[논문]Schizophyllum commune에 의한 Cellulase 생산 및 섬유소계 바이오매스의 당화를 위한 효소적 특성

김현정; 김윤희; 조문정; 신금; 이동흡; 김태종; 김영숙

doi:10.5658/wood.2010.38.6.547

[국내논문] Schizophyllum commune에 의한 Cellulase 생산 및 섬유소계 바이오매스의 당화를 위한 효소적 특성
Characterization of Cellulases from Schizophyllum commune for Hydrolysis of Cellulosic Biomass 원문보기

목재공학 = Journal of the Korean wood science and technology, v.38 no.6, 2010년, pp.547 - 560

김현정 (국민대학교 삼림과학대학 임산생명공학과) , 김윤희 (국민대학교 삼림과학대학 임산생명공학과) , 조문정 (국민대학교 삼림과학대학 임산생명공학과) , 신금 (국민대학교 산림과학연구소) , 이동흡 (국립산림과학원, 환경소재공학과) , 김태종 (국민대학교 삼림과학대학 임산생명공학과) , 김영숙 (국민대학교 삼림과학대학 임산생명공학과)

초록
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본 연구에서는 Schizophyllum commune의 당 분해효소 생산을 위한 최적 배양 조건과 목질바이오매스에 대한 당화 특성에 대하여 연구하였다. S. commune 균체 외 효소에는 endo-${\beta}$-1,4-glucanase (EG), cellobiohydrolase (CBH), ${\beta}$-glucosidase (BGL)와 같은 cellulase와 ${\beta}$-1,4-xylosidase (BXL)이 함유되어 있고 그 중에서 EG 및 BGL활성이 비교적 높은 활성을 나타낸 것으로 밝혀졌다. S. commune에서 생산된 EG, BGL, 및 CBH의 최적 온도는 $50^{\circ}C$이었으나, 열안정성을 가지는 온도범위는 $30{\sim}40^{\circ}C$였다. 그리고 최적 pH는 5.5이었으며 열 안정성을 나타내는 온도범위에서의 적정 pH는 동일한 pH 5.5이었다. Cellulase 생산을 위한 S. commune의 최적배양 조건은, 탄소원으로 천연 cellulose, 질소원으로는 corn steep, 또는 peptone/yeast extract 혼합물, 비타민은 첨가하지 않는 것이 cellulase 효소활성 증가에 적절한 것으로 밝혀졌다. 또한 탄소원의 최적 첨가 농도는 2% (w/w), 적정 배양 pH 및 온도는 5.5~6.0과 $25{\sim}30^{\circ}C$로 밝혀졌다. 본 연구에서 도출된 최적 배양 조건으로 S. commune를 배양시키고 40배로 농축한 결과, EG가 3670.5 U/$m{\ell}$, BGL과 CBH가 각각 631.9 U/$m{\ell}$, 398.5 U/$m{\ell}$, BXL이 15.2 U/$m{\ell}$로 매우 높은 효소 활성을 나타냈다. 동일한 효소의 Filter Paper Unit도 11 FPU/$m{\ell}$로 상당히 높았다. 최적배양조건에서 얻어진 S. commune 효소로 다양한 기질에 대해 당화 시험을 실행한 결과, 전처리를 하지 않은 공시 활엽수에 대하여 낮은 당화율을 나타냈으나 천연 cellulose (Aldrich, ~20 micron) 및 볏짚의 경우에는 각각 50.5% 및 33.1%의 높은 당화성능을 나타냈다. 이 같은 당화 수준은 동일 효소농도 (30 FPU/g, glucan)로 비교했을 때 Trichoderma reesei 유래 상용화 효소인 Celluclast 1.5L의 약 110% 수준을 나타냄으로써, 대량생산기술 개발과정을 통해 목질계 당화 효소로의 상용화 가능성이 높은 균주로 평가되었다.

Abstract ▼ AI-Helper

The optimum culture condition of Schizophyllum commune for the cellulase production and its enzymatic characteristics for saccharification of cellulosic biomass were analyzed. S. commune secrets ${\beta}$-1,4-xylosidase (BXL) and cellulases, including endo-${\beta}$-1,4-glucanase (EG), cellobiohydrolase (CBH), and ${\beta}$-glucosidase (BGL). The optimum reaction temperature for all cellulases was $50^{\circ}C$ and the thermostable range was $30{\sim}40^{\circ}C$C. The optimum reaction pH for all cellulases was 5.5 in a range of temperature from $0^{\circ}C$ to $55^{\circ}C$. The best nutritions for the cellulase production of S. commune among tested nutrients were 2% cellulose for the carbon source and corn steep liquor or peptone/yeast extract for the nitrogen source without vitamins. The environmental culture condition for the cellulase production was 5.5~6.0 for pH at $25{\sim}30^{\circ}C$. The enzyme activities of EG, BGL, CBH, and BXL were 3670.5, 631.9, 398.5, and 15.2 U/$m{\ell}$, respectively, after concentration forty times from the culture broth of S. commune which was grown at the optimized culture condition. Alternative filter paper unit assay showed 11 FPU/$m{\ell}$ enzyme activity. The saccharification tests using cellulase of S. commune showed the low saccharification rate on tested hardwoods but a high value of 50.5% on cellulose, respectively. The saccharification rate (50.5%) of cellulose by cellulase produced in this work is higher than 45.7% in the commercial enzyme (Celluclast 1.5L, 30 FPU/g, glucan).

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AI 본문요약
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문제 정의

국내의 경우 목질바이오매스를 이용한 바이오에탄올 생산 기술수준이 미국 등 선진국에 비해 미흡한 단계에 있고 저비용 고효율을 얻기 위한 국산효소 개발의 필요성이 매우 큰 상황이라고 할 수 있다. 이와 같은 배경에서 본 연구에서는 당화효소용 예비 균주 선발 시험에서 우수한 당화성능을 나타낸 목재 부후균인 S. commune를 목표로 이 미생물로부터 cellulase활성이 탁월한 균체 외 효소 생산을 유도하기 위한 최적 생육 조건을 구명하고, 최적 조건에서 생산된 cellulase의 다양한 섬유소계 바이오매스에 대한 당화능을 탐색하고자 하였다.
본 연구에서는 S. commune의 당 분해효소 생산을 위한 최적 배양 조건과 목질바이오매스에 대한 당화 특성을 분석하여 다음과 같은 결론을 얻었다.

제안 방법

공시균은 potato dextrose agar (PDA)배지에 3～4일간 배양 후, Potato dextrose broth (PDB) 배지 100 ㎖에 균사체를 접종하여, 25°C, 140 rpm에서 4일간 진탕배양 하여 이를 본 배양에 이용하였다.
Cellobiohydrolase(CBH)는 1 M CH3COONa (pH = 5) 100 ㎕, 10 mM p-NPL (p-Nitrophenyl-β-lactopyranoside) 100 ㎕, 효소 100 ㎕, 증류수 700 ㎕를 혼합한 후 40°C에서 30분간 반응 후 효소활성 저해제인 2 M Na2CO3 100 ㎕ 투입한 후 UV-Vis spectrophotometer를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정한 다음 CBH 활성을 구했다.
그 후에 100 ㎕ 2 M Na2CO2를 첨가한 후 405 nm에서 β-glucosidase의 활성을 측정하였다.
기질의 농도가 S. commune 균체 외 효소의 활성에 미치는 영향을 구명하기 위하여 기질 농도를 1∼6% (w/v)로 조정하여 실험하였다.
온도와 pH시험은 1 liter 삼각플라스크에 액체배지 200 ㎖를 넣고, 전배양액을 5% (v/v)농도로 첨가하고 온도 및 pH를 조정하여 배양한 후 효소활성을 비교⋅분석하였다.
효소 활성에 미치는 비타민의 효과 시험에는 Thiamine, riboflavin, niacin, calcium pantothenate, pyridoxine hydrochloride, biotin, inositol, folic acid를 각각 0.1 M sodium hydroxides에 녹인 후 0.45 µm 멸균 필터로 거른 뒤 5 ppm 농도로 각 플라스크에 접종하여 위에서 서술한 동일한 방법으로 본 배양을 실시하였다.
효소활성에 미치는 탄소원의 효과시험에는 탄소원으로서 glucose, lactose, maltose, cellobiose, carboxymethyl cellulose(CMC), xylan, avicel, 탈지 처리한 50 mesh 상수리나무와 리기다소나무 목분, 혼합목분, 볏짚을 각각 사용하였고 cellulose (Aldrich, ∼20 micron)를 비교 기질로 하였다.
또한 질소원에 따른 효소활성 변화 시험에는 기본 배지에 질소원은 yeast extract, peptone, corn steep powder, urea, (NH₄)₂SO₄, KNO₃, NaNO₃를 각각 적용하였다. 이 때 기본배지에서 질소원을 1% (w/v) 농도로 각각 첨가하여 본 배양을 실시하였다. 효소 활성에 미치는 비타민의 효과 시험에는 Thiamine, riboflavin, niacin, calcium pantothenate, pyridoxine hydrochloride, biotin, inositol, folic acid를 각각 0.
또한 공시균의 균주 배양 온도와 pH가 각 효소의 생산성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 배양 시 온도 20～35℃와 pH 4.0～7.0 범위에서 시험하였다. 온도와 pH시험은 1 liter 삼각플라스크에 액체배지 200 ㎖를 넣고, 전배양액을 5% (v/v)농도로 첨가하고 온도 및 pH를 조정하여 배양한 후 효소활성을 비교⋅분석하였다.
우선 5 ㎕ 1 M sodium-acetate, 5 ㎕ 1%의 carboxymethyl cellulose (CMC), 35 ㎕ 증류수에 5 ㎕ 효소를 첨가시킨 후, 50°C에서 30분간 반응시키고 효소반응이 끝난 샘플에 구리 시약 50 ㎕를 넣고 잘 혼합한 후 100°C에서 15분간 효소반응을 정지시켰다. 반응이 정지된 샘플을 실온까지 냉각하고 50 ㎕ Nelson 발색 시약을 첨가하여 청색으로 변색하는 것을 확인하고 1 ㎖ 증류수를 넣고 충분히 혼합한 후, 샘플을 실온에서 15분간 반응시킨 후에 660 nm 흡광도를 측정하고 검량선에 의거 효소활성을 구하였다. β-glucosidase (BGL)는 1.
β-1,4-xylosidase (BXL)는 1 M CH3COONa(pH = 5) 100 ㎕, 10 mM p-NPX (p-Nitrophenyl-β-xylopyranoside) 100 ㎕, 효소 100 ㎕, 증류수 700 ㎕를 혼합한 후 40°C에서 30분간 반응 후 효소활성 저해제인 2 M Na2CO3 100 ㎕ 투입한 후 UV-Vis spectroscopy를 이용 405 nm에서 흡광도를 측정한 다음 효소활성을 구하였다.
이 때 용매는 100% Distilled water, 시료의 주입량은 10 ㎕로 유속 0.6 ㎖/min, 컬럼 오븐 온도는 85°C 조건에서 생성된 glucose (mg/g)를 측정하였다.
Glucose는 당화시험 완료 후 취한 샘플을 0.2 µm syringe filter(Advantec)로 여과시킨 후 HPLC (Younglin Acme 9000 Vacuum Degasser, Avme 9000 RI detector 및 Column Oven)과 Aminex HPX-87P column (Bio-Rad)을 이용하여 분석하였다.
최적 pH는 0.1 M citric acid (pH 2.0∼4.0), 0.1 M sodium acetate (pH 4.0～5.5), 0.1 M phosphate(pH 5.5～8.0) 완충용액에 효소액을 첨가하여 효소 활성을 측정하였다.
최적 반응온도는 효소액을 sodium acetate 완충용액(pH 5.5)에 첨가하여 20～65°C범위에서 기질과 15분간 반응시킨 후 효소활성을 측정하였다.
시험에서 얻어진 균체 외 효소을 넣고 50°C에서 60분간 반응을 시켰다. 3 ㎖ DNS (3,5-Dinitrosalicylic acid, Alfa Aesar) 시약을 첨가한 시료를 5분간 끓는물에 넣고 반응을 정지 시켰다. 각각의 샘플은 상온으로 냉각시키고 잘 섞어서 펄프화된 filter paper를 가라앉힌 후에, 증류수와 일정 비율로 섞어 540 nm에서 흡광도를 측정하여 생성된 당량을 계산하였다.
3 ㎖ DNS (3,5-Dinitrosalicylic acid, Alfa Aesar) 시약을 첨가한 시료를 5분간 끓는물에 넣고 반응을 정지 시켰다. 각각의 샘플은 상온으로 냉각시키고 잘 섞어서 펄프화된 filter paper를 가라앉힌 후에, 증류수와 일정 비율로 섞어 540 nm에서 흡광도를 측정하여 생성된 당량을 계산하였다.
전술한 2.2.2.에서 얻어진 S. commune 균체 외 효소의 목질바이오매스에 대한 당화성을 시험하기 위하여 2.5에서 도출된 최적 온도 및 pH 조건에서 당화시험을 실시하였다. S.
당화 시험 후 생성당은 환원당과 glucose생성량을 측정하였다. 환원당 측정은 당화가 완료된 액을 멸균 필터(0.
6 ㎖/min, 컬럼 오븐 온도는 85°C 조건에서 생성된 glucose (mg/g)를 측정하였다. 그리고 당화율(%, w/w)은 효소 가수분해된 환원당과 glucose 모두 각각의 공시 바이오매스의 glucan량(g)에 대한 백분율로 계산하였다.
6에 나타내었다. Fig. 6에 나타낸 바와 같이 기질농도 2% (w/v)일 때, EG가 137.7 U/㎖, BGL이 95.2 U/㎖, CBH가 33.2 U/㎖로 효소활성이 가장 높게 나타남에 따라 최적 탄소원 농도로 채택하고 이후 모든 실험의 균주배양에 2% 탄소원을 첨가하는 것으로 하였다.

대상 데이터

본 연구에 사용한 섬유소계 시료로 Cellulose (Aldrich, ∼20 micron), Avicel (Fluka), Carboxymethyl cellulose sodium salt (CMC, Fluka), Cellobiose (Alfa Aesar)를 사용하였으며, 목질계 바이오매스로서 볏짚과 9수종의 목재를 이용하였다.
본 연구에 사용한 섬유소계 시료로 Cellulose (Aldrich, ∼20 micron), Avicel (Fluka), Carboxymethyl cellulose sodium salt (CMC, Fluka), Cellobiose (Alfa Aesar)를 사용하였으며, 목질계 바이오매스로서 볏짚과 9수종의 목재를 이용하였다. 공시 볏짚은 경상남도 거창군에서 구입한 볏짚을 건조, 분쇄하여 시험에 이용하였다. 공시목재는 상수리나무(Quercus acutissima), 낙엽송(Larix leptolepsis), 리기다소나무(Pinus rigida), 잣나무(Pinus koraiensis) 및 소나무(Pinus densiflora)는 강원도 홍천군 신우 임산에서 구입하였고, 호랑버들나무(Salix hulteni), 키버들나무(Salix purpurea var.
공시 볏짚은 경상남도 거창군에서 구입한 볏짚을 건조, 분쇄하여 시험에 이용하였다. 공시목재는 상수리나무(Quercus acutissima), 낙엽송(Larix leptolepsis), 리기다소나무(Pinus rigida), 잣나무(Pinus koraiensis) 및 소나무(Pinus densiflora)는 강원도 홍천군 신우 임산에서 구입하였고, 호랑버들나무(Salix hulteni), 키버들나무(Salix purpurea var. japonica), 버드나무(Salix koreensi) 및 갯버들나무(Salix gracilistyla)는 강원대학교 산림과학대학 산림육종연구실에서 시험 재배한 공시목재를, 백합나무(Liriodendron tulipifera)는 국립산림과학원 바이오에너지과에서 분양받아 이용하였다. 혼합목분의 제조는 상기의 낙엽송, 리기다소나무, 잣나무 및 소나무가 포함된 침엽수 공시목재를 대상으로 각 수종별로 심재와 변재로 구분하여 willy mill로 분쇄한 목분을 동일 비율로 혼합하여 사용하였다.
japonica), 버드나무(Salix koreensi) 및 갯버들나무(Salix gracilistyla)는 강원대학교 산림과학대학 산림육종연구실에서 시험 재배한 공시목재를, 백합나무(Liriodendron tulipifera)는 국립산림과학원 바이오에너지과에서 분양받아 이용하였다. 혼합목분의 제조는 상기의 낙엽송, 리기다소나무, 잣나무 및 소나무가 포함된 침엽수 공시목재를 대상으로 각 수종별로 심재와 변재로 구분하여 willy mill로 분쇄한 목분을 동일 비율로 혼합하여 사용하였다. 공시균주의 배양 시 탄소원 및 당화에 이용하는 모든 공시 바이오매스의 입자는 공히 50 mesh를 통과한 시료를 사용하였다.
혼합목분의 제조는 상기의 낙엽송, 리기다소나무, 잣나무 및 소나무가 포함된 침엽수 공시목재를 대상으로 각 수종별로 심재와 변재로 구분하여 willy mill로 분쇄한 목분을 동일 비율로 혼합하여 사용하였다. 공시균주의 배양 시 탄소원 및 당화에 이용하는 모든 공시 바이오매스의 입자는 공히 50 mesh를 통과한 시료를 사용하였다.
공시균주는 국립산림과학원에서 분양 받은 S. commune를 사용하였다.
본 배양의 배지는 Peptone 8 g/ℓ, KH2PO4 5 g/ℓ, K2HPO4 5 g/ℓ, MgSO4⋅7H2O 3 g/ℓ, Yeast extract 2 g/ℓ, Cellulose (Aldrich, ∼20 micron) 20 g/ℓ을 포함한 액체배지(pH 5.5)를 기본배지로 하고 시험 목적에 따라 탄소원, 질소원, 및 비타민을 각각 조정하여 본 배양에 사용하였다.
이때 기질은 탄소원 시험에서 효소활성이 높게 나타난 cellulose(Aldrich, ∼20 micron)를 이용하였다.
이 때 탄소원의 농도는 2% (w/v)로 하고 그 외 조성분은 위에서 전술한 물질을 동일하게 첨가하여 본 배양에 사용하였다. 또한 질소원에 따른 효소활성 변화 시험에는 기본 배지에 질소원은 yeast extract, peptone, corn steep powder, urea, (NH₄)₂SO₄, KNO₃, NaNO₃를 각각 적용하였다. 이 때 기본배지에서 질소원을 1% (w/v) 농도로 각각 첨가하여 본 배양을 실시하였다.
당화 종료 후 샘플을 취하여 100°C에서 10분간 끓여 효소반응을 정지시킨 후 당 분석에 사용하였다.
공시된 목질 바이오매스 시료는 천연 cellulose (Aldrich, ∼20 micron), 볏짚, 목재 5수종(호랑버들나무, 버드나무, 키버들나무, 갯버들나무, 백합나무)을 사용하였다.

이론/모형

S. commune 균체 외 효소 중, endo-β-1,4-glucanase(EG)는 Somogyi-Nelson법(Somogy, M., 1952)에 따라서 시행하였다.
환원당 측정은 당화가 완료된 액을 멸균 필터(0.2 µm)로 여과한 후 효소 가수 분해된 당을 DNS법(Ghose, 1987)에 의해 측정하였다.
2)로 여과시킨 후, Amicon membrane 농축기를 사용하여 농축하고 여기서 얻은 농축액을 분석용 추출물로 사용하였다. 단백질 정량은 Bradford 방법(Bradford, 1967)에 따라 정량하였고, 다음 식에 의거하여 단백질 농도를 구하였다.
공시재료인 목질바이오매스 조성분의 정량 분석은 미국 NREL Technical Report (Sluiter et al., 2008) 분석 방법에 준하여 실시하였다.

성능/효과

Fig. 2에 나타낸 바와 같이 EG 활성은 45∼50°C 범위에서 최대 활성을 보였고 BGL 및 CBH 활성의 경우 50°C에서 최대 활성을 보였다.
30∼40°C에서는 72시간 지속하여도 초기와 같은 효소 활성을 유지하는 것으로 밝혀졌으며, EG의 경우, 45°C, 배양 1시간 이후부터 40% 이상 효소활성이 감소했고, 55와 60°C에서도 비슷한 감소율을 나타내었다.
그러나 기질이 제거된 상황에서 균체 외 효소를 30∼55°C에서 반응시켜 일정 시간 잔존 효소 활성을 측정한 결과, S. commune 균체 외 효소의 열안정성은 Fig. 3에 나타난 바와 같이 40°C 이하의 낮은 온도에서 효소 단백질이 안정한 것으로 나타났다.
EG 활성도 마찬가지로 50°C 이상에서 효소활성이 감소하는 추세를 보이기는 하지만 감소율이 7% 미만으로 낮아 45∼ 60°C 범위에서 비교적 안정한 활성을 보이는 것으로 평가되었다.
50°C 이상 온도가 증가함에 따라 BGL과 CBH의 활성이 점차 감소하였으며, 55°C에서 효소활성이 50% 이상 급격히 감소하였다.
일반적인 목재부후균을 배양하는 기본배지에서 S. commune가 생산하는 균체 외 효소는 주로 당 분해 효소로 알려진 EG, BGL, CBH와 같은 cellulase와 BXL 효소가 모두 활성을 띄는 것으로 나타났다. S.
commune가 생산하는 균체 외 효소는 주로 당 분해 효소로 알려진 EG, BGL, CBH와 같은 cellulase와 BXL 효소가 모두 활성을 띄는 것으로 나타났다. S. commune가 생산하는 당 분해효소의 효소활성에 대해 측정한 결과, EG 및 BGL 활성은 76.8 및 56.7 U/㎖으로 가장 높게 나타났고 CBH 활성은 16.7 U/㎖로 EG보다는 낮지만 최적배양조건이 아닌 것을 감안하면 cellulose를 분해하기에는 충분한 효소가 발현되고 있다.
S. commune의 균체 외 효소는 Fig. 1에 나타낸 바와 같이 배양 후 7일째부터 EG, BGL, 및 CBH와 같은 cellulase가 활성을 나타내기 시작하였고, EG와 BGL은 약 11일정도가 경과하면서 활성이 급격히 증가하는 추세를 보였다. 14일이 경과한 이 후에는 효소활성의 증가가 둔화되는 현상을 보여 약 14일정도의 배양에서 cellulase의 최대 활성치를 나타내는 것으로 밝혀졌다.
이러한 결과에서 EG, BGL 및 CBH는 공통적으로 30～40°C 범위 내에서 72시간까지 안정한 것으로 밝혀져 이 범위의 온도조건에서 cellullose를 기질로 당화시험을 시행한 결과 Fig. 4에 나타난 바와 같이 온도 35°C에서 당화율이 67%로 가장 높게 나타났고 그 이상 온도가 증가하면 20% 이하로 당화율이 급격이 감소하는 경향을 보였다.
또한 최대 활성을 나타내는 데 요구되는 최적 pH를 알아보기 위하여 pH 2.0∼8.0범위에서 효소활성을 측정한 결과는 Fig. 5에 나타낸 바와 같이, EG와 BGL은 pH 5.5～6.0에서 CBH, BXL은 모두 pH 5.5에서 효소활성이 가장 높았다.
7 U/㎖, CBH 32 U/㎖로 가장 높은 효소활성을 보였다. Avicel를 첨가한 결과에서도 EG 84.5 U/㎖, BGL 63.5 U/㎖, CBH 20.7 U/㎖로 다른 탄소원에 비해 높은 효소활성이 나타났다. S.
Corn steep liquor, yeast extract, yeast extract/peptone을 사용했을 때에는 각 cellulase 활성이 비교적 크게 나타났으나 urea, (NH₄)₂SO₄, KNO₃, 및 NaNO₃을 이용했을 경우에는 효소활성이 거의 나타나지 않거나 현저하게 낮은 결과를 나타냈다. 한편 yeast extract의 경우 타 질소원에 비해 BGL 및 CBH 활성이 다소 낮은 결과를 보여 고활성의 cellulase 생합성을 위한 S. commune 배양에는 질소원으로서 corn steep powder 또는 yeast extract/peptone 혼합물 첨가가 효율적일 것으로 밝혀졌다.
7배 되는 효과를 보고한 바 있다. 그러나 본 연구에서 사용한 S. commune에서는 thiamine의 경우 오히려 모든 cellulase 활성을 억제시키는 결과를 보였고, 타 비타민들의 경우에도 control에 비해 cellulase 활성에 탁월한 효과를 보이는 비타민이 없었다. 이 같은 결과에 따라 다양한 cellulase 생산을 목적으로 하는 S.
8에 나타내었다. 그 결과, pH 5.5에서 EG 115 U/㎖, BGL 73 U/㎖로 효소활성이 가장 높았고 CBH는 21 U/㎖로 pH 6.0에서 가장 높게 나타났다. pH 4.
0에서 가장 높게 나타났다. pH 4.5～ 5.5 범위에서 pH가 증가함에 따라 효소활성이 급격한 증가 추세를 보이고 pH 5.5～6.5 사이에서 EG와 BGL이 감소하나 CBH는 비교적 안정한 값을 나타내었다. pH 6.
0에서 세 가지 효소활성 모두 급격하게 낮아져 활성이 90% 이상 감소한 것으로 나타났다. 따라서, S. commune 최적 배양에 pH 5.5～6.0이 적정 조건인 것으로 평가되었다.
S. commune에서 생산된 EG, BGL, 및 CBH의 최적온도는 50°C이었으나 시간이 경과하면서 최적온도에서의 열안정성이 감소하였다.
commune의 경우에도 전술한 바와 같이 최적 조건에서 배양했을 때 EG를 비롯한 다양한 cellulase의 활성이 상당한 증가한 결과를 보였다. 이와 같이 높은 효소 활성를 나타낸 효소를 이용하여 각 종의 목질계 바이오매스에 당화시험을 실행한 결과, Table 5에 나타낸 바와 같이 전처리하지 않은 호랑버들나무, 버드나무, 갯버들나무 및 백합나무와 같은 활엽수에 대하여 낮은 당화율을 나타냈고, 상용화 효소에 의한 cellulose 가수분해 산물이 glucose로 분석 되었을 때 42.9%의 당화율로 환원당(45.7%)과의 차이가 크지 않은 것에 비해 본 연구에서 사용된 S. commune 균체 외 효소는 가수분해된 환원당과 glucose 생성량의 차이가 많은 특징이 있는 것으로 나타났다. 이 같은 현상은 본 연구에서 사용된 S.
commune 균체 외 효소는 가수분해된 환원당과 glucose 생성량의 차이가 많은 특징이 있는 것으로 나타났다. 이 같은 현상은 본 연구에서 사용된 S. commune가 균주 특성상 cellulose 분해 과정 중 cellobiose와 같은 올리고머 당을 분해하는 BGL이 EG에 비해 상대적으로 소량 분비됨으로써 당화 산물에 hemicellulose 유래 오탄당이나 육탄당의 이량체 등의 형태로 존재함으로써 glucose량이 상대적으로 작은 값을 가지는 것일 수 있는 것으로 해석되었다. 이 같은 결과로부터 S.
1%의 높은 당화율을 나타냈다. S. commune 균체 외 효소의 cellulose에 대한 이 같은 당화 수준은 Trichoderma reesei 유래 상용화 효소인 Celluclast 1.5L의 동일 농도와 비교했을 때 Celluclast 1.5L (30 FPU/g, glucan, 당화율 : 45.7%)의 약 110% 수준의 당화능을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 목표로 하는 목질 바이오매스에 적절한 S.
7%)의 약 110% 수준의 당화능을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 목표로 하는 목질 바이오매스에 적절한 S. commune 배양조건과 당화기술 등이 적용된다면 보다 당화성능이 향상될 가능성이 높고, 질 높은 효소유전자 개발에 적합한 균주로 평가되었다.
S. commune의 균체 외 효소에는 EG, BGL 및 CBH와 같은 cellulase와 BXL이 함유되어 있고 그 중에서 EG 및 BGL활성이 비교적 높은 활성을 나타낸 것으로 밝혀졌다.
열안정성 시험에서 72시간 경과하여도 효소활성 저하가 보이지 않은 온도조건은 30～40°C범위였다. 그리고 최적 pH는 5.5이었으며 열 안정성을 나타내는 온도범위에서의 적정 pH는 동일한 pH 5.5를 나타냈다.
Cellulase 생산을 위한 S. commune의 최적 배양 조건에 관한 연구 결과, 탄소원으로 천연 cellulose, 질소원으로는 corn steep, 또는 peptone/yeast extract 혼합물, 비타민은 첨가하지 않는 것이 cellulase 효소 활성 증가에 적절한 것으로 밝혀졌다. 또한 탄소원의 최적 첨가 농도는 2% (w/w), 적정 배양 pH 및 온도는 5.
본 연구에서 도출된 최적 배양 조건으로 S. commune를 배양시키고 40배로 농축한 결과, S. commune 균체 외 효소 활성은 EG가 3670.5 U/㎖, BGL과 CBH가 각각 631.9, 398.5 U/㎖, BXL이 15.2 U/㎖로 매우 높은 활성을 나타냈다. 동일한 효소의 Filter Paper Unit도 11 FPU/㎖로 상당히 높은 효소 활성 값을 나타냈다.
최적 배양조건에서 얻어진 S. commune 균체 외 효소로 여러 종류의 섬유질계 바이오매스에 대해 당화 시험을 실행한 결과, 전처리하지 않은 호랑버들나무, 버드나무, 갯버들나무 및 백합나무와 같은 활엽수에 대하여 낮은 당화율을 나타냈다. 천연 cellulose 및 볏짚의 경우에는 각각 50.
7%)에 비교했을 때 상용화효소의 약 110% 수준의 당화능을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 결론적으로 S. commune는 현재 상용화 효소에 비해 높은 당화능을 보유하고 있음으로 향후 목표로 하는 특정 바이오매스에 적절한 배양조건과 당화기술 등의 적용으로 보다 향상된 당화성능에 도달할 가능성이 높고, 목질계 당화 효소의 질 높은 유전자 개발 및 대량생산기술개발로 상용화 가능성이 높은 균주로 평가되었다.
이와 마찬가지로 BGL과 CBH는 45～50°C, 배양 1시간 경과했을 때, 효소활성이 각각 37%, 44% 감소했고, 55°C에서는 배양 후 30분이 경과한 다음부터 효소활성이 90% 이상 크게 감소하는 것으로 나타났다.

후속연구

Jorgensen and Olsson (2006)도 Penicillium brasilianum의 배양에 cellulose 및 스팀 전처리된 가문비목분을 탄소원으로 첨가하여 얻은 균체 외 효소에 EG 및 CBH활성이 증대하여 FPU가 상승한 예가 있다. 탄소원과 관련된 결과에서 상수리나무, 리기다소나무 및 침엽수 혼합 목분과 같이 목재바이오매스를 첨가했을 때 배양액의 pH 7 이상의 약알카리성으로 변화하는 현상이 나타나 실제로 탄소원으로서 목재성분 그 자체보다는 pH변화에 의한 균체 외 효소 생산 억제 가능성도 추후 검토해 볼 필요성이 있는 것으로 고찰하였다.
commune 배양에는 비타민을 첨가의 필요성이 없는 결론을 얻었다. 그러나 본 연구에서 공시 비타민 모두 5 ppm의 농도로 시도한 결과이므로 본 연구에서 밝혀진 최적배양조건에 기초하여 추후 비타민의 농도를 조정하는 등 첨가 조건을 달리할 경우 비타민의 영향을 보다 확실히 밝힐 수 있을 것으로 고찰하였다.
commune가 균주 특성상 cellulose 분해 과정 중 cellobiose와 같은 올리고머 당을 분해하는 BGL이 EG에 비해 상대적으로 소량 분비됨으로써 당화 산물에 hemicellulose 유래 오탄당이나 육탄당의 이량체 등의 형태로 존재함으로써 glucose량이 상대적으로 작은 값을 가지는 것일 수 있는 것으로 해석되었다. 이 같은 결과로부터 S. commune 균주로부터 EG 대비 BGL의 생산을 증대시킬 수 있는 배양조건을 탐색하거나 Jorgensen and Olsson (2006)과 같이 EG활성이 큰 효소액에 BGL을 혼합함으로써 glucose 생성율을 향상시키는 등의 연구개발이 필요한 것으로 고찰되었다. 한편 천연 cellulose 및 볏짚의 경우, 당화된 환원당이 각각 50.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	목질바이오매스의 단점은 무엇인가?	목질바이오매스는 cellulose, hemicellulose, 및 lignin과 같은 주요 구성성분의 결합이 단단하고 복잡한 구조를 띄고 있어 바이오 알콜 발효에 유용한 단당류를 얻으려면 적절한 전처리나 당화과정을 거쳐야 하는 어려움이 있다(Mats and Guido, 2007; Sun and Cheng, 2002). 이 같은 특성으로 인해 당을 둘러싸고 있는 lignin을 효과적으로 제거하거나 cellulose의 결정화도를 감소시키고 효소의 접근성을 증대시키기 위하여 바이오매스 구조를 변화시키는 등 효율적인 당화를 돕는 전처리공정을 거치는 것이 일반적이다(Yang and Wyman, 2008).
	목질바이오매스가 바이오 알콜 발효에 유용한 단당류를 얻기 위해 하는 전처리 공정은 무엇인가?	목질바이오매스는 cellulose, hemicellulose, 및 lignin과 같은 주요 구성성분의 결합이 단단하고 복잡한 구조를 띄고 있어 바이오 알콜 발효에 유용한 단당류를 얻으려면 적절한 전처리나 당화과정을 거쳐야 하는 어려움이 있다(Mats and Guido, 2007; Sun and Cheng, 2002). 이 같은 특성으로 인해 당을 둘러싸고 있는 lignin을 효과적으로 제거하거나 cellulose의 결정화도를 감소시키고 효소의 접근성을 증대시키기 위하여 바이오매스 구조를 변화시키는 등 효율적인 당화를 돕는 전처리공정을 거치는 것이 일반적이다(Yang and Wyman, 2008). 그런데 목질바이오매스에 전처리를 행하지 않고 자연적 목재부후와 같이 cellulose와 hemicellulose의 선택적으로 분해하는 부후균의 cellulase 효소계를 이용한다면 반드시 강력한 전처리 공정을 가볍게 거치면서 자연친화적 효소당화를 유도할 수 있는 가능성이 있다.
	농황산이나 희석 산을 이용하는 산 당화의 단점은 무엇인가?	, 2010). 특히 기존 당화의 상용기술로 농황산이나 희석 산을 이용하는 산 당화가 있으나 이들은 높은 온도에서 실시함에 따라 furfural과 같은 발효 저해물질이 형성되는 등(Ivo et al., 2009; Goldstein and Easter, 1992; Ladisch and Svartzkopf, 1991) 환경오염과 같은 문제를 발생 시킬 뿐 아니라 금속부식을 촉진시키는 결점이 있어 에너지 절감이나 환경적 측면에서 최근 효소를 이용한 당화기술의 시도가 주류를 이룬다고 할 수 있다(Xie et al., 2005; Sheehan, 2001; Yu and Zhang, 2004).

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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