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문제 정의
- 따라서 본 연구는 인 축적 균으로 알려진 균주 중 Pseudomonas sp.의 인 축적 능력을 평가 및 폐수 내 중금속(Cu, As, Zn, Ni, Cd)이 실제로 인 축적 세균의 생장 및 인 축적능력에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 수행되었다.
제안 방법
- 를 실험에 사용된 5개의 중금속 구리, 비소, 아연, 니켈 그리고 카드뮴이며 각 중금속 별 생장이 저해될 것이라 기대되는 농도에 따라 처리한 후 30℃, 120 rpm에서 진탕 배양 하였으며 배양시간은 총 48시간이었다. 5개의 중금속별로 각 각의 농도를 처리한 배지에 미생물 5 mL을 접종하여 바로 0.20 um micro filter로 여과한 후 여액을 micro tube에 담아 초기농도로 하였다. 시료채취는 12시간 단위로 채취하였다.
- 제조된 실험용 액체 배지에 미리 고체 배양된 Pseudomonas sp.균을 백금이로 따서 접종한 후 30℃에서 진탕배양 하여 실험 배지에 적응기간을 두었다.
- 모든 실험은 3반복하였다. 균의 생장은 3개의 처리구를 균이 최대로 생장하여 정지기에 도달 할 때 까지 분광광도계로 550 nm에서 2시간 간격으로 측정하였다. 인 축적 능력을 평가하기 위한 실험에서 초기 인 농도는 각 각 멸균한 실험 배지에 균을 접종한 후 바로 0.
- 배양액의 생장률은 흡광도값에 자연대수를 취한 값을 시간별로 최소 제곱 추정에 의한 선형 회귀식으로 계산하였다. 균의 생장이 이루어 지지 않은 초기 값은 제거하였고 균의 시간별 각 생장비율 값은 상관계수(r)값이 0.95또는 그보다 높은 값이 될 수 있도록 최소 5개의 data값을 기초로 하였다.
- 실험은 250 mL 삼각 플라스크안에 실험배지 195 mL을 넣고 각 각의 중금속 농도를 처리하여 121℃에서 15분간 고압 멸균하여 준비한 실험배지에 미리 액체 배양시킨 Pseudomonas sp.를 5 mL 접종한 후 초기 농도를 석영셀을 이용하여 분광광도계에서 550 nm로 측정하였으며 총 48시간동안 균의 생장이 일어나는 지점까지 2시간 단위로 측정하였다.
- 계산식에서 μcontrol은 각각의 중금속을 처리하지 않은 배지에서 자란 균의 시간에 따른 생장속도를 말하며 μheavy metals은 각 각의 중금속 농도별로 처리된 배지에서 자란 균의 시간에 따른 생장속도를 의미한다. 반 생장 농도(IC50)값을 구하기 위한 log gamma분포는 생장 저해 data를 fitting하여 결정하였으며 log gamma 분포로부터 각 각의 중금속에 대한 균의 생장의 반 생장 농도(IC50)값을 계산하였다.
- 15,000 rpm에서 원심 분리하여 생긴 침전물을 채취하여 실험용배지에 접종한 후 121℃에서 15분간 고압 멸균시켜 만든 처리구(dead cell), 실험용 배지에 이틀간 배양한 Pseudomonas sp.배양액을 5 mL접종하여 처리한 실험 처리구(live cell)로 나누어 실험하였다. 모든 실험은 3반복하였다.
- 처리농도는 각 중금속이 미생물 생장에 영향을 미칠 것이라 기대되는 농도로 처리하였다. 실험에 사용된 처리구는 중금속을 처리하지 않은 대조구와 중금속을 5개의 농도별로 처리한 처리구로 나누어 실험을 실시하였다. 중금속 처리농도는 구리가 1, 1.
- 5, 3 mg/L이고 비소의 경우 25, 50, 75, 100, 125 mg/L으로 처리하였다. 아연의 경우 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2 mg/L으로 처리하였으며 니켈의 경우 1, 2, 3, 4, 5 mg/L으로 처리되었다. 마지막으로 카드뮴의 경우 0.
- 을 5 mL접종하여 균이 최대로 생장하여 정지기에 도달 할 때 까지 분광광도계로 550 nm에서 2시간 간격으로 측정하였다. 온도 조건은 25℃, 30℃, 35℃로 하였다.
- 만 처리한 무처리구, Pseudomonas sp.와 중금속을 농도별로 처리한 처리구로 나누어 실험하였다. 처리농도는 각 중금속이 미생물 생장에 영향을 미칠 것이라 기대되는 농도로 처리하였다.
- 의 생장 특성 실험은 250 mL 삼각플라스크에 실험배지 195 mL을 넣고 미리 액체 배양한 Pseudomonas sp.을 5 mL접종하여 균이 최대로 생장하여 정지기에 도달 할 때 까지 분광광도계로 550 nm에서 2시간 간격으로 측정하였다. 온도 조건은 25℃, 30℃, 35℃로 하였다.
- 의 세포표면흡착에 의해 일어나는지 아니면 세포 내 축적에 의해 일어나는지 알아보기 위해 Pseudomonas sp.을 사멸 시킨후 접종한 처리구(dead cell)와 살아있는 균을 접종한 처리구(live cell)로 처리한 실험으로 나뉘어 실시하였다. 온도에 따른 Pseudomonas sp.
- 균의 생장은 3개의 처리구를 균이 최대로 생장하여 정지기에 도달 할 때 까지 분광광도계로 550 nm에서 2시간 간격으로 측정하였다. 인 축적 능력을 평가하기 위한 실험에서 초기 인 농도는 각 각 멸균한 실험 배지에 균을 접종한 후 바로 0.20 um의 membrane filter로 여과한 여액을 micro tube에 2 mL씩 담아 채취하였고 총 48시간 동안 균의 생장이 지체된 시간을 제외하고 균이 생장하기 시작한 시간부터 4시간 단위로 배지를 filtering하여 인 농도 측정에 사용할 시료를 채취하였다.
- 실험에 사용된 처리구는 중금속을 처리하지 않은 대조구와 중금속을 5개의 농도별로 처리한 처리구로 나누어 실험을 실시하였다. 중금속 처리농도는 구리가 1, 1.5, 2, 2.5, 3 mg/L이고 비소의 경우 25, 50, 75, 100, 125 mg/L으로 처리하였다. 아연의 경우 0.
대상 데이터
- 본 연구에 사용한 Pseudomonas sp.균주는 한국생명공학연구원 생물자원센타에서 분양받은 KCTC22612 균주를 이용하였다. 입제 형태의 분양균을 skin milk medium에 백금이로 적당량을 접종한 후 이틀간 배양하여 활성화 시킨 후 Agar plate에 획선 도말하여 균을 배양하였다.
- 사용된 기초배지용액 (basic medium solution)은 1.91 g의 NH4Cl, 0.03 g의 CaCl2·2H2O, 0.2 g의 MgSO4·7H2O, 1.25 g의 CH3COONa·H2O을 1 L의 deionized water(D.I. H2O)에 용해 시켜 제조하였다.
- 실험에 사용된 배지는 기초배지(basic medium)에 1000 mg/L의 인산용액, 1M의 Tris-HCl 완충용액(pH 7.2), 300 mg/L의 FeCl3·6H2O 용액, 200,000 mg/L의 glucose 용액, 그리고 trace metal 용액이 적절한 비율로 혼합되어 최종 인산의 농도가 20 mg/L이 되도록 조제되었다(Zafiri et al., 1999).
- 4 mg/L으로 처리하여 실험하였다. 실험에 사용된 중금속의 조성은 CuSO4.5H20, As2O3,, ZnSO4.7H20, NiCl2.6H20, Cd(NO3)2.4H20이었다. 실험은 250 mL 삼각 플라스크안에 실험배지 195 mL을 넣고 각 각의 중금속 농도를 처리하여 121℃에서 15분간 고압 멸균하여 준비한 실험배지에 미리 액체 배양시킨 Pseudomonas sp.
- 표준물질로 KH2PO4를 사용하여 검량선을 작성하였으며 분석범위는 0.1-5 μg/mL이었다.
데이터처리
- 배양액의 생장률은 흡광도값에 자연대수를 취한 값을 시간별로 최소 제곱 추정에 의한 선형 회귀식으로 계산하였다. 균의 생장이 이루어 지지 않은 초기 값은 제거하였고 균의 시간별 각 생장비율 값은 상관계수(r)값이 0.
이론/모형
- 배양액 중의 인은 아스코르빈산-몰리브덴청법(Callaway et al., 1995)에 따라 실험하였으며 29℃에서 15분간 발색시켜 분광광도계(UVmini-1240, Japan)로 880 nm에서 측정하였다. 표준물질로 KH2PO4를 사용하여 검량선을 작성하였으며 분석범위는 0.
- 생장저해는 Inhibition(%) = ( μcontrol- μheavy metals)*100/μcontrol식을 이용하여 계산하였다.
성능/효과
- 인의 생장은 최대가 되었으나 아연이 초기생장에 영향을 주었기 때문에 아연을 처리하지 않은 무처리구의 인 축적능보다는 15%이상 차이가 나타나는 것을 볼 수 있었다. 니켈의 경우는 blank에서는 인 농도의 변화가 없었 으며 니켈을 처리하지 않은 무처리구에서 90.59%의 인축적 능을 나타냈으며 니켈 역시 아연과 비슷한 양상으로 실험에 사용된 가장 높은 농도처리구인 5 mg/L에서 76.82%의 인 축적능을 보였다. 카드뮴의 경우는 blank에서는 다른 중금속과 마찬가지로 인 농도의 변화가 거의 없었으며 카드뮴을 처리하지 않은 무처리구의 인축적률이 99.
- 카드뮴은 카드뮴의 반 생장 농도보다 약간 높은 농도에서 인축적율이 50%이하로 나타났으며 구리는 IC50값과 비슷한 농도에서 50%이 하로 나타났다. 따라서 생장이 저해되면 인을 축적하는 능력도 줄어든다는 것을 확인할 수 있었다. 아연과 니켈의 경우 실험에 사용된 농도에서는 인축적율이 50%이하로 떨어지지 않았다.
- 의 생장에 가장 민감한 중금속은 카드뮴> 아연> 구리> 니켈> 비소 순으로 나타났다. 또한 중금속에 따른 인 축적능력은 중금속 농도가 증가할수록 감소하였다. 따라서 본 연구의 결과가 생물학적 인 제거 공정 내에 유입되는 폐수의 중금속 농도의 범위를 결정짓는 자료로 활용될 수있을 것으로 기대된다.
- 의 인 제거 형태를 알아보기 위한 실험 결과 Pseudomonas sp.를 처리하지 않은 대조구(no cell)에서는 생장이 이루어 지지 않았으며 균의 사체를 넣은 처리구 (dead cell)에서도 균의 초기에는 생장이 이루어 지지 않았 으나 실험이 종료되기 전인 36시간 이후부터는 약간의 생장이 보였다(Fig. 4). 이는 균을 멸균하여 접종하였으나 시간이 지남에 따라 완전히 멸균되지 않은 균이 증식하였기 때문이라고 사료된다.
- 배양액을 5 mL접종하여 처리한 실험 처리구(live cell)로 나누어 실험하였다. 모든 실험은 3반복하였다. 균의 생장은 3개의 처리구를 균이 최대로 생장하여 정지기에 도달 할 때 까지 분광광도계로 550 nm에서 2시간 간격으로 측정하였다.
- 8). 반 생장 농도인 IC50값은 11.04 mg/L로 실험에 사용된 중금속 중 실험균 생장에 가장 덜 민감한 영향을 주는 것으로 나타났다. 아연의 경우는 아연을 처리하지 않은 무처리구에 비해 아연을 0.
- 이는 반 생장 농도와 거의 같은 것으로 나타났다. 비소의 경우는 blank에서는 인 농도의 변화가 없었으며 비소를 처리하지 않은 무처리구의 인 축적능이 83.11%로 나타났으며 비소 25 mg/L에서 현저하게 인 축적능이 줄어든 것을 확인할 수 있었으며 균의 생장이 약간 이루어진 75 mg/L과 전혀 생장이 나타나지 않은 100, 125 mg/L의 인 축적능은 8% 이내로 나타났다. 이는 균의 사체를 처리한 처리(dead cell)에서의 결과 값보다 작은 값으로 생장과는 상관없는 실험적 오차로 보여 진다.
- 생체흡착(biosorption)이란 수용액 중에 선택된 다른 분자들이나 이온들을 표면에 붙잡아두거나 집결시킬 수 있는 특정 생물분자의 고유특성으로 (Bohumil, 2007), 배지 내 인 농도가 줄어드는 이유가 미생물 처리를 통한 생체흡착(biosorption)에 의해서인지 학인하기 위해 Pseudomonas sp.사체를 처리한 처리구(dead cell) 를 실험한 결과에서 미생물이 생장하지 않았던 36시간 이전인 농도의 변화는 약 8%로 나타났다. 이는 배지 내 인이 미생물의 표면에 흡착되어 줄어든 양으로 사료된다.
- 24 mg/L보다는 약간 높은 농도였다. 실제 카드뮴 처리량은 다른 중금속 처리량의 10배이상 낮은 농도로써 실험에 사용된 균주의 생장에 가장 민감한 영향을 주는 것으로 나타났다.
- 04 mg/L로 실험에 사용된 중금속 중 실험균 생장에 가장 덜 민감한 영향을 주는 것으로 나타났다. 아연의 경우는 아연을 처리하지 않은 무처리구에 비해 아연을 0.1과 0.5 mg/L처리한 처리구에서 초기생장이 더 빨랐으나 시간이 지날수록 생장속도는 무처리구가 더 빠르게 나타났다(Fig. 9). 실험에서 적용된 아연의 최대 농도 값인 2 mg/L에서는 18시간 만에 균이 생장하기 시작하였다.
- 이는 아연보다 카드뮴이 더 민감한 반응을 보인다는 본 연구와 유사한 결과였으나 이에 반해 니켈의 경우 Acinetobactor sp.에서는 카드뮴 보다 더 민감한 반응을 보인다고 나타났으나 이번 연구에서는 카드뮴이 니켈보다 약 10배나 더 민감한 것으로 나타났고 구리 역시 이전 연구에서는 아연보다 더 민감하다고 나타났으나 이번 연구에서는 아연이 구리보다 더 민감한 영향을 미치는 것으로 나타났다. 중금속에 대한 생물체의 반응(사망 혹은 행동양상의 차이 등)은 생물종류에 따라 서로 다르게 나타날 수 있으며, 또한 오염물질의 종류와 농도에 따라서도 특이적으로 나타난다고 한 보고(Milani et al.
- 최고 생장이 이루어진 후 정지기에 들어섰을 때에는 모든 온도에서 거의 비슷한 생장을 나타냈으나 그 중 상온 25℃에서 균의 생장이 다른 온도에 비해 높았다. 온도에 따른 인 축적능 실험은 Fig. 2에서 나타나듯이 25℃와 35℃가 거의 비슷한 인 제거 율을 보였으며 30℃에서 제일 많은 인 축적율을 보였다. 그 값은 25℃에서 76.
- 본 연구에서는 인 축적 미생물이라고 알려진 Pseudomonas sp.의 인 축적능력을 확인하기 위한 실험을 실시하였으며 실험결과 온도에 따른 미생물의 생장 및 인 축적능력의 변화는 25℃에서 가장 빠른 생장을 보였으나 인 축적능력은 30℃에서 가장 높은 능력을 나타냈다. 35℃의경우 생장 속도나 인 축적 능력이 다른 두 온도 보다 떨어지는 것을 볼 수 있었다.
- Pseudomonas sp.의 인 축적률은 30℃에서 가장 높았으며 미생물을 처리하지 않은 대조구 에서는 인 농도의 변화가 없었고 미생물을 접종하였을 때는 약 90%가까이 인 농도가 낮아진 것을 확인 할 수 있었다. 5가지 중금속에 따른 Pseudomonas sp.
- 를 접종한 처리구(live cell)에서는 8시간 이후부터 급격히 생장하다가 24시간 이후에 생장이 이루어지지 않더니 36시간 이후 다시 생장하기 시작하여 44시간 이후 최대로 생장하면서 정지기에 도달하였다. 인 축적 실험 결과는 살아있는 균을 처리한 처리구 (live cell)에서는 배양 12시간 이후부터 급속도로 생육하여 36시간 후에 정지기에 도달하였으며 인의 흡수율은 이와 비례적으로 증가하여 98%로서 최고 수준을 나타낸 다음 배양 48시간까지 흡수한 인의 방출을 보이지 않고 같은 양을 유지 하였다. 균을 처리하지 않은 대조구(no cell)에서는 배지 내 인의 농도의 변화가 거의 없었으며 Pseudomonas sp.
- 이는 실험에 사용된 아연 농도에서 초기 균의 생장이 느리게 나타났지만 실험이 종료된 48시간에서의 생장이 최대가 되어 정지기에 이르렀기 때문이라고 사료된다. 인의 생장은 최대가 되었으나 아연이 초기생장에 영향을 주었기 때문에 아연을 처리하지 않은 무처리구의 인 축적능보다는 15%이상 차이가 나타나는 것을 볼 수 있었다. 니켈의 경우는 blank에서는 인 농도의 변화가 없었 으며 니켈을 처리하지 않은 무처리구에서 90.
- 온도에 따라서는 초기 생장은 25℃가 빨랐으며 30℃가 거의 비슷한 속도로 증가하였고 35℃에서는 다른 온도에 비해 약간 생장이 느리게 나타났다. 최고 생장이 이루어진 후 정지기에 들어섰을 때에는 모든 온도에서 거의 비슷한 생장을 나타냈으나 그 중 상온 25℃에서 균의 생장이 다른 온도에 비해 높았다. 온도에 따른 인 축적능 실험은 Fig.
- 다른 실험에 비해 생장속도가 빨랐던 이유는 다른 중금속 실험에서는 48시간 배양된 균을 사용한 것과 달리 카드뮴 실험에서는 균이 생장하기 시작한 12시간 된 배양액을 접종하였기 때문이라고 사료된다. 카드뮴의 반 생장 농도인 IC50값 0.24 mg/L로 다른 중금속보다도 실험균 생장에 가장 민감한 영향을 주는 것으로 나타났다.
후속연구
- 또한 중금속에 따른 인 축적능력은 중금속 농도가 증가할수록 감소하였다. 따라서 본 연구의 결과가 생물학적 인 제거 공정 내에 유입되는 폐수의 중금속 농도의 범위를 결정짓는 자료로 활용될 수있을 것으로 기대된다.
- 가 생체내의 인을 축적하여 인을 제거하는 것인지 아니면 균 표면에 흡착하여 인을 제거하는 것인지 확인할 수 있는 연구를 수행하여 실제로 하수 처리장에서 균의 활용을 위한 방법을 고안해 내기 위한 조건을 연구하는 데 중요한 자료가 될 수 있을 것이라 사료 되며 실제 실험실 규모의 하수처리시설을 설치하여 유입수내의 일정농도의 중금속을 처리한 후 Pseudomonas sp.의 활성 및 인 축적능력에 미치는 영향 확인하고 생물학적 인 제거 공정 내에 인 축적 미생물에 속하는 다른 세균들의 중금속 독성효과를 비교하는 연구를 수행하여 인 제거 공정의 효율적인 운전 조건을 결정짓기 위한 유용한 자료로 활용될 수있을 것이라 생각된다.
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