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문제 정의
- 본 연구는 국내에 자생하고 있는 주요 낙엽성 참나무류 수피의 추출성분의 상호 연관성 및 특징을 분석하고자 하였으며 그 결과 (+)-catechin (4)와 glucodistylin (7)은 6 수종 모두에서 분리되었다. 각 수종별 함유량을 분석한 결과 화합물 glucodistylin (7)은 국내 낙엽성 참나무류 수피부의 대표적인 지표물질로 활용이 가능할 것으로 판단되었다.
- 본 논문의 저자(김과 배, 2006)들은 참나무 6 수종의 잎에서 gallic acid를 분리하였고, 이들이 참나무류 잎의 주요 지표성분임을 보고한바 있다. 본 연구에서는 낙엽성 참나무속 6 수종의 수피를 대상으로 추출성분의 구조를 규명하고 각 수종별 추출성분의 특성 및 수종 간 성분의 상호 연관성을 조사하여 지표성분을 찾는데 그 목적이 있다.
제안 방법
- 71 g)로 규명하였다. EtOAc 가용성을 분리, 정제하기 위하여 메탄올 수용액에 용해하는 과정에서 생긴 침전물을 재결정법으로 정제하여 화합물 2 (ellagic acid, 1.51 g)를 얻었다. 또한, 수용성 분획물(KCW) 52.
- Fig. 5와 같이 EtOAc 가용성 분획물 60.50 g을 MeOH-H2O (3 : 1, v/v)로 칼럼크로마토그래피를 수행하여 4개의 fraction (JCE-1∼4)으로 분획하였다.
- Fig. 6과 같이 EtOAc 가용성 분획물 28.00 g을 MeOH-H2O (3 : 1, v/v)로 칼럼크로마토그래피를 수행하여 5개의 fraction (COE-1∼5)으로 분획하여 동결건조 하였다.
- 분리된 각 화합물의 1H-NMR과 13C-NMR 스펙트럼으로 구조를 분석하였으며 일부 화합물은 COSY, HETCOR 및 HMBC 등의 2D-NMR을 분석하였다. 규명된 화합물은 FAB-MS 및 EI-MS로 분자량을 측정하였고 각각의 질량분석 조건은 다음과 같다. FAB-MS의 matrix는 m-nitro benzyl alcohol (NBA)을 사용하였으며 heater current는 2.
- 기건 된 각 수종의 수피(5.0 kg)를 30 ℓ의 유리용기에 넣고 아세톤-물(7 : 3, v/v)의 혼합용액에 침지하여 5일간 추출한 후 농축하였다. 충분한 양의 추출용액을 얻기 위하여 2회 반복하여 추출하였으며 얻어진 추출용액은 감압 농축한 후 n-hexane, CH2Cl2, ethyl acetate (EtOAc) 및 H2O로 순차 분획하여 농축한 후 각각의 분획물을 동결 건조하였다.
- 이상의 결과는 Harborne과 Mabry(1982)가 보고했던 taxifolin 및 그 배당체 화합물과 유사하였으며 FAB-MS 스펙트럼에서 [M+H]+ m/z 305로 분자량이 일치하였다. 따라서 이 화합물은 taxifolin으로 구조를 규명하였다.
- 15 ppm의 피크로 정확하게 규명하였다. 또한, COSY 스펙트럼을 이용하여 glucose의 나머지 수소들의 위치를 확인하였다. 상기의 결과는 함(2000)이 C-3에 glucose가 ether 결합하면 C-3은 약 3.
- 또한, H2O 분획물 55.00 g을 MeOH-H2O (2:1, v/v)로 칼럼크로마토그래피를 수행하여 4개의 fraction (DKH-1∼4)으로 분획하였다.
- 09 g)를 얻었다. 또한, SSE-314 fraction을 MeOH-H2O (1 : 3, v/v)으로 칼럼크로마토그래피를 수행하여 SSE-3141, SSE-3142, SSE-3143 fraction에서 화합물 1 (0.115 g), 4 (0.03 g) 및 6 (0.26 g)을 각각 분리하였다.
- 를 사용하였다. 분리된 각 화합물의 1H-NMR과 13C-NMR 스펙트럼으로 구조를 분석하였으며 일부 화합물은 COSY, HETCOR 및 HMBC 등의 2D-NMR을 분석하였다. 규명된 화합물은 FAB-MS 및 EI-MS로 분자량을 측정하였고 각각의 질량분석 조건은 다음과 같다.
- 화합물의 순도는 TLC (DC-Plastikfolien cellulose F, Merck)로 확인하였으며 전개용매는 t-BuOH-acetic acid-water (3 : 1 : 1, v/v/v, solvent A)와 6% HOAc (solvent B)를 사용하였다. 전개된 화합물은 UV 램프(254 nm, 354 nm)에서 확인한 후, vanillin-HCl-EtOH (60 : 0.15 : 6, v/v/v), 1% FeCl3(EtOH) 분무한 후 가열 건조하여 반응하는 색을 관찰하였다.
- 참나무 수피부의 EtOAc와 물 분획물에 대해 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 Fig. 7과 같이 7 종의 페놀성 화합물을 분리하였다. 분리된 화합물은 Table 2와 같이 다른 수종들과는 달리 참나무의 추출성분의 조성은 비교적 단순하였으며 추출성분의 대부분이 고분자성 탄닌으로 구성되어 있음을 셀룰로오스 TLC에서 대부분의 추출물 전개가 끌림으로 나타난 것으로 예측할 수 있었다.
- 00 g을 MeOH-H2O (8:1, v/v)로 정제하여 3개의 fraction (KCE-1∼3)으로 분획한 후 동결건조 하였다. 첫 번째 fraction (KCE-1)은 NMR 및 MS로 분석하여 화합물4 ((+)-catechin, 13.71 g)로 규명하였다. EtOAc 가용성을 분리, 정제하기 위하여 메탄올 수용액에 용해하는 과정에서 생긴 침전물을 재결정법으로 정제하여 화합물 2 (ellagic acid, 1.
- 0 kg)를 30 ℓ의 유리용기에 넣고 아세톤-물(7 : 3, v/v)의 혼합용액에 침지하여 5일간 추출한 후 농축하였다. 충분한 양의 추출용액을 얻기 위하여 2회 반복하여 추출하였으며 얻어진 추출용액은 감압 농축한 후 n-hexane, CH2Cl2, ethyl acetate (EtOAc) 및 H2O로 순차 분획하여 농축한 후 각각의 분획물을 동결 건조하였다.
대상 데이터
- 00 g을 MeOH-H2O (3 : 1, v/v)로 칼럼크로마토그래피를 수행하여 5개의 fraction (COE-1∼5)으로 분획하여 동결건조 하였다. COE-3을 MeOH-H2O (1 : 2, 1 : 3, v/v)과 EtOH-hexane (4 : 1, 3 : 1, v/v)로 정제하여 COE-32326에서 화합물 1 (gallic acid, 0.24 g)을, COE-323243에서 화합물 7 (glucodistylin, 0.65 g)을 정제하였다. 또한, COE-4를 MeOH-H2O (2:1, 1:2, v/v)과 EtOH-hexane (3 : 1, v/v) 혼합용액을 용리용매로 사용하여 COE-424에서 화합물 4 ((+)-catechin, 0.
- 규명된 화합물은 FAB-MS 및 EI-MS로 분자량을 측정하였고 각각의 질량분석 조건은 다음과 같다. FAB-MS의 matrix는 m-nitro benzyl alcohol (NBA)을 사용하였으며 heater current는 2.5 A, anode voltage는 26 kV, gun focus는 17 kV였다. EI-MS는 ion source 온도는 250℃, electron energy는 70 eV, trap current는 500 uA, 범위는 50～500 m/z였다.
- 각 시료의 EtOAc와 H2O 분획물로부터 단일 화합물을 분리하기 위하여 다양한 크기(직경 50, 30 및 10 mm)의 open 칼럼 크로마토그래피를 실시하였으며 충진물질로는 Sephadex LH-20을 용리용매는 메탄올 수용액과 에탄올-헥산 혼합용액을 사용하였다. 화합물의 순도는 TLC (DC-Plastikfolien cellulose F, Merck)로 확인하였으며 전개용매는 t-BuOH-acetic acid-water (3 : 1 : 1, v/v/v, solvent A)와 6% HOAc (solvent B)를 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 공시수종은 신갈나무(Q. mongolica), 갈참나무(Q. aliena), 떡갈나무(Q. dentata)와 굴참나무(Q. variabilis)는 2000년 7월 춘천시 동산면 봉명리에서, 졸참나무(Q. serrata)와 상수리나무(Q. acutissima)는 2000년 8월 홍천군 북방면 북방리의 강원대학교 학술림에서 벌채하여 박피한 후 실험실에서 약 3주간 건조한 후 추출용 시료로 사용하였다.
- 분리, 정제된 화합물의 구조를 규명하기 위하여 NMR (Bruker DPX 400 MHz) spectrometer를 이용하였고, 분석용매는 DMSO-d6와 MeOH-d4를 사용하였다. 분리된 각 화합물의 1H-NMR과 13C-NMR 스펙트럼으로 구조를 분석하였으며 일부 화합물은 COSY, HETCOR 및 HMBC 등의 2D-NMR을 분석하였다.
- O 분획물로부터 단일 화합물을 분리하기 위하여 다양한 크기(직경 50, 30 및 10 mm)의 open 칼럼 크로마토그래피를 실시하였으며 충진물질로는 Sephadex LH-20을 용리용매는 메탄올 수용액과 에탄올-헥산 혼합용액을 사용하였다. 화합물의 순도는 TLC (DC-Plastikfolien cellulose F, Merck)로 확인하였으며 전개용매는 t-BuOH-acetic acid-water (3 : 1 : 1, v/v/v, solvent A)와 6% HOAc (solvent B)를 사용하였다. 전개된 화합물은 UV 램프(254 nm, 354 nm)에서 확인한 후, vanillin-HCl-EtOH (60 : 0.
성능/효과
- 낙엽성 참나무 6 수종의 수피를 아세톤-물(7 : 3, v/v)로 추출하여 유기용매를 증발시킨 후 n-hexane, CH2Cl2 및 EtOAc 등으로 순차 추출한 결과 Table 1과 같이 떡갈나무(8.1%)가 가장 높은 추출 수율을 나타내었고 다음으로 신갈나무(6.6%), 졸참나무(6.4%), 상수리나무(6.0%)가 유사한 수율을 나타내었으며 갈참나무(4.2%)와 굴참나무(3.7%)는 다른 수종에 비해서 수율이 낮았다. EtOAc 추출 분획물에서는 신갈나무가 2.
- 당의 정확한 결합 위치는 HMBC 스펙트럼에서 glucose H-1"이 C-3과 서로 상관관계를 나타내어 당이 C-3에 결합되어 있음을 확인 하였다.
- 따라서 1H-NMR 스펙트럼에서 δ 6.40에서 H-2',6'이 하나의 signal로 나타나며 적분값도 두 개의 수소값을 나타내어 B환은 C-3', 4', 5'에 hydroxyl group이 결합된 pyrogallol 구조임을 알 수 있었다.
- 0 ppm downfield 되었다. 따라서 당의 결합위치는 3번으로 예측 할 수 있었으며 glucose와 비슷한 chemical shift를 갖는 C-3의 피크는 HETCOR 스펙트럼에서 H-3과 C-3의 상관관계를 확인하여 76.15 ppm의 피크로 정확하게 규명하였다. 또한, COSY 스펙트럼을 이용하여 glucose의 나머지 수소들의 위치를 확인하였다.
- 신갈나무와 졸참나무에서는 glucodistylin (7)이 20 g 이상으로 많은 양이 분리되었다. 따라서, 화합물 7 (glucodistylin)은 낙엽성 참나무류 수피의 가장 대표적인 지표물질로 판단되며 화합물 2 (ellagic acid)는 신갈나무, 떡갈나무, 갈참나무, 졸참나무에서 단리 되었으며 갈참나무에서 가장 많은 양이 분리되었다. 화합물 3 (caffeic acid)은 굴참나무에서, 화합물 5 ((+)-gallocatechin)는 상수리나무에서만 분리되어 다른 수종과 차이점을 나타내었으며 화합물 6과 7은 국내 낙엽성 참나무 수피에서는 처음보고 되는 화합물이다.
- 모든 수종에서 분리되었으며 신갈나무에서 4.59 g, 상수리나무 196 mg, 떡갈나무 2.01 g, 갈참나무 21.91 g, 졸참나무 822 mg, 굴참나무 321 mg을 얻었다. Rf는 0.
- 7과 같이 7 종의 페놀성 화합물을 분리하였다. 분리된 화합물은 Table 2와 같이 다른 수종들과는 달리 참나무의 추출성분의 조성은 비교적 단순하였으며 추출성분의 대부분이 고분자성 탄닌으로 구성되어 있음을 셀룰로오스 TLC에서 대부분의 추출물 전개가 끌림으로 나타난 것으로 예측할 수 있었다.
- 15 ppm에서 catechol 형태의 피크를 나타내고 있다. 이상의 결과는 Harborne과 Mabry(1982)가 보고했던 taxifolin 및 그 배당체 화합물과 유사하였으며 FAB-MS 스펙트럼에서 [M+H]+ m/z 305로 분자량이 일치하였다. 따라서 이 화합물은 taxifolin으로 구조를 규명하였다.
- 86 ppm의 signal은 carboxyl group의 C-9의 피크를 나타낸다. 이상의 결과로 이 화합물은 3,4-dihydroxycinnamic acid 즉, caffeic acid 로 구조를 규명하였다. EI-MS 스펙트럼에서 [M]+ m/z 180으로 분자량이 일치하였다.
- 이 화합물은 gallic acid의 중합체로서 분자 내에는 hexahydroxydiphenylic acid 상태로 존재하다가 가수분해 될 때 lactone화가 되어 생성된 것이다(우, 1999). 이상의 결과로 이 화합물은 gallic acid 두 분자가 결합된 형태의 ellagic acid로 구조를 규명하였다.
- 따라서, 화합물 7 (glucodistylin)은 낙엽성 참나무류 수피의 가장 대표적인 지표물질로 판단되며 화합물 2 (ellagic acid)는 신갈나무, 떡갈나무, 갈참나무, 졸참나무에서 단리 되었으며 갈참나무에서 가장 많은 양이 분리되었다. 화합물 3 (caffeic acid)은 굴참나무에서, 화합물 5 ((+)-gallocatechin)는 상수리나무에서만 분리되어 다른 수종과 차이점을 나타내었으며 화합물 6과 7은 국내 낙엽성 참나무 수피에서는 처음보고 되는 화합물이다.
후속연구
- 본 연구는 국내에 자생하고 있는 주요 낙엽성 참나무류 수피의 추출성분의 상호 연관성 및 특징을 분석하고자 하였으며 그 결과 (+)-catechin (4)와 glucodistylin (7)은 6 수종 모두에서 분리되었다. 각 수종별 함유량을 분석한 결과 화합물 glucodistylin (7)은 국내 낙엽성 참나무류 수피부의 대표적인 지표물질로 활용이 가능할 것으로 판단되었다. 가수분해형 탄닌인 ellagic acid (2)는 신갈나무, 떡갈나무, 갈참나무, 졸참나무에서 단리 되었으며 특히, 갈참나무에서 가장 많은 양이 분리되었다.
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