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문제 정의
- 즉, 묘상에 씨고구마를 묻은 후 채묘까지 기간이 40∼60일로 긴 육묘기간을 필요로 하며, 이들 채묘를 이식 후 활착까지도 10∼15일이 소요된다. 따라서 본 연구는 glufosinate-ammonium 저항성 형질전환 고구마에 대한 저항성 유무를 빠르고, 경제적이며, 신뢰할 수 있는 간이진단법을 찾고자 수행되었다.
- 본 연구는 유전자총기법에 의해 생산된 형질전환 고구마를 사용하여 glufosinate-ammonium에 대한 저항성 유무를 빠르고, 경제적이며, 신뢰할 수 있는 간이분석법을 찾고자 수행되었다. 저항성 진단법은 whole-plant 진단법, one leaf 진단법 및 leaf disk 진단법을 사용하였고, 이들 진단법에 의해 glufosinate-ammonium을 처리하고 잎의 피해율과 암모늄 축적량을 조사하였다.
제안 방법
- 위의 진단방법 중에 간편하면서 정확하게 저항성 유무를 평가할 수 있는 one leaf 방법을 사용하여 wild type, 형질전환 control 1라인과 형질전환 7개 라인에 대한 저항성 수준을 조사하였다. 3엽이 전개된 고구마 중에서 제 1엽을 엽병기부에서 자르고 이들 잎에 1mM glufosinate-ammonium를 침적 처리 후 20ml 증류수가 들어 있는 시험관에 옮긴 후 위의 저항성 수준 실험방법과 동일한 생장상에 서 잎의 약해는 처리 후 1일과 5일에 달관 평가하였고, 암모늄 축적은 처리 24시간 후에 조사하였다. 기타 방법은 위의 잎 피해율과 암모늄 축적에 의한 저항성 수준에 관한 실험방법과 동일하게 수행하였다.
- Leaf disk 방법은 와그너폿트에 파종 후 40일 자란 고구마 잎 중에 위로부터 5번째 잎을 사용하여 cork borer 이용하여 만든 절편(직경 4mm)을 증류수 5ml가 들어있는 직경 6cm의 polystyrene petri dish에 10개씩 옮긴 후 저항성 정도를 확인하였다.
- One leaf 방법은 위의 leaf disk 방법처럼 파종 후 40일 자란 고구마 잎 중 위로부터 5번째 잎을 엽병과 함께 자른 후 50ml 튜브에 증류수를 30ml 채우고 엽병을 잠기게 한 후 잎에 제초제를 처리하여 저항성 정도를 확인하였다.
- Glufosinate-ammonium 처리 후 식물은 초기에 황화 및 위조현상이 야기되나 정확한 저항성 유무를 판단하는 데는 결국 처리 후 5일 이상이 필요하다. 따라서 glufosinate-ammonium 처리 후 간편하고 짧은 기간에 저항성 유무를 판단하기 위해 대표적인 형질전환 라인 7171와 wild type을 대상으로 암모늄 축적을 조사하였다(그림 2). Glufosinate-ammonium은 식물에서 암모늄 대사에 중간 효소중의 하나인 glutamine synthetase(GS; E.
- 위의 진단 방법과 조사항목을 고려할 때 bar 유전자를 삽입한 형질전환 고구마에 대한 glufosinate-ammonium 저항성 유무를 판단하는데 가장 적합한 검정방법으로는 one leaf 진단법으로 판단되었다. 따라서 이 진단법이 고구마 엽령별로 저항성의 차이가 있는지를 알아보기 위하여 glufosinate-ammonium 처리 후 잎의 피해와 암모늄 축적정도를 조사하였다(그림 3과 4). 씨고구마로 부터 엽이 10개 전개되었을 때 1, 3, 5, 7, 9엽을 각각 채취하여 3mM glufosinate-ammonium을 처리시 잎의 피해율이 28-40%를 보여 엽령별 유의적인 차이를 보이지 않았다(그림 3).
- 반면에 비형질전환 라인은 완전 고사하였다(자료 미제시). 따라서 형질전환 고구마 라인 중에서 가장 높은 저항성 라인 7171과 wild type를 대상으로 bioassay 방법별 glufosinate-ammonium에 대한 저항성 정도를 확인하였다(그림 1, 표 1). Whole-plant bioassay에서 wild type은 5mM glufosinate-ammonium 처리에서 고구마 잎에 약해가 75% 발생하였으나 형질전환 라인 7171는 약해가 발생하지 않았다.
- 엽령별 glufosinate-ammonium 처리에 의한 저항성 수준과 암모늄 축적을 알아보기 위하여 씨고구마 파종 후 엽령이 10매 전개되었을 때, 1, 3, 5, 7 및 9엽을 채취하여 one leaf 방법과 동일하게 각각의 잎에 glufosinate-ammonium를 처리하였다. 저항성 수준은 처리 후 5일에 그리고 암모늄 축적은 처리 후 2일에 조사하였다.
- 위의 진단방법 중에 간편하면서 정확하게 저항성 유무를 평가할 수 있는 one leaf 방법을 사용하여 wild type, 형질전환 control 1라인과 형질전환 7개 라인에 대한 저항성 수준을 조사하였다. 3엽이 전개된 고구마 중에서 제 1엽을 엽병기부에서 자르고 이들 잎에 1mM glufosinate-ammonium를 침적 처리 후 20ml 증류수가 들어 있는 시험관에 옮긴 후 위의 저항성 수준 실험방법과 동일한 생장상에 서 잎의 약해는 처리 후 1일과 5일에 달관 평가하였고, 암모늄 축적은 처리 24시간 후에 조사하였다.
- 위의 진단방법별 glufosinate-ammonium 처리 후 잎의 약해에 대한 저항성 수준 실험과 동일한 방법에 준하여 실시하였다. Glufosinate-ammonium을 0.
- 이때 15cm 고구마 줄기에 달린 잎은 3매이었다. 이들 줄기를 이식 후 새로운 잎이 2매 전개된 시기(이식 후 14일)에 glufosinate-ammonium 을 처리하여 전식물체 수준에서 저항성 수준을 확인하였다.
- 이들 진단법에 사용된 glufosinate-ammonium(18% 액제)의 처리 농도는 0.1, 0,3, 0.5, 1, 3, 5, 10, 30, 50, 100과 300mM이었고, 처리 한 식물 및 엽절편은 생장상(온도, 25℃; 16시간 일장조건; 광량, 200μmol m-2 s-1)에 옮긴 후 5일째에 달관평가 하였다(0-100, 100; 완전고사).
- 엽령별 glufosinate-ammonium 처리에 의한 저항성 수준과 암모늄 축적을 알아보기 위하여 씨고구마 파종 후 엽령이 10매 전개되었을 때, 1, 3, 5, 7 및 9엽을 채취하여 one leaf 방법과 동일하게 각각의 잎에 glufosinate-ammonium를 처리하였다. 저항성 수준은 처리 후 5일에 그리고 암모늄 축적은 처리 후 2일에 조사하였다. 기타 방법은 위의 잎 피해율과 암모늄 축적에 의한 저항성 수준에 관한 실험방법과 동일하게 수행하였다.
- 파종 후 30/20℃(주/야)의 온도조건, 65/80%(주/야)의 상대습도와 16시간의 일장조건(400μmol m-2 s-1)의 온실에 두었다.
- 본 연구에서 형질전환 7라인 중 glufosinate-ammonium에 저항성 수준이 가장 큰 T3세대 1개 라인(7171)을 예비실험을 통해서 선발하였다. 형질전환 라인 및 비형질전환 라인의 씨고구마를 와그너폿트에 파종하고 파종 후 40일 자란 고구마 줄기를 15cm 간격으로 자른 후 원예용 상토가 충진된 500ml 포트에 이식하였다. 이때 15cm 고구마 줄기에 달린 잎은 3매이었다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 고구마 품종은 한국에서 많이 재배하고 있는 ‘율미’를 국립식량과학원 바이오에너지 작물센터에서 분양받아 사용하였고, 이 품종에 bar 유전자를 삽입하여 glufosinate-ammonium에 저항성인 형질전환 고구마 T3세대 7라인(7149, 7150, 7151, 7155, 7156, 7164, 7171)과 형질전환 control 1라인(7073)을 사용하였다.
- 본 연구에서 형질전환 7라인 중 glufosinate-ammonium에 저항성 수준이 가장 큰 T3세대 1개 라인(7171)을 예비실험을 통해서 선발하였다. 형질전환 라인 및 비형질전환 라인의 씨고구마를 와그너폿트에 파종하고 파종 후 40일 자란 고구마 줄기를 15cm 간격으로 자른 후 원예용 상토가 충진된 500ml 포트에 이식하였다.
- 수확한 씨고구마를 원예용 상토(흥농바이오 상토)가 충진된 1/5,000a 와그너폿트에 파종하였다. 파종 후 30/20℃(주/야)의 온도조건, 65/80%(주/야)의 상대습도와 16시간의 일장조건(400μmol m-2 s-1)의 온실에 두었다.
데이터처리
- 5, 1, 3, 5, 10, 30, 50, 100과 300mM이었고, 처리 한 식물 및 엽절편은 생장상(온도, 25℃; 16시간 일장조건; 광량, 200μmol m-2 s-1)에 옮긴 후 5일째에 달관평가 하였다(0-100, 100; 완전고사). 50% 억제하는 농도(I50)를 구하기 위하여 SAS(2000) 프로그램을 이용하였고, 이때 사용한 회귀식은 아래와 같다.
이론/모형
- 본 연구는 유전자총기법에 의해 생산된 형질전환 고구마를 사용하여 glufosinate-ammonium에 대한 저항성 유무를 빠르고, 경제적이며, 신뢰할 수 있는 간이분석법을 찾고자 수행되었다. 저항성 진단법은 whole-plant 진단법, one leaf 진단법 및 leaf disk 진단법을 사용하였고, 이들 진단법에 의해 glufosinate-ammonium을 처리하고 잎의 피해율과 암모늄 축적량을 조사하였다. Leaf disk 진단법에서 glufosinate-ammonium 처리 후 형질전환 라인 7171의 잎에 대한 약해는 wild type에 비해 1.
성능/효과
- Bar 유전자가 삽입된 형질전환 고구마 라인 중에 7171는 다른 라인에 비해 전식물체 진단법에서 glufosinate-ammonium에 높은 저항성을 보였다. 또한 이 라인은 1.
- 또한 형질전환 고구마의 경우 종자번식 작물과 달리 씨고구마를 다량확보하기 어렵기 때문에 one leaf 진단법을 사용하면 시료량을 절약할 수 있는 장점이 있다. 그러나 저항성 유무를 판단하는데 있어서whole-plant 진단법이 일반적으로 one leaf 진단법에 비해 더 포장조건과 유사한 조건에서 저항성 수준을 확인할 수 있지만, 여러 조건을 고려할 때 형질전환 고구마에 대한 제초제 저항성 유무를 판단하는 데에는 one leaf 진단법이 적합할 것으로 사료된다. Leaf disk 진단법은 one leaf 진단법과 유사하고 시료량을 줄일 수 있는 장점을 가지나 저항성 수준이 크지 않기 때문에 제초제 저항성 형질전환 고구마를 탐색하는 방법으로 적합하지 않았다.
- 5-5mM glufosinate-ammonium 처리에서 암모늄 축적이 아주 적었으나 wild type은 이들 검정방법에서 7171라인에 비해 각각 4-43배와 6-115배 더 많이 축적되었다. 따라서 glufosinate-ammonium 처리 후 잎에 대한 피해 정도를 조사하는 것보다 암모늄 축적을 조사하는 것이 저항성 유무를 빠르고 더 정확하게 진단할 수 있을 것으로 판단되었다.
- 위에서 언급한 저항성 검정에 소요되는 기간은 씨고구마를 파종 후 잎이 언제 전개되는지와 어느 정도 전개된 잎을 사용하느냐에 따라 저항성 소요일수는 달라질 수 있다. 따라서 one leaf 진단법에 의한 암모늄 축적을 조사하여 bar 유전자를 삽입한 형질전환 고구마에 대한 glufosinate-ammonium 저항성 유무를 가장 간편하고 정확하게 측정할 수 있을 것으로 판단된다.
- 그러나 leaf disk 방법은 whole-plant 진단법에 비해 시료량이 적게 들고 보다 빠른 시간에 저항성 유무를 확인할 수 있지만 저항성 수준이 크지 않는 단점을 가지고 있다. 따라서 분석에 소요되는 기간, 시료량, 저항성 수준 등을 고려할 때 이들 진단법 중에서 one leaf 진단법이 저항성 간이테스법으로 가장 적합한 것으로 판단하였다. 즉, one whole leaf 진단법에 의해 잎 패해율을 조사하여 저항성 유무를 판단하는데 30-45일이 소요될 것으로 판단되며, 이 방법에 의해 암모늄 축적을 조사한 경우 잎 피율에 의한 평가보다 4일 이상을 단축할 수 있을 것으로 생각된다.
- 그러나 이 방법은 엽령별 내성 차이가 존재할 수 있어 고구마 엽이 10개 전개되었을 때 1, 3, 5, 7, 9엽을 각각 채취하여 3mM glufosinate-ammonium을 처리시 잎의 피해율과 암모늄 축적을 엽령별로 조사한 결과 유의적인 차이를 보이지 않았다. 따라서 분석에 소요되는 기간, 시료량, 정확성 등을 고려할 때 형질전환 고구마의 저항성을 판별하는데 one leaf 진단법이 가장 적합한 것으로 판명되었다.
- 따라서 이 진단법이 고구마 엽령별로 저항성의 차이가 있는지를 알아보기 위하여 glufosinate-ammonium 처리 후 잎의 피해와 암모늄 축적정도를 조사하였다(그림 3과 4). 씨고구마로 부터 엽이 10개 전개되었을 때 1, 3, 5, 7, 9엽을 각각 채취하여 3mM glufosinate-ammonium을 처리시 잎의 피해율이 28-40%를 보여 엽령별 유의적인 차이를 보이지 않았다(그림 3). 잎의 피해율과 동일한 방법으로 암모늄 축적을 엽령별로 조사하였을 때 glufosinate-ammonium 무처리 상태에서 wild type과 7171간에 유의적인 차이가 없었다.
- 위의 진단 방법과 조사항목을 고려할 때 bar 유전자를 삽입한 형질전환 고구마에 대한 glufosinate-ammonium 저항성 유무를 판단하는데 가장 적합한 검정방법으로는 one leaf 진단법으로 판단되었다. 따라서 이 진단법이 고구마 엽령별로 저항성의 차이가 있는지를 알아보기 위하여 glufosinate-ammonium 처리 후 잎의 피해와 암모늄 축적정도를 조사하였다(그림 3과 4).
- 5-5mM glufosinate-ammonium 처리 후 암모늄 축적은 wild type이 7171에 비해 각각 2-20, 4-43 및 6-115배 더 많이 축적되었다. 이들 3가지 방법 모두 형질전환 고구마에 대한 glufosinate-ammonium 저항성 유무를 판단하는데 가능한 방법이나 one leaf 진단법이 가장 간편하면서 빠른 진단방법이었다. 그러나 이 방법은 엽령별 내성 차이가 존재할 수 있어 고구마 엽이 10개 전개되었을 때 1, 3, 5, 7, 9엽을 각각 채취하여 3mM glufosinate-ammonium을 처리시 잎의 피해율과 암모늄 축적을 엽령별로 조사한 결과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- 이상의 3가지(whole-plant, one whole leaf, leaf disk) 간이 저항성 테스트법을 분석한 결과(표 3), whole-plant 진단법은 glufosinate-ammonium에 대한 저항성 수준을 알아보기 위한 가장 신뢰할 수 있는 방법이나 시료를 준비하는데 장기간이 요구된다. 그러나 leaf disk 방법은 whole-plant 진단법에 비해 시료량이 적게 들고 보다 빠른 시간에 저항성 유무를 확인할 수 있지만 저항성 수준이 크지 않는 단점을 가지고 있다.
- 따라서 분석에 소요되는 기간, 시료량, 저항성 수준 등을 고려할 때 이들 진단법 중에서 one leaf 진단법이 저항성 간이테스법으로 가장 적합한 것으로 판단하였다. 즉, one whole leaf 진단법에 의해 잎 패해율을 조사하여 저항성 유무를 판단하는데 30-45일이 소요될 것으로 판단되며, 이 방법에 의해 암모늄 축적을 조사한 경우 잎 피율에 의한 평가보다 4일 이상을 단축할 수 있을 것으로 생각된다. 위에서 언급한 저항성 검정에 소요되는 기간은 씨고구마를 파종 후 잎이 언제 전개되는지와 어느 정도 전개된 잎을 사용하느냐에 따라 저항성 소요일수는 달라질 수 있다.
- 진단방법에서 최종 선발한 one leaf 진단법을 사용하여 wild type과 형질전환 8라인에 대한 저항성 유무를 평가한 결과(표 2), 1mM glufosinate-ammonium 처리 후 1일 째 잎의 피해는 wild type에서 44% 그리고 7073라인(형질전환 control)에서 25%를 보였다. 그러나 bar 유전자를 삽입한 glufosinate-ammonium 저항성으로 추측되는 형질전환라인은 7156에서 단지 16% 잎 피해를 보였을 뿐 그 밖의 라인에서는 잎 피해를 거의 보이지 않았다.
- 그러나 bar 유전자를 삽입한 glufosinate-ammonium 저항성으로 추측되는 형질전환라인은 7156에서 단지 16% 잎 피해를 보였을 뿐 그 밖의 라인에서는 잎 피해를 거의 보이지 않았다. 처리 후 5일째에는 wild type과 7073에서 잎 피해가 각각 93%와 70%를 보였다. 그러나 형질전환라인 7156은 잎에 대한 피해가 단지 23% 나타났을 뿐 다른 형질전환 라인에서는 나타나지 않았다.
후속연구
- GS 저해는 결국 식물조직에서 암모늄 축적을 야기하고(Petersen와 Hurle 1989; Shelp 등 1992), 이러한 암모늄 축적은 직접적으로 제초제 활성과 관련된다(Petersen와 Hurle 2001). 따라서 glufosinate-ammonium 처리 후 식물 조직에 축적한 암모늄 양에 의해 저항성 유무를 확인 할 수 있을 것으로 생각된다.
- 고구마 포장에서 잡초방제는 높은 생산성을 위한 결정적인 요인이다. 따라서 유전자공학 기술을 적용하여 제초제에 저항성 형질전환 고구마를 개발하여 재배한다면 고구마 포장에 발생한 잡초를 효율적으로 방제 할 수 있어 고구마 수량과 이윤을 증대할 수 있을 것이다. Glufosinate-ammonium 저항성은 식물에 phosphinothricin acetyl transferase(pat) 유전자를 도입함에 의해 부여된다(De Block 등 1987; Shelp 등 1992; Strauch 등 1988; Wild와 Manderscheid 1984; Wild와 Wendler 1993).
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