건에서 배양하였다.
- , Daejeon, Korea). 한편, 노루궁뎅이 버섯 균사체의 심부 발효를 위한 액체 배지를 결정하기 위하여 수삼추출물이 0.5% 첨가된 10종의 액체배지(Table 1)를 각각 250 mL 삼각플라스크에 50 mL씩 분주하고 상기종균을 5%씩 접종하여 25℃로 조절된 진탕배양기에서 10일간 배양하였다. 배양 완료와 함께 각각의 액체 배지에서 배양된 균사체의 건조중량(mycelial dry weight; MDW)을 측정하여, 노루궁뎅이 균사체의 생육이 우수한 심부 발효용 액체배지를 선발하였다.
- 한편, 수삼추출물이 첨가된 MCM에 노루궁뎅이 균사체를 jar fermenter에서 배양하여 얻은 심부 발효물(균사체와 배양액 혼합)의 발효산물의 특성을 평가하기 위하여 구성분을 분석하였다. 본 연구에서는 사포닌 등의 저분자ginsenoside보다는 비사포닌 계열의 고분자 물질에 초점을 맞추었기 때문에 심부 발효물의 열수 추출물을 EtOH 처리하여 조다 당획분을 조제하였다.
- 홍삼박 배지에서 우수한 생육을 보인 노루궁뎅이버섯 균주의 종균을 제조하기 위하여 균주를 PDA 평판배지에 접종하고 25℃에서 7일간 배양한 후 cork borer(φ 8 mm)로 절취하여 균주 disk를 만들었다.
대상 데이터
- 5%(v/v) 첨가된 potato dextrose broth(PDB, Difco)에서 배양한 10종의 식용버섯 균사체종균을 홍삼 박 양의 5%(v/w)가 되도록 접종하였다. 20-30일간 배양하면서 균사의 활착길이와 밀도 등을 육안으로 관찰하여 10종의 버섯 중 생육이 우수한 3종의 버섯 중 노루궁뎅이 버섯 균주를 선정하여 본 연구에 사용하였다.
- 본 연구에 사용한 균주는 노루궁뎅이 버섯(H. erinaceum) 외 9종의 식용 버섯으로 충청북도 농업기술원(Chungwon, Korea)으로 부터 분양받았다. 실험에 사용하기 위해 potato dextrose agar (PDA, Difco, Detroit, MI, USA) 사면 배지에서 상황버섯과 영지버섯은 30℃, 노루궁뎅이 버섯을 포함한 나머지는 25℃에서 10일간 배양한 후 4℃에서 보존하였으며 4주마다 계대 배양하였다.
- 생리활성이 보고된 10종의 식용버섯 중 수삼에서 생육이 우수한 균주를 선정하기 위하여 홍삼 박 배지의 고체 배양을 이용하였다. 즉, 홍삼박을 상온에서 5-7시간 건조시킨 후, 2 L 배양포트(Dongwoo Co.
- 실험에 사용하기 위해 potato dextrose agar (PDA, Difco, Detroit, MI, USA) 사면 배지에서 상황버섯과 영지버섯은 30℃, 노루궁뎅이 버섯을 포함한 나머지는 25℃에서 10일간 배양한 후 4℃에서 보존하였으며 4주마다 계대 배양하였다. 한편, 균주 선정을 위한 배지로 서 홍삼 박은 2007년도에 증평군 일원에서 수확한 4-5년 근 수삼의 홍삼 가공 부산물로서 홍삼을 1회 추출하여 잔존 유효성분이 20-30%인 홍삼박을증평군인삼연구회(Jeungpyeong, Korea)로부터 받아 사용하였다. 또한 심부 발효 시 액체배지에 첨가한 수삼추출물은 상기의 수삼을 열수 추출한 후 65°Brix농도로 농축하여 사용하였다.
이론/모형
- 96-well plate의 각 well에 비장세포 현탁액을 90 µL씩 분주하고 적당히 희석된 시료 10 µL와 3일간 배양한 후 비장세포에 대한 마이토젠 활성을 MTT법으로 측정하였다(25).
- 96-well plate의 각 well에 비장세포 현탁액을 90 µL씩 분주하고 적당히 희석된 시료 10 µL와 3일간 배양한 후 비장세포에 대한 마이토젠 활성을 MTT법으로 측정하였다 (25). 골수세포 증식 활성은 Yu 등의 방법(26)에 따라 2단계로 측정하였다. 먼저, C3H/He 마우스(Orient Bio Co.
- 0으로 변화시켜, 진탕배양기에서 10일간 배양하고 MDW를 측정하여 flask 심부 발효 최적 pH를 결정하였다. 또한, 최적생육 온도 및 최적 생육 pH에서의 균사체 배양에 따른 당의 경시적인 변화는 phenol-sulfuric acid법(22)을 이용하여 490 nm에서 흡광도(UV-2450, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 측정하여 정량하였으며, 표준물질로는 glucose를 사용하였다. 한편, 50 L jar fermenter(Fermenter Co.
- EtOH 침전물을 소량의 증류수에 재용해하고 투석, 원심분리, 농축 및 동결건조를 거쳐 조다 당획분으로 조제하였다. 한편, 이와 같이 수삼추출물 농도에 따라 조제된 조다 당의 중성당, 산성당 및 단백질은 phenol-sulfuric acid법(22), m-hydroxydiphenyl법(23)과 Bio-Rad dye(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용한 Bradford법(24)을 이용하여 분석하였으며 표준물질은 각각 glucose, galacturonic acid 및 bovine serum albumin(BSA, Sigma Co., St. Louis, MO, USA)을 사용하였다.
성능/효과
- 1)HE-CP, crude polysaccharide from submerged culture of H. erinaceum without ginseng extracts; HE-GE-CP-1, 3 and 5, crude polysaccharide from submerged culture of H. erinaceum in MCM supplemented with ginseng extract at 1, 3, and 5% level by 50 L jar fermenter, respectively.
- 5를 적용하였으며, 배양 중경시적인 변화를 추적하여 산업적 적용의 기초자료를 확보하고자 하였다. 50 L jar fermenter에서 최적 발효조건으로 수삼추출물이 첨가된 MCM에서 노루궁뎅이 버섯 균사체를 배양하면서 환원당과 MDW간의 경시적인 변화를 살펴본 결과, 배양시간의 경과에 따라 잔존 환원당으로 측정한 기질 소비는 배양시간 경과에 따라 감소하였으며, 교반 속도의 증가와 함께 기질소비는 비교적 증가하였다(data not shown). 한편, 탄소 원인 포도당의 감소와 함께 균사체는 증가하여 배양 5일 후 약 4.
- 28 g/L의 최대 MDW을 나타내었으며 이후 이 수준을 유지하는 경향을 보였다. 교반 속도가 낮은 경우(100 rpm 이하)에는 생육 속도 및 최대 균체량도 낮았으며, 교반 속도가 높은 경우(150 rpm 이상)에는 생육 속도나 최대 균체량은 높았으나 최대값 도달 이후 균사체의 감소 현상을 보여 교반 속도는 120 rpm이 적당한 것으로 확인되었다(data not shown). 한편, jar fermenter에서의 5일 배양으로 얻은 최대 MDW는 10일 배양한 flask 배양의 약 0.
- 그러나 jar fermenter를 이용한 심부발효의 배양기간은 flask보다 2.00배나 단축되었으므로, MDW와 배양기간을 고려한 전체적인 배양효율에서는 flask 배양보다 1.46배(MDW 0.73배×배양기간 2.00배)의 향상을 가져왔음을 확인할 수 있었다.
- 노루궁뎅이 버섯 균사체(Hericium erinaceum)의 심부 발효물로부터 기능성 소재를 얻기 위하여 flask 배양에서 적당한 기본 배지를 선정하였고, jar fermenter에서 선정된 mushroom complete medium(MCM)에 수삼 추출물을 첨가하여 최적발효조건을 검토하였다. 기본액체배지 중수삼추출물이 0.5% 첨가된 MCM에서 25℃, pH 5.5의 조건으로 10일 경과 후 5.89 g/L의 가장 높은 균사체 건조균체량(mycelial dry weight, MDW)을 나타내었다. 발효물의 대량생산을 위한 50 L jar fermenter의 액체 배양에서도 25℃, pH 5.
- 00배)의 향상을 가져왔음을 확인할 수 있었다. 따라서 50 L jar fermenter를 이용한 노루궁뎅이 버섯 균사체의 심부 발효물 대량 조제의 경우에는 배양온도 25℃, 초기 pH 5.5, 교반 속도 120 rpm과 통기 속도 0.4 vvm으로 5일 동안 배양하는 것이 최적인 것으로 확인되었다.
- 28 g/L을 얻을 수 있었다. 또한 MCM에 첨가되는 수삼추출물의 양을 jar fermenter에서 검토한 결과, 수삼추출물 5%가 첨가되는 군(HE-GE-5)의 최적발효조건하에서 4.93 g/L의 최대 건조균 체량을 나타내었다. 한편 수삼추출물이 첨가된 노루궁뎅이 버섯 균사체의 발효물의 특성을 검토하기 위하여 심부 발효물의 조다 당획분을 조제한 후 구성분과 면역활성을 살펴본 결과, 최대 MDW를 나타낸 수삼추출물 5% 첨가심부발효물의 조다당(HE-GE-CP-5)은 주로 중성당(63.
- 본 연구를 통하여 홍삼박을 천연 배지로 생육할 수 있는 유용 균사체 3종을 확보하였으며, 이들 중 노루궁뎅이 버섯 균사체를 수삼 추출물이 첨가된 액체배지에 배양하여 생리활성이 증진된 심부발효물을 조제하기 위한 버섯 균사체의 대량생산발효조건과 수삼추출물의 최적첨가농도를 50 L jar fermenter에서 확립하였다. 또한 기본액체배지인 MCM에 수삼추출물을 첨가함으로써 MCM만의 균사체 발효물보다 면역활성이 증가됨도 확인하여 기능성 소재로서의 활용 가능성도 확인할 수 있었다. 따라서 생리활성을 함유하고 있는 유용균 사체와 수삼추출물의 액체 배양을 통한 심부발효물의 조제 및 기능성 소재로의 활용은 충분히 가능성이 있을 것으로 판단하고 산업적인 적용 및 기능성 식품 개발을 추진할 계획이다.
- 이러한 결과로부터 배양 후 균체량이 가장 높았던, HE-GE-5의 조다당을 대조군인 균사체만의 심부 발효물 조다당과 비교할 때 중성당이 현저히 감소되면서 상대적으로 산성당과 단백질의 양이 증가됨을 보여주고 있기 때문에 발효를 통한 생물학적 전환이유도되고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 수삼추출물 농도에 따라 jar fermenter에서 제조된 노루궁뎅이 균사체 심부 발효물의 생리활성을 평가하기 위하여 심부 발효물 조다당획분에 대한 면역활성을 측정한 결과, 비장세포를 이용한 mitogenic activity의 경우에는 시료 대조군인 HE-CP가 saline 대 조군의 1.61배를 보인 반면, HE-GE-CP-3과 5는 1.76배와 1.89배의 높은 활성을 나타내었다 (Fig. 5A). 그러나 HE-GE-CP-1의 경우(1.
- 8%를 함유하고 있음을 확인할 수 있었다(Table 3). 또한 시료 대조군인수삼추출물이 첨가되지 않은 균사체만의 심부 발효물로부터 분획된 조다당획분(HE-CP)의 경우에는 중성당이 78.8%, 산성당이 15.8%로 구성되어져 있으며 단백질은 2.9%를 함유하고 있음을 알 수 있었다(Table 3).이러한 결과로부터 배양 후 균체량이 가장 높았던, HE-GE-5의 조다당을 대조군인 균사체만의 심부 발효물 조다당과 비교할 때 중성당이 현저히 감소되면서 상대적으로 산성당과 단백질의 양이 증가됨을 보여주고 있기 때문에 발효를 통한 생물학적 전환이유도되고 있음을 확인할 수 있었다.
- 83배의 높은 활성을 나타내어 생리활성 증진에 발효공정이 중요함을 확인할 수 있었다. 또한 통계학적으로 유의차는 없었으나 마이토젠 결과와 유사하게 HE-GE-CP-3(1.69배)은 균사체대조군보다 우수한 결과를 나타내었으나, HE-GE-CP-1에서는 1.44배의 활성을 나타내어 HE-CP(1.59배)보다도 활성이 낮음을 알 수 있었다 (Fig. 5).
- 89 g/L의 가장 높은 균사체 건조균체량(mycelial dry weight, MDW)을 나타내었다. 발효물의 대량생산을 위한 50 L jar fermenter의 액체 배양에서도 25℃, pH 5.5와 교반 속도 120 rpm과 0.4 vvm의 통기 속도로 최적화되었으며, 이러한 조건 하에서 5일 배양으로 최대 MDW인 4.28 g/L을 얻을 수 있었다. 또한 MCM에 첨가되는 수삼추출물의 양을 jar fermenter에서 검토한 결과, 수삼추출물 5%가 첨가되는 군(HE-GE-5)의 최적발효조건하에서 4.
- 5% 첨가된 PDB에서 10종의 버섯 균사체를 배양하였다. 배양된 각각의 균사체 5%를 홍삼박에 접종하여 20-30일간 배양하면서 균사의 생육정도 및 밀도를 육안으로 관찰한 결과, 노루궁뎅이 버섯(H. erinaceum), 상황버섯(Phellinus linteus)과 영지버섯(Ganoderma lucidum)의 3종 균주가 우수한 생육 상태를 나타내었다 (Fig. 1).본 연구에서는 홍삼박에서 생육이 우수하였던 3종의 버섯 중 배양에 관한 많은 연구가 진행되지는 않았으나 최근 생리활성 등이 보고되면서(28,29) 다양한 분야에서 연구가 진행되고 있는 노루궁뎅이 버섯을 먼저 배양하였다.
- 3A). 생육 최적 온도로 결정된 25℃에서 배양 초기의 최적 pH는 5.5에서 MDW 5.91 g/L로 균사의 생육이 증가하고 있음을 확인할 수 있었다 (Fig. 3B).
- 9%를 함유하고 있음을 알 수 있었다(Table 3).이러한 결과로부터 배양 후 균체량이 가장 높았던, HE-GE-5의 조다당을 대조군인 균사체만의 심부 발효물 조다당과 비교할 때 중성당이 현저히 감소되면서 상대적으로 산성당과 단백질의 양이 증가됨을 보여주고 있기 때문에 발효를 통한 생물학적 전환이유도되고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 수삼추출물 농도에 따라 jar fermenter에서 제조된 노루궁뎅이 균사체 심부 발효물의 생리활성을 평가하기 위하여 심부 발효물 조다당획분에 대한 면역활성을 측정한 결과, 비장세포를 이용한 mitogenic activity의 경우에는 시료 대조군인 HE-CP가 saline 대 조군의 1.
- 한편, 심부 발효 중산도 변화를 경시적으로 측정한 결과에서는 수삼추출물 1, 3 및 5% 첨가의 모든 군에서 배양 48시간까지는 산도가 감소되다가 그 이후에는 완만히 증가되는 경향을 보였으나, DO는 모든 군에서 서서히 감소되고 있음을 보여주었다(Table 2). 이상의 결과로부터 MCM 액체배지에 5% 수삼추출물을 첨가하여 배양한 노루궁뎅이 균사체의 발효 특성은 1% 또는 3% 첨가군과는 약간 다른 발효 양상을 보여주면서 가장 높은 균체량을 나타내었는데 이는 수삼추출물의 첨가량이 증가하면서 추출물에 함유된 당과 아미노산 등의 다양한 영양소 함량(C와 N의 급원)도 증가하는 것에 기인하는 것으로 추정된다.
- 5% 첨가한 후 flask에서 10일간 배양하면서 각각의 액체배지에서의 건조균체량(MDW)을 측정하였다. 접종 후 6일까지는 peptone-yeast extract-glucose(PYG)배지가 10종 액체배지에서 가장 높은 MDW를 보였으나 (4.78 g/L), 배양이 완료되는 10일째에는 MCM이 5.41 g/L의 MDW로 가장 높았으며 PYG는 배양 8일째의 MDW 수준(5.12 g/L)을 유지하였다 (Fig. 2). 다음으로는 MCM 과 큰 차이를 보이지는 않았으나 yeast extract-malt extract-peptone-glucose(YMPG) 배지에서도 5.
- 5% 첨가된 MCM에서의 노루궁뎅이 버섯 균사체 심부 발효에 대한 배양 온도와 pH의 최적발효조건을 flask 배양으로 검토하였다. 최적 배양 온도의 경우에는 배양 10일 후에 20℃에서도 생육상태가 양호하였으나 (5.48 g/L), 25℃에서 MDW가 5.82 g/L로 가장 우수한 건조균 체량을 보였으며, 35℃에서는 현저히 저하됨을 나타내었다 (2.03 g/L)(Fig. 3A). 생육 최적 온도로 결정된 25℃에서 배양 초기의 최적 pH는 5.
- 93 g/L의 최대 건조균 체량을 나타내었다. 한편 수삼추출물이 첨가된 노루궁뎅이 버섯 균사체의 발효물의 특성을 검토하기 위하여 심부 발효물의 조다 당획분을 조제한 후 구성분과 면역활성을 살펴본 결과, 최대 MDW를 나타낸 수삼추출물 5% 첨가심부발효물의 조다당(HE-GE-CP-5)은 주로 중성당(63.2%)과 함께 상당량의 산성당(19.3%)과 소량의 단백질(8.8%)로 구성됨을 알 수 있었으며 마이토젠과 골수세포 증식 활성이 균사체만의 심부 발효물 조다당보다 증강되고 있음을 알 수 있었다.
- 5%의 단백질로 구성되어 있었다(Table 3). 한편, 3%와 5%가 첨가된 조다 당획분(HE-GECP-3과 5)의 중성당은 65.9%와 63.2%를 함유하고 있었으며 산성당은 15.2%와 19.3%를, 단백질은 6.9%와 8.8%를 함유하고 있음을 확인할 수 있었다(Table 3). 또한 시료 대조군인수삼추출물이 첨가되지 않은 균사체만의 심부 발효물로부터 분획된 조다당획분(HE-CP)의 경우에는 중성당이 78.
- 한편, 소장 내 중요한 국소 면역조직 중 하나인 Peyer’s patch를 경유한 조혈세포인 골수세포의 증식활성을 측정한 결과에서도, HE-GE-CP-5가 saline 대조군보다 1.83배의 높은 활성을 나타내어 생리활성 증진에 발효공정이 중요함을 확인할 수 있었다.
- 4B). 한편, 심부 발효 중산도 변화를 경시적으로 측정한 결과에서는 수삼추출물 1, 3 및 5% 첨가의 모든 군에서 배양 48시간까지는 산도가 감소되다가 그 이후에는 완만히 증가되는 경향을 보였으나, DO는 모든 군에서 서서히 감소되고 있음을 보여주었다(Table 2). 이상의 결과로부터 MCM 액체배지에 5% 수삼추출물을 첨가하여 배양한 노루궁뎅이 균사체의 발효 특성은 1% 또는 3% 첨가군과는 약간 다른 발효 양상을 보여주면서 가장 높은 균체량을 나타내었는데 이는 수삼추출물의 첨가량이 증가하면서 추출물에 함유된 당과 아미노산 등의 다양한 영양소 함량(C와 N의 급원)도 증가하는 것에 기인하는 것으로 추정된다.
- 4A). 한편, 이러한 배양을 통한 경시적인 pH 변화에서는 모든 군에서 배양 초기에는 pH가 완만히 상승하다가 배양 36시간 이후부터 HE-GE-1의 경우에는 서서히 pH가 감소하였으나, HE-GE-3과 5는 48시간 이후부터 감소하기 시작하였으며 HE-GE-5의 pH 변화는 다른 첨가군의 배양과는 달리 pH의 감소가 상대적으로 적음을 보여주었다 (Fig. 4B). 한편, 심부 발효 중산도 변화를 경시적으로 측정한 결과에서는 수삼추출물 1, 3 및 5% 첨가의 모든 군에서 배양 48시간까지는 산도가 감소되다가 그 이후에는 완만히 증가되는 경향을 보였으나, DO는 모든 군에서 서서히 감소되고 있음을 보여주었다(Table 2).
- 본 연구에서도 생리활성이 강화된 노루궁뎅이 버섯 균사체의 심부 발효물을 기능성 식품의 소재로 활용하기 위하여 수삼추출물이 첨가된 액체배지에서의 노루궁뎅이 균사체의 심부발효를 위한 생육조건을 검토하였다. 한편, 최적발효조건에서 수삼추출물이 첨가되지 않은 MCM 액체배지에서 배양된 노루궁뎅이 균사체의 MDW는 배양 10일 후에 5.72 g/L을 보였으나 동일 발효 조건에서 수삼추출물이 0.5% 첨가된 MCM 배지에서의 MDW는 증가하는 (5.91 g/L) 결과를 나타내어 식품소재로서의 대량생산 가능성도 충분함을 확인할 수 있었다.
- 50 L jar fermenter에서 최적 발효조건으로 수삼추출물이 첨가된 MCM에서 노루궁뎅이 버섯 균사체를 배양하면서 환원당과 MDW간의 경시적인 변화를 살펴본 결과, 배양시간의 경과에 따라 잔존 환원당으로 측정한 기질 소비는 배양시간 경과에 따라 감소하였으며, 교반 속도의 증가와 함께 기질소비는 비교적 증가하였다(data not shown). 한편, 탄소 원인 포도당의 감소와 함께 균사체는 증가하여 배양 5일 후 약 4.28 g/L의 최대 MDW을 나타내었으며 이후 이 수준을 유지하는 경향을 보였다. 교반 속도가 낮은 경우(100 rpm 이하)에는 생육 속도 및 최대 균체량도 낮았으며, 교반 속도가 높은 경우(150 rpm 이상)에는 생육 속도나 최대 균체량은 높았으나 최대값 도달 이후 균사체의 감소 현상을 보여 교반 속도는 120 rpm이 적당한 것으로 확인되었다(data not shown).
후속연구
- 또한 기본액체배지인 MCM에 수삼추출물을 첨가함으로써 MCM만의 균사체 발효물보다 면역활성이 증가됨도 확인하여 기능성 소재로서의 활용 가능성도 확인할 수 있었다. 따라서 생리활성을 함유하고 있는 유용균 사체와 수삼추출물의 액체 배양을 통한 심부발효물의 조제 및 기능성 소재로의 활용은 충분히 가능성이 있을 것으로 판단하고 산업적인 적용 및 기능성 식품 개발을 추진할 계획이다.
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