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문제 정의
- 우슬에 대한 실험연구로는 LPS 유도 염증성 관절염 생쥐에서 우슬 약침의 세포성 면역반응 억제효과14,15), 산화억제효과16), 항균효과17), Carrageenan으로 유발한 관절염 흰쥐에서의 항염증효과18), 파골세포 분화와 골흡수 억제효과19,20), 혈행개선효과21)가 보고되었다. 본 연구에서는 우슬 물추출물의 콜라겐 유입으로 류마티스 관절염 생쥐(collagen-induced arthritis; CIA mouse model)에서의 관절 활막 내 염증반응 억제 및 관절조직 보호효과를 확인하였다.
- 본 연구에서는 우슬(Achyranthes japonica)의 콜라겐 유도 관절염 생쥐(mouse)에 대한 개선효과를 확인하였다.
- . 본 연구에서도 우슬 물추출물의 항류마티스 관절염 효과를 확인하기 위해 CIA 생쥐 모델을 제작하였다.
- 이에 저자는 우슬의 관절염에 미치는 효능을 실험적으로 증명하고자, 우슬의 물추출물을 제조하여 콜라겐 유입에 의해 관절염이 유발된 생쥐(collagen-induced arthritis; CIA mice)에 투여하여 류마티스 관절염과 관련된 여러 병리학적 변화를 관찰한 결과 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- TNF-α의 측정은 3회 시행하여 평균값을 얻었으며, 여기에서 얻은 흡광도를 통해 TNF-α의 표준농도곡선에 대입하여 혈청 내 TNF-α의 농도를 계산하였다.
- 1점과 2점은 주로 가역성(reversible)의 부종성 염증(edematous inflammation)을 동반하며, 3점은 비가역성(irreversible)의 이미 관절염이 진행된 관절 강직(joint anklylosis)를 나타낸다. 관절염의 평가는 실험군과 대조군에 대해 알고 있지 않은 두 명의 관찰자가 참여하여 관찰자에 따른 오차를 최소화하였다.
- 또한 14일 후 동일 방법으로 제조된 콜라겐 용액에 Freund's incomplete adjuvant를 동량으로 혼합하여 생쥐의 뒷다리 족근골에 피하주사함으로써 관절염을 유발하였다(Fig. 1).
- 모든 실험동물은 고형사료와 물을 제한 없이 공급하였으며, 일정한 온도(23±3℃)와 습도(50±10%) 및 12시간 낮과 밤의 주기를 유지하여 사육하였다.
- 발 관절염은 28일부터 48일까지 매주 한번 관찰하였으며, 관절염 정도(clinical severity)를 William 등22)에 의한 관절염 육안평가방법(rheumatoid scoring system)을 이용하여 평가하였다. 즉, 부종이나 발적, 종창 등 관절염의 증거가 없는 경우 0 (normal), 한 두 개의 발가락 종창을 동반한 홍조를 띄거나 최소한의 종창이 유발된 상태로 족근골이나 발목 관절에 국한된 경한 부종과 발적이 있는 경우 1점(slight swelling and/or erythema of the fingers), 확실한 홍조를 띄거나 국부적 상지 종창, 그리고 자유로이 발을 이용하지 못하는 상태, 발목 관절에서 족근골에 걸친 중증도의 부종과 발적이 있는 경우 2점(pronounced edematous swelling), 무릎까지의 상당한 부종과 종창이 관찰되고 자유로이 발을 이용하지 못하는 상태로 발목에서 발가락 전체에 걸쳐 부종과 발적이 있는 경우 3점(joint rigidity with edematous swelling or joint ankylosis)으로 하여 점수를 측정하였다.
- 실험군은 생쥐(DBA1/J) 10마리를 한 군으로 하여 관절염을 유발시키지 않은 정상 대조군(normal control), 관절염을 유발시킨 대조군(CIA control) 및 우슬 물추출물을 투여한 약물군(CIA+AR-EE) 및 대조약물로 비선택적 COX-2 억제제이며 항염증제인 indomethacin을 투여한 약물 대조군(CIA+Indomethacin)으로 나누었다.
- 약물의 투여는 우슬 물추출물 50, 100 ㎎/㎏/bw 또는 indomethacin 1 ㎎/㎏/bw를 CIA를 유발한 후 28일부터 48일까지 4주 동안 매일 1회, 정해진 시간에 경구 투여하였으며, 49일에 모든 실험동물을 희생시켜 관절염 개선 정도를 평가하였다.
- 이를 Ellman's reagent 용액으로 발색시킨 후 microplate reader의 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 여러 농도의 PGE2 표준액(1,000, 500, 250, 125, 62, 31, 16, 8 pg/ml)의 흡광도를 함께 측정하고, 4-parameter logistic 방정식인 Y(흡광도) = {(A-D)/[1+(검액의 농도(x)/C)^B]}+D를 이용하여 혈청 내 PGE2의 농도를 계산하였다.
- 제작한 파라핀 조직표본은 xylene, 무수알코올, 50% 알코올 순으로 탈 파라핀 과정을 거친 후 Hematoxylin & eosin(H&E) 염색시약으로 염색하여 광학현미경 하에 관절조직의 형태변화를 관찰하였다.
- 에 의한 관절염 육안평가방법(rheumatoid scoring system)을 이용하여 평가하였다. 즉, 부종이나 발적, 종창 등 관절염의 증거가 없는 경우 0 (normal), 한 두 개의 발가락 종창을 동반한 홍조를 띄거나 최소한의 종창이 유발된 상태로 족근골이나 발목 관절에 국한된 경한 부종과 발적이 있는 경우 1점(slight swelling and/or erythema of the fingers), 확실한 홍조를 띄거나 국부적 상지 종창, 그리고 자유로이 발을 이용하지 못하는 상태, 발목 관절에서 족근골에 걸친 중증도의 부종과 발적이 있는 경우 2점(pronounced edematous swelling), 무릎까지의 상당한 부종과 종창이 관찰되고 자유로이 발을 이용하지 못하는 상태로 발목에서 발가락 전체에 걸쳐 부종과 발적이 있는 경우 3점(joint rigidity with edematous swelling or joint ankylosis)으로 하여 점수를 측정하였다. 1점과 2점은 주로 가역성(reversible)의 부종성 염증(edematous inflammation)을 동반하며, 3점은 비가역성(irreversible)의 이미 관절염이 진행된 관절 강직(joint anklylosis)를 나타낸다.
- 콜라겐 주입에 의해 관절염이 유발된 동물에서 나타나는 관절염의 발병도(clinical severity)에 대한 우슬 물추출물의 효과를 확인하기 위해 콜라겐 주입 후 28일부터 48일까지 매주 1회 관절염 지수(arthritis score)를 평가하였다.
- 콜라겐 주입에 의해 관절염이 유발된 동물에서 다량 생성되는 염증물질인 PGE2에 대한 우슬 물추출물의 효과를 조사하기 위해서 효소면역반응법으로 혈청 내 PGE2의 양을 측정하였다.
- 콜라겐 주입에 의해 류마티스 관절염이 유발된 생쥐에서 나타나는 족근관절의 손상에 대한 우슬 물추출물의 효과를 조사하기 위해서 실험 49일째 모든 동물을 희생시킨 후 우측 족근관절이 포함되도록 경골 원위부에서 중족골 원위부 사이를 적출하여 파라핀 조직표본을 제작하였다.
- 실험 49일째 모든 실험동물을 희생시킨 후 우측 족근관절이 포함되도록 경골 원위부에서 중족골(metatarsal) 원위부(distal) 사이를 적출하고 10% 중성 포르말린용액(formaldehyde)에 4℃에서 24시간 고정한 후 20% fermic acid에 3일간 침지하여 탈회하였다. 탈회된 조직을 24시간 수세하여 조직 내 남아있는 포르말린을 제거한 후, 50% 알코올에서부터 무수알코올까지 농도 상승순으로 탈수하고 자일렌(xylene)으로 치환하였다. 파라핀 침투과정을 거친 후 포매하여 파라핀 블록을 제작하였으며 회전형 박절기(microtome)를 사용하여 5 ㎛두께로 자른 뒤 슬라이드 위에 놓아 조직표본을 제작하였다.
- 탈회된 조직을 24시간 수세하여 조직 내 남아있는 포르말린을 제거한 후, 50% 알코올에서부터 무수알코올까지 농도 상승순으로 탈수하고 자일렌(xylene)으로 치환하였다. 파라핀 침투과정을 거친 후 포매하여 파라핀 블록을 제작하였으며 회전형 박절기(microtome)를 사용하여 5 ㎛두께로 자른 뒤 슬라이드 위에 놓아 조직표본을 제작하였다.
- 그 후 각 well에 peroxidase-conjugated antimouse IgG를 넣어 2시간 동안 반응시킨 후 5-aminosalicylic acid를 넣어 반응을 종료시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 항collagen 항체치 측정은 3회 시행하여 평균값을 얻었으며, 여기에서 얻은 흡광도를 anti-CⅡ IgG의 표준농도곡선에 대입하여 혈청 내 농도를 계산하였다.
- 혈청 내 PGE2의 양은 enzyme immunoassay(EIA)을 이용하여 측정하였다. 즉, PGE2 EIA kit의 96-well plate에 표준액 및 검액을 분주한 후 PGE2 AChE Tracer와 PGE2 monoclonal antibody 용액을 분주하여 4℃에서 24시간 반응시켰다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 우슬(토우슬;Achyranthes japonica의 뿌리, Achyranthis Radix; AR)은 (주)광명당제약(울산, 한국)으로부터 구입하였으며, 동국대학교 한의과대학 본초학교실에서 검정하고 정선한 것을 사용하였다.
- 실험동물은 7~8주령의 DBA/1J계 수컷 생쥐(mouse, 20~25 g)를 (주)오리엔트바이오(경기도, 한국)으로부터 구입하였다. 모든 실험동물은 고형사료와 물을 제한 없이 공급하였으며, 일정한 온도(23±3℃)와 습도(50±10%) 및 12시간 낮과 밤의 주기를 유지하여 사육하였다.
- 실험에 사용되어진 기기로는 Microplate Reader(Asys, Sunnyvale, CA, USA), Rotary Evaporator(Eyela, Japan), Orbital Shaker(Finemould Precision IN, Co., Gyenggi-do, korea), Microscopy(Olympus Imaging America Inc., Center Valley, PA 18034-0610, USA) 등을 사용하였다.
- 실험에 사용되어진 시약은 collagen(type Ⅱ, Sigma-Aldrich, St Louse, CA, USA), Complete Freund's adjuvant(Sigma-Aldrich), H&E stain kit(Thermo Fisher Scientific Inc., MA, USA), Collagen Type Ⅱ Antibody ELISA kit(MD Bioproduct, Division of MD Biosciences Inc., St Paul, MN, USA), PGE2 EIA kit(Cayman, MA, USA), DuoSet mTNF-α ELISA Development System(R&D System, Inc., MN, USA) 등을 사용하였다.
- 우슬은 국내에서는 쇠무릅(Achyranthes japonica)을 사용하고 중국에서는 懷牛膝(Achyranhes bidentatae Blume)과 川牛膝(Cyathula officinalis Kuan)을 사용한다. 우슬은 한의학에서 관절염 치료에 대표적인 약재로 사용하며 强筋骨하는 작용이 있다고 보고 있다.
데이터처리
- 결과는 3회 반복실험에 대한 평균과 표준편차(mean±SD)로 나타내었으며, 통계학적 유의성 검증은 GraphPad Prism 5.0 분석프로그램의 one-way ANOVA, Tukey's test를 이용하였고, p값이 0.05 이하인 경우 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 모든 실험동물은 고형사료와 물을 제한 없이 공급하였으며, 일정한 온도(23±3℃)와 습도(50±10%) 및 12시간 낮과 밤의 주기를 유지하여 사육하였다. 생쥐의 관리, 사용 및 취급은 미국 NIH 기준과 대한의학회 제정 동물실험지침(2000년)에 준하여 시행하였다.
- 콜라겐 주입에 의해 관절염이 유발된 동물에서 나타나는 콜라겐 항원에 대한 특이적 항체인 항collagen 항체에 대한 우슬 물추출물의 효과를 조사하기 위해서 ELISA 방법으로 혈청 내 anti-CⅡ IgG의 양을 측정하였다.
- 콜라겐 주입에 의해 관절염이 유발된 동물에서 다량 생성되는 염증사이토카인인 TNF-α에 대한 우슬 물추출물의 효과를 조사하기 위해서 ELISA 방법으로 혈청 내 TNF-α의 양을 측정하였다.
- 혈청 내 TNF-α의 양은 ELISA 방법으로 TNF-α ELISA kit를 이용하여 측정하였다.
- 혈청 내 항콜라겐 항체의 함량은 ELISA 방법으로 anti-C Ⅱ IgG ELISA kit를 이용하여 측정하였다. 즉 96 well polystyrene microplate(Nunc, Denmark)의 각 well에 0.
성능/효과
- 1. 우슬 물추출물은 콜라겐 유도 관절염 생쥐에서 관절염 지수를 시간에 의존하여 유의적으로 감소시켰다.
- 2. 우슬 물추출물은 콜라겐 유도 관절염 생쥐의 혈청 내 항콜라겐 항체, PGE2, TNF-α의 생성과 분비를 유의적으로 감소시켰다.
- 3. 우슬 물추출물은 콜라겐 유도 관절염 생쥐의 관절조직에서 관절염으로 인한 염증세포 침윤과 활막의 비후를 감소시켰다.
- 결론적으로 본 연구를 통해 토우슬(Achyranthes Japonica)은 콜라겐 유도 류마티스 관절염 생쥐에서 관절의 파괴와 손상을 줄이고, 활막염을 유발하는 염증물질들의 분비를 억제함으로써 류마티스 관절염을 효과적으로 개선시킬 수 있는 것으로 나타났다. 우슬은 임상에서 각 종 골 질환에 우수한 효과를 보이는 약재로 널리 쓰이고 있으며 본 연구를 통해 우슬 물추출물이 류마티스 관절염을 유발하는 관절활막세포에서 염증반응을 효과적으로 억제함으로써 염증성 골 파괴를 막고 관절 조직을 보호할 수 있음을 알 수 있었다.
- 그 결과, CIA 대조군에서는 실험 28일부터 48일까지 관절염의 지수가 시간에 의존적으로 증가하였으나, 우슬 물추출물(AR-W)을 50, 100 ㎎/㎏ 농도로 경구 투여한 약물군은 CIA 대조군에 비해 유의적으로 감소되었다(Fig. 2). 또한 양성대조약물인 Indomethacin 투여군에서도 우슬 물추출물 100 ㎎/㎏ 투여군과 유사하게 CIA 대조군에 비해 유의적으로 관절염 지수가 감소되었다.
- 그 결과, 정상대조군에서는 103.5± 11.58 pg/㎖, CIA 대조군에서는 800.7± 53.09 pg/㎖, 우슬 물추출물(AR-W)을 50과 100 ㎎/㎏ 투여한 군에서는 각각 643.2± 99.51 pg/㎖, 268.1± 27.61 pg/㎖으로 우슬 물추출물 100 ㎎/㎏ 투여군에서 대조군에 비하여 PGE2가 유의적으로 감소하였다(Fig. 4).
- 그 결과, 정상대조군에서는 142.6± 0.94 mU, CIA 대조군에서는 714.7± 44.09 mU, 우슬 물추출물(AR-W)을 50과 100 ㎎/㎏ 투여한 군에서는 각각 605.4± 20.83 mU, 436.7± 8.54 mU으로 우슬 물추출물 투여군은 대조군에 비하여 모두 유의적으로 감소하였다(Fig. 3).
- 그 결과, 정상대조군에서는 42.51± 0.78 ng/㎖, CIA 대조군에서는 78.72± 9.62 ng/㎖, 우슬 물추출물(AR-W)을 50과 100 ㎎/㎏ 투여한 군에서는 각각 38.41± 10.9 ng/㎖, 33.63± 9.24 ng/㎖으로 우슬 추출물 100 ㎎/㎏ 투여군에서 대조군에 비하여 TNF-α가 유의적으로 감소하였다(Fig. 5).
- 따라서 우슬은 콜라겐 유도 관절염 생쥐에서 자가항체와 염증물질의 생성을 억제함으로써 항관절염 효능이 인정되었으며, 이는 우슬이 사람의 관절염 질환 개선을 위한 약물로도 활용할 수 있음을 의미한다.
- 먼저, 생쥐의 족근관절을 Hematoxylin과 Eosin으로 염색하여 구조적 변화를 관찰한 결과, 대조군(CIA)에서는 특이적으로 관절 주위의 부종과 다형 백혈구, 림프구 등의 침윤이 현저하게 관찰되었으며 활막의 염증(synovial inflammation), 비후와 더불어 현저한 관절면의 연골손실(bone erosion)을 관찰할 수 있었다(Fig. 6). 이에 반하여 우슬 물추출물(AR-W)을 50, 100 ㎎/㎏ 투여한 군에서는 대조군에 비해서 모두 염증세포의 침윤과 활막의 비후가 억제되었으며 관절면의 연골손실이 줄어들었고 골 파괴도 개선된 것이 관찰되었다.
- COX-2에 의해 합성되는 prostaglandin으로 PGE2와 PGI2가 있으며, PGE2는 결합하는 수용체에 따라 혈관확장(EP2, EP4), 혈관축소(EP1, EP3) 작용이 있고 발열(EP3)에도 중요한 작용을 하며 골 흡수를 촉진하는 작용이 강하여 골다공증을 유발하는 주요인자로도 알려져 있다30). 본 연구에서 우슬 물추출물은 CIA 생쥐의 혈청 내 PGE2의 농도를 유의적으로 감소시켰으며, 이는 우슬이 류마티스 관절염 발달 시 관절 활막 내 PGE2의 생성을 억제함으로써 염증발달을 막을 수 있음을 의미한다.
- 본 연구에서 우슬 물추출물은 CIA 생쥐의 혈청에서 TNF-α의 생성을 유의적으로 감소시켰다.
- . 본 연구에서 우슬 물추출물의 투여는 CIA 생쥐의 혈청 내 항콜라겐 항체의 생성을 유의적으로 감소시켰으며, 이는 우슬이 류마티스 관절염 발달 시 자가항체 생산 반응을 조절함으로써 질환의 발달을 막을 수 있음을 의미한다.
- 결론적으로 본 연구를 통해 토우슬(Achyranthes Japonica)은 콜라겐 유도 류마티스 관절염 생쥐에서 관절의 파괴와 손상을 줄이고, 활막염을 유발하는 염증물질들의 분비를 억제함으로써 류마티스 관절염을 효과적으로 개선시킬 수 있는 것으로 나타났다. 우슬은 임상에서 각 종 골 질환에 우수한 효과를 보이는 약재로 널리 쓰이고 있으며 본 연구를 통해 우슬 물추출물이 류마티스 관절염을 유발하는 관절활막세포에서 염증반응을 효과적으로 억제함으로써 염증성 골 파괴를 막고 관절 조직을 보호할 수 있음을 알 수 있었다. 이 결과를 통해 최근 가속화되고 있는 고령화 사회 속에서 우슬이 류마티스 관절염을 비롯하여 각 종 관절질환의 예방 및 치료제 개발에 중요한 후보 약물이 될 수 있을 것으로 사료된다.
- . 우슬은 파골세포 분화와 골흡수를 억제하고 골손실(bone loss)을 막음으로써 골다공증에 효과가 있는 것으로 보고되어 있으며18-20), 본 연구에서 우슬은 콜라겐 유도 관절염 생쥐에서 족근 관절 주위의 부종과 다형 백혈구, 림프구 등의 침윤을 막고 활막의 염증과 비후를 억제하였고, 관절면의 연골손실을 줄임으로써 연골보호를 통해 관절염 개선효과를 나타내었다. 한편 류마티스 관절염은 염증 뿐 아니라 골 파괴를 특징으로 하는 질환으로 골 파괴로 인한 관절의 변형이 환자들에게 불편함을 주기 때문에 중요한 치료 목표 중 하나가 뼈를 보호하여 관절의 기능을 유지하게 하는 것인데, 일반적으로 H&E 염색은 관절 연골 세포의 형태학적 변화를 볼 수 있었다.
- 6). 이에 반하여 우슬 물추출물(AR-W)을 50, 100 ㎎/㎏ 투여한 군에서는 대조군에 비해서 모두 염증세포의 침윤과 활막의 비후가 억제되었으며 관절면의 연골손실이 줄어들었고 골 파괴도 개선된 것이 관찰되었다.
후속연구
- 우슬은 임상에서 각 종 골 질환에 우수한 효과를 보이는 약재로 널리 쓰이고 있으며 본 연구를 통해 우슬 물추출물이 류마티스 관절염을 유발하는 관절활막세포에서 염증반응을 효과적으로 억제함으로써 염증성 골 파괴를 막고 관절 조직을 보호할 수 있음을 알 수 있었다. 이 결과를 통해 최근 가속화되고 있는 고령화 사회 속에서 우슬이 류마티스 관절염을 비롯하여 각 종 관절질환의 예방 및 치료제 개발에 중요한 후보 약물이 될 수 있을 것으로 사료된다.
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