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문제 정의
- 본 연구에서는 이러한 약물들의 活血, 消腫, 止痛作用이 좌욕시 창상개선에 유의한 효과가 있을 것으로 여겨 동물실험을 통하여, 창상면적의 변화, 섬유아세포에서의 세포독성 검사 및 병리조직학적, 면역조직화학적 검사를 시행하였다.
- 이에 좌욕 시 창상치료에 도움을 줄 수 있을 것으로 보이는 楡根皮, 三七根 및 龍腦로 구성된 임상 활용 한약처방의 효과를 규명하기 위해 백서에서 창상면적의 측정, 세포독성검증, 병리조직학적 검사 및 면역화학적 검사를 시행하여 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 0.05 % 3,3' -diaminobenzidine (Sigma)과 0.01 % HCl 이 포함된 0.05M tris-HCl완충용액 (pH 7.4)에서 발색시킨 후, hematoxylin으로 대조염색하였다.
- MIP-2. FGF 분포변화를 통하여 한방 좌욕제의 항염증 및 상피재생효과를 확인하였다.
- Potarose 10% solution희석 용액을 실험적 창상 부위에 1일 1회 도포하였다.
- 각 치료제의 종류에 따라 창상 수축에 미치는 영향을 측정하기 위해 시술 후 17일간 창상의 면적을 측정하였다. 창상면적의 변화는 최초 창상에 대한 측정 창상의 면적을 백분율로 환산하여 시간 경과에 따른 수축율을 알아보았으며, 측정 방법은 창상 부위에 유지를 덧대고 창상 크기에 맞춰 작도한 후 측정 날짜 별 모든 창상크기와 2× 2㎠ 의 크기로 정사각형을 같이 촬영하여 Leica분석프로그램을 통해 상대적인 면적을 계산하였다.
- 창상부위 피부를 적출한 후 실온에서 24시간동안 10% paraformaldehyde에 고정하였다. 고정된 조직은 통상적인 방법으로 paraffin에 포매한 후 4㎛ 두께의 연속절편으로 제작되었다. 일반적인 형태변화를 관찰하기 위해 연속절편을 hematoxylin과 eosin에 염색한 후 광학현미경 (BX50.
- MTT assay는 우선 24 well plate에 primary fibroblast세포를 배양한 후, 여러 농도로 약재를 첨가하여 24시간동안 배양하였다. 그리고 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-tetra-zolium bromide (MTT. Sigma) 2mg/ml를 넣고, incubator에서 4시간 배양한 후 dimethylsulfoxide (DMSO; Sigma)로 용해시켜 580nm의 파장에서 microplate reader (Molecular devices, USA)로 흡광도를 측정하여 세포생존률을 계산하였다.
- 그리고 경추와 고관절 정중앙에 2× 2㎠ 의 크기로 정사각형을 작도하고 소독된 가위를 이용하여 근막 위까지 제거하여 전층 피부 결손창을 만들었다9).
- 동물을 각 군당 9-10마리씩 배정하여 대조군, 양성대조군, 실험군의 3개군으로 나누었다. 대조군은 창상 유발 후 아무런 치료를 하지 않았고, 양성대조군은 대조약을 창상 부위에 1일 1회 1ml씩 도포하였다. 또한 실험군은 한방 약재 추출물을 1일 1회 1ml씩 도포하였다.
- 동물을 각 군당 9-10마리씩 배정하여 대조군, 양성대조군, 실험군의 3개군으로 나누었다. 대조군은 창상 유발 후 아무런 치료를 하지 않았고, 양성대조군은 대조약을 창상 부위에 1일 1회 1ml씩 도포하였다.
- 대조군은 창상 유발 후 아무런 치료를 하지 않았고, 양성대조군은 대조약을 창상 부위에 1일 1회 1ml씩 도포하였다. 또한 실험군은 한방 약재 추출물을 1일 1회 1ml씩 도포하였다.
- 세포독성은 MTT (tetrazolium3-(4,5- dimethylthiazol- 2 - yl) -2, 5 - diphenyltetrazolium bromide, Sigma) assay 법으로 관찰하였으며, 각 약재에 의한 세포 독성을 관찰하기 위해 바르는 약재를 농도별 희석하여 처리 후 24시간 후에 세포 생존율을 관찰하였다. MTT assay는 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolum을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT formazan으로 환원시키는 세포의 능력을 이용하는 검사법이다.
- 시험약 구성 약물 중 楡根皮 160g과 三七根 64g을 물 2000cc로 2시간 전탕하여 1200cc의 약액으로 제조한 후 龍腦 6g을 녹여 조제하였다. 창상 도포 시 원액을 사용하였다.
- 양성대조군(Potarose 10% solution), 실험군(한방 좌욕제), 한방 좌욕제의 구성약물인 楡根皮, 三七根, 龍腦의 세포독성을 조사하기 위해서 fibroblast에 0.01, 0.1, 1, 10, 100 ㎕ 농도로 희석한 후 24시간 배양하여 MTT assay를 수행하였다.
- 고정된 조직은 통상적인 방법으로 paraffin에 포매한 후 4㎛ 두께의 연속절편으로 제작되었다. 일반적인 형태변화를 관찰하기 위해 연속절편을 hematoxylin과 eosin에 염색한 후 광학현미경 (BX50. Olympus, Japan)으로 관찰하였다.
- 창상면적의 변화는 최초 창상에 대한 측정 창상의 면적을 백분율로 환산하여 시간 경과에 따른 수축율을 알아보았으며, 측정 방법은 창상 부위에 유지를 덧대고 창상 크기에 맞춰 작도한 후 측정 날짜 별 모든 창상크기와 2× 2㎠ 의 크기로 정사각형을 같이 촬영하여 Leica분석프로그램을 통해 상대적인 면적을 계산하였다.
- 그리고 경추와 고관절 정중앙에 2× 2㎠ 의 크기로 정사각형을 작도하고 소독된 가위를 이용하여 근막 위까지 제거하여 전층 피부 결손창을 만들었다9). 창상이 유발된 백서들은 각 케이지에 한 마리씩 수용하여 매일 14-16시 사이에 치료하였다.
- 피부내 염증반응에 관여하는 macrophage inflammatory protein (MIP)-2분포 변화를 조사하기 위해 rabbit anti-mouse MIP-2 (1:100, Santa Cruz Biotec)항원을 이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 우선 절편을 10 mM Sodium citrate (pH 6.
- 한방좌욕제의 창상치유 및 동통 감소 효능을 검증하기 위해 백서의 등에 2×2㎠ 의 전층 피부결손창을 만들고 17일간 치료한 후 창상면적 측정, 세포생존율 측정 및 병리조직학적, 면역학적 검사를 하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 한편 창상 유발 피부에서 섬유모세포 성장인자 (fibroblast growth factor, FGF)활성을 통한 피부 상피세포의 증식 변화를 조사하기위해 goat anti-FGF (1:100, Santa Cruz Biotec, USA)항체를 이용한 면역조직화학적 염색을 위와 같은 방법으로 실시하였다.
대상 데이터
- 동물은 오리엔트바이오(Orient Bio)에서 구입한 수컷 Sprague-Dawley계 白鼠(200-220g)를 사용하였고, 일정한 온도(22 ± 1℃)와 습도(55 ± 1 %), 규칙적인 조명(12시간 light-dark cycle)이 자동적으로 조절되는 동물실에서 각 케이지당 한 마리씩 넣고 사료와 깨끗한 물을 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 일주일간의 적응기간을 거친 후 본 실험에 사용되었다.
- 따라서 산후 회음부 통증에 대한 외용 한약 처방의 개발이 필요한 것으로 판단되어 기획된 본 연구에 사용된 한방 좌욕제는 임상에서 유효한 효과가 있었던楡根皮, 三七根, 龍腦의 3가지 한약재로 구성되어 있다.
- 시험약 구성 약물 중 楡根皮 160g과 三七根 64g을 물 2000cc로 2시간 전탕하여 1200cc의 약액으로 제조한 후 龍腦 6g을 녹여 조제하였다. 창상 도포 시 원액을 사용하였다.
데이터처리
- 모든 측정값은 평균값 ± 표준오차(mean ± S.D.)로 표시하였고, 각 실험군간의 통계학적 분석은 window용 SPSS Program의 one-way ANOVA를 시행하였으며, 사후 검증은 Tukey test를 통해 검증하였다.
이론/모형
- The cell viability was measured by MTT assay.
성능/효과
- 1. 한방좌욕제의 창상면적의 개선 평가 실험 결과, 10일째에는 실험군(한방 좌욕제)에서만 유의한 효과를 나타내 었고, 17일째에는 양성대조군, 실험군 모두 유의한 효과가 있었다.
- 2. 한방좌욕제는 1 ㎕ 까지는 87% 이상의 세포생존도를 나타내었고, 10㎕ 에 세포생존도가 다소 감소했으나 100㎕ 에서는 70%로 세포생존도가 오히려 더 올라가는 것으로 나타났다. 한방좌욕제의 구성 약재 모두 세포독성은 관찰되지 않았다.
- fibroblast에 대한 三七根의 세포독성은 세포만 배양한 대조구(C)의 세포 생존도 100 %를 기준으로 0.01, 0.1, 1, 10, 100 ㎕ 농도에서 각각 101.9 ± 3.1 %, 99.6 ± 7.0 %, 89.0 ± 2.8 %, 72.0 ± 2.1 %, 65.3 ± 4.2 %로 측정되었다.
- fibroblast에 대한 楡根皮의 세포독성은 세포만 배양한 대조구(C)의 세포 생존도 100 %를 기준으로 0.01, 0.1, 1, 10, 100 ㎕ 농도에서 각각 104.5 ± 2.5 %, 100.2 ± 3.5 %, 84.4 ± 4.4 %, 68.8 ± 2.4 %, 84.8 ± 4.5 %로 측정되었다.
- fibroblast에 대한 龍腦의 세포독성은 세포만 배양한 대조구(C)의 세포 생존도 100 %를 기준으로 0.01, 0.1, 1, 10, 100 ㎕ 농도에서 각각 102.7 ± 5.1 %, 102.0 ± 1.2 %, 105.5 ± 1.3 %, 106.6 ± 3.6 %, 94.6 ± 6.1 %로 측정되었다.
- 동물실험결과, 창상유발 10일째에 양성대조군은 창상면적이 감소하였지만 통계적으로 유의성이 없던 반면, 실험군 (한방좌욕제)의 창상면적은 통계적으로 유의성 있게 감소하였다(p=.000). 그러나 창상유발 17일째에는 양성대조군과 실험군 모두 유의한 창상면적의 개선이 있었다(p=.
- 6 %로 측정되었다. 따라서 1 ㎕ 까지는 87 % 이상의 세포생존율을 나타내었고, 10 ㎕에 세포생존율이 다소 감소했으나 100 ㎕ 에서는 70 %로 세포생존율이 오히려 더 올라가는 것으로 나타났다(Fig. 3).
- 따라서 치료 10일째에는 실험군(한방 좌욕제)이 양성대조군에 비해 창상치유 효과가 더 우수하였으나, 시간경과에 따른 자연적 치료결과가 중첩되었을 것으로 보이는 17일째에는 양성대조군에서도 유사한 치유 효과를 보이는 것으로 생각되었다(Table 1, Fig. 1).
- 피부내 염증반응에 관여하는 MIP-2 양성반응 실험에서 양성대조군과 실험군 모두 대조군에 비해 MIP-2 양성반응세포가 유의하게 감소하였으나, 실험군(한방좌욕제)이 양성대조군에 비하여 더 유의성 있게 MIP-2 양성반응세포가 감소하였다. 따라서, 실험군이 염증사이토카인의 생성을 억제함으로 항염증효과작용을 나타냄을 알 수 있었다. 또한 양성대 조군과 실험군 모두 대조군에 비해 FGF 양성반응이 더 증가하였지만, 특히 실험군은 양성대조군에 비해서 더 유의한 FGF 양성반응의 증가가 관찰된 것으로 보아 실험군은 섬유모세포성장인자의 활성으로 인하여 보다 빠른 손상의 회복이 가능함을 확인 할 수 있었다.
- 따라서, 실험군이 염증사이토카인의 생성을 억제함으로 항염증효과작용을 나타냄을 알 수 있었다. 또한 양성대 조군과 실험군 모두 대조군에 비해 FGF 양성반응이 더 증가하였지만, 특히 실험군은 양성대조군에 비해서 더 유의한 FGF 양성반응의 증가가 관찰된 것으로 보아 실험군은 섬유모세포성장인자의 활성으로 인하여 보다 빠른 손상의 회복이 가능함을 확인 할 수 있었다.
- 모든 군에서 시간이 지남에 따라 창상면적이 감소하면서 회복되는 소견을 보였다. 창상 유발 10일째, 대조군의 창상면적은 341.
- 4 % 가 감소하였다. 실험군과 양성대조군은 대조군에 비해 통계적으로 유의한 효과가 있었으며(p=.001), 실험군과 양성대조군의 효과 간에는 통계적인 차이가 없었다(p=.3).
- 실험군에서는 농도가 0.01, 0.1, 1, 10, 100 ㎕ 일때 세포활성도가 각각 102.5 ± 8.6 %, 100.0 ± 3.6 %, 87.6 ± 2.3 %, 60.4 ± 2.2 %, 70.0 ± 3.6 %로 측정되었다.
- 7 % 가 감소하였다. 실험군은 양성대조군에 비해 신속한 치료효과를 나타내었고, 대조군에 비하여 통계적으로 유의한 창상면적 감소를 나타내었다(p=.000). 실험군과 양성대조군간에는 유의한 차이가 없었다.
- 001). 조직학적 관찰에서도, 양성대조군과 비교하여, 실험군(한방좌욕제)은 상피세포 과형성이 남아 있었지만 정상 조직과 유사한 상피의 층서적 구조(lamella structure)가 확인되었으며, 섬유모세포에 대한 세포독성 검증에서는 실험군(한방좌욕제)은 복합제제 뿐만 아니라 각각의 구성약물 모두가 세포독성이 적으며 안전함을 나타내었다.
- 5 %로 측정되었다. 즉 楡根皮는 fibroblast에 대해 100 ㎕의 농도까지 세포독성이 없는 것으로 나타났다(Fig. 4).
- 1 % 로 측정되었다. 즉 양성대조군은 0.1 ㎕ 까지는 세포독성을 나타내지 않으나, 1 ㎕ 부터는 세포독성이 나타나고 10 ㎕에서는 세포독성이 급격히 심해지는 것으로 나타났다(Fig. 2).
- 창상 유발 10일째, 대조군의 창상면적은 341.45 ± 84.92㎟ 로 14.7 % 가 감소하였고, 양성대조군은 259.92 ± 98.77㎟ 로 35.4 % 가 감소하였으며, 실험군은 169.90 ± 57.58㎟ 로 57.7 % 가 감소하였다.
- 창상 유발 17일째, 진피유두 모세혈관 주변 세포에서 관찰된 MIP-2 양성반응을 보이는 세포는 대조군에 비교하여 양성대조군과 실험군 모두 유의하게 감소하였으며(p<0.001), 실험군은 양성대조군과 비교했을 때에도 통계적으로 유의한 MIP-2 양성반응 세포의 감소가 있었다(p<0.05)(Table 2, Fig. 8).
- 창상 치유 17일째 상피기저층과 진피 유두에서 관찰되는 FGF 양성반응을 보이는 세포는 대조군에 비교하여 양성대조군과 실험군 모두 유의하게 증가하였으며 (p<0.001), 실험군은 양성대조군과 비교했을 때에도 통계적으로 유의한 FGF 양성반응세포의 증가가 있었다(p<0.05)(Table 3, Fig. 9).
- 창상을 유발한 후 17일에 각 군의 피부조직을 절개하여 hematoxylin과 eosin으로 염색한 결과 대조군(비처리군)에서는 피부 상피세포 과형성과 다량의 염증세포가 창상 유발 피부 중심부에 아직 남아 있는 것으로 관찰되었다. 양성대조군(Potarose 10% solution)에서는 피부 상피세포 과형성이 관찰되었고, 적혈구와 염증세포가 일부 진피와 표층에서 발견되었으며, 기저막 손상이 관찰되었다.
- 피부내 염증반응에 관여하는 MIP-2 양성반응 실험에서 양성대조군과 실험군 모두 대조군에 비해 MIP-2 양성반응세포가 유의하게 감소하였으나, 실험군(한방좌욕제)이 양성대조군에 비하여 더 유의성 있게 MIP-2 양성반응세포가 감소하였다. 따라서, 실험군이 염증사이토카인의 생성을 억제함으로 항염증효과작용을 나타냄을 알 수 있었다.
후속연구
- 이는 산욕초기의 산모의 회음부 통증 및 불편감 완화에 한방 좌욕제가 염증을 완화시키고 피부재생에 유의한 효과를 발휘하고 세포독성이 기존 양방 소독제에 비해 적음을 유추할 수 있다. 이 결과는 임상시험을 위한 기초적 단계를 마련했다는 것에 의의를 둘 수 있으며 향후 이를 토대로 하여 대조군 설정을 통한 대규모 임상연구가 연계되어야 할 것이다.
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