세포내의 중금속이온의 형광검출은 유기분자화학과 세포생물학분야에서 높은 관심을 갖는다. 이 연구는 형광화학센서(FS)를 이용한 Hg$^{2+}$ 과 Zn$^{2+}$의 세포 내 검출을 목적으로 하였다. FS는 약한 형광을 나타내지만 Zn$^{2+}$와 결합 시에는 강한 방출 형광은 낸다. 2FS/Zn$^{2+}$의 형광증가는 FS-Hg$^{2+}$결합의 형성할 때 Hg$^{2+}$ 1당량만 추가에도 완전한 형광감소를 나타낼 수 있었다. 네가지의 세포주(LLC-MK2, Hela, HT29 and AMC-HN3)는 공촛점 현미경에 대한 형광이미지를 위하여 사용하였다. 세포생존능은 LLC-MK2 세포주에 FS, Zn$^{2+}$, FS-Zn$^{2+}$, Hg$^{2+}$의 처리 후에 평가하였다. FS의 세포독성능은 80%이상의 생존능을 보였다. 본 연구에서는 FS가 살아있는 세포내의 Hg$^{2+}$과 Zn$^{2+}$의 선택적 이미지를 검출할 수 있음을 보여주었다.
세포내의 중금속이온의 형광검출은 유기분자화학과 세포생물학분야에서 높은 관심을 갖는다. 이 연구는 형광화학센서(FS)를 이용한 Hg$^{2+}$ 과 Zn$^{2+}$의 세포 내 검출을 목적으로 하였다. FS는 약한 형광을 나타내지만 Zn$^{2+}$와 결합 시에는 강한 방출 형광은 낸다. 2FS/Zn$^{2+}$의 형광증가는 FS-Hg$^{2+}$결합의 형성할 때 Hg$^{2+}$ 1당량만 추가에도 완전한 형광감소를 나타낼 수 있었다. 네가지의 세포주(LLC-MK2, Hela, HT29 and AMC-HN3)는 공촛점 현미경에 대한 형광이미지를 위하여 사용하였다. 세포생존능은 LLC-MK2 세포주에 FS, Zn$^{2+}$, FS-Zn$^{2+}$, Hg$^{2+}$의 처리 후에 평가하였다. FS의 세포독성능은 80%이상의 생존능을 보였다. 본 연구에서는 FS가 살아있는 세포내의 Hg$^{2+}$과 Zn$^{2+}$의 선택적 이미지를 검출할 수 있음을 보여주었다.
The fluorescence detection of intracellular metal ions are high interest in the fields of organic molecular chemistry and cellular biology. This study was purposed to detection for mercury and zinc in the cell using fluorescent chemosensor (FS). FS exhibits a weak fluorescence, but emits strong fluo...
The fluorescence detection of intracellular metal ions are high interest in the fields of organic molecular chemistry and cellular biology. This study was purposed to detection for mercury and zinc in the cell using fluorescent chemosensor (FS). FS exhibits a weak fluorescence, but emits strong fluorescence upon Zn$^{2+}$ complexation. The increased fluorescence of the 2FS/Zn$^{2+}$ can be quenched completely by addition of only 1 equiv of Hg$^{2+}$ with the formation of complex FS-Hg$^{2+}$. Four cell lines (LLC-MK2, Hela, HT29 and AMC-HN3) were used for fluorescence imaging by confocal microscope. The cell viability MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay was evaluated after cell treatment of FS, Zn$^{2+}$, FS-Zn$^{2+}$, Hg$^{2+}$ on LLC-MK2 cell line. The cytotoxicity of FS was showed to viability over 80%. This study has shown that FS can be detected for selective imaging of Zn$^{2+}$ and Hg$^{2+}$ in living cells.
The fluorescence detection of intracellular metal ions are high interest in the fields of organic molecular chemistry and cellular biology. This study was purposed to detection for mercury and zinc in the cell using fluorescent chemosensor (FS). FS exhibits a weak fluorescence, but emits strong fluorescence upon Zn$^{2+}$ complexation. The increased fluorescence of the 2FS/Zn$^{2+}$ can be quenched completely by addition of only 1 equiv of Hg$^{2+}$ with the formation of complex FS-Hg$^{2+}$. Four cell lines (LLC-MK2, Hela, HT29 and AMC-HN3) were used for fluorescence imaging by confocal microscope. The cell viability MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay was evaluated after cell treatment of FS, Zn$^{2+}$, FS-Zn$^{2+}$, Hg$^{2+}$ on LLC-MK2 cell line. The cytotoxicity of FS was showed to viability over 80%. This study has shown that FS can be detected for selective imaging of Zn$^{2+}$ and Hg$^{2+}$ in living cells.
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문제 정의
본 저자들은 수은과 아연에 높은 선택성을 지닌 유기형광 화학센서를 이용하여 다양한 유기질과 무기질과의 경쟁실험을 통한 높은 선택성과 감도를 측정하고자 하였으며, 형광화학센서를 이용하여 생물학적 적용을 위해 살아있는 다양한 세포주에서 적용을 시도하여 보았다.
세포내의 Hg2+의 검출을 위한 시도는 많은 연구가 이루어지지 않았으며 그 중 최근의 연구는 Ko 등33은 murine C2C12 myelobrasts cell과 rat PC12 cell을 이용하여 본 연구와 같은 저 농도의 센서 50 µM 을 사용하여 Hg2+검출을 하였고 더군다나 zebrafish을 이용하여 Hg2+의 모니터링을 성공적으로 보여준 연구도 있었다. 이 연구에서 보듯이 중금속의 검출을 위한 형광센서개발의 궁극적인 목적은 생물학적 적용인 것이다. 그래서 생물학적 적용의 중요성과 노력이 날로 증가하고 있고, 세포 내에서의 중금속이온 검출이야 말로 적용의 좋은 예가 되고 있다.
제안 방법
5 µM의 2FS/Zn2+ 수용액에 Hg(ClO4)2를 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 2, 3, 4 and 5 µM 농도로 증가시키며 여기파장 355 nm 와 방출파장은 400 nm에서부터 650 nm까지를 지정하여 spectrofluorophotometer 를 사용하여 형광을 측정하였다.
FS (10 µM)과 다양한 금속이온을 acetenitril 과 물의 9:1 비율에 Li+, Na+, K+, Rb+, Cs+, Mg2+, Ca2+, Sr2+, Ba2+, Cu2+, Cd2+, Hg2+, Zn2+ 각각 100 µM를 넣어 여기파장 355 nm과 방출파장은 400 nm에서부터 650 nm까지를 지정하여 spectrofluorophotometer를 사용하여 형광을 측정하였다.
Fig. 1은 형광센서 FS (20 µM)를 acetenitril과 물을 1:1로 혼합한 용액에 Na+, Li+, K+, Cs+, Rb+, Sr2+, Ba2+, Cu2+, Mg2+, Ca2+, Cd2+, Hg2+ and Zn2+와 같은 다양한 금속이온들을 200 µM 혼합하여 흡수파장 스펙트럼을 관찰하였다.
UV/Vis와 형광의 정량실험은 acetonitrile/H2O (9:1) 비율로 만든 용액으로 FS 10 µM, 20 µM, 50 µM 과 금속이온 염화염의 적은 농도를 조제하여 실험하였다.
공촛점 현미경의 투과광도와 조사속도, 밝기, 명암대비를 고정시키고 대조군과 아연과 수은이 함유된 세포이미지를 관찰하였다. exitation 파장을 405 nm 파장대의 blue 다이오드 레이저의 빛을 주입시키고 세포 내에서 발광하는 방출파장의 빛인 BP 505 - 550 nm 필터를 사용하여 형광을 흡수해 내어 세포 내에서의 아연에서 강한 빛을 내는 이미지를 검출하였으며, 수은을 처리한 후에 형광이 감소되는 이미지를 검출하였다.
공촛점 현미경의 투과광도와 조사속도, 밝기, 명암대비를 고정시키고 대조군과 아연과 수은이 함유된 세포이미지를 관찰하였다. exitation 파장을 405 nm 파장대의 blue 다이오드 레이저의 빛을 주입시키고 세포 내에서 발광하는 방출파장의 빛인 BP 505 - 550 nm 필터를 사용하여 형광을 흡수해 내어 세포 내에서의 아연에서 강한 빛을 내는 이미지를 검출하였으며, 수은을 처리한 후에 형광이 감소되는 이미지를 검출하였다.
그 후 배양된 세포주에 dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)(Gibco BRL, Rockville, NY, USA) 를 1 mL를 분주하여 2번 세척하였다. 그 다음 배양용 배지를 각 well당 1 mL씩 분주한 후 FS를 처리하고 수은을 주입하여 살아있는 세포의 형광 이미지는 Zeiss 510 Meta Confocal Microscope (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)를 이용하여 관찰하였다.
본 연구의 FS는 분광학적인 결과와 같이 전처리 없이 시료내 Zn2+와 Hg2+ 농도의 측정뿐만 아니라 다양한 유기물과 무기질과의 경쟁실험을 통한 높은 선택성과 감도를 측정하였다. 이로서 체외적 진단에 유용하게 쓰일 수 있고 다양한 검체에 전처리 필요 없이 바로 Zn2+와 Hg2+ 농도의 측정이 가능하다 할 수 있다.
이런 중금속들의 측정방법으로 현재까지 알려진 분석방법은 크게 파괴법과 비파괴법이 있는데 주로 널리 사용되어지는 것은 파괴법이다. 이런 파괴법으로 산을 이용해 중금속성분을 용해시킨 후 유도결합 플라즈마 질량분석(inductively coupled plasma-mass spectrometry, ICP-MS)나 원자흡광광도계(atomic absorption spectrophotometry, AAS)을 이용하여 분석하는 것이다.10 이런 검사법은 여러 가지 중금속이온을 동시에 검출하는 장점은 있으나 장비의 가격이 비싸고 복잡한 전처리 과정과 오염에도 노출되어있는 것이 단점이며, 가장 큰 단점은 살아있는 생명체의 모니터링을 할 수 없는 것이다.
지수성장기의 배양된 세포들을 0.05% 트립신을 사용하여 회수하였다. 회수된 세포를 105개/mL로 12 well plate에 분주하여 plate에 부착 될 때까지 1 - 2일정도의 배양을 시켰다.
대상 데이터
BRL, Rockville, NY, USA) media 500 mL에 10% fetal bovine serum (Gibco BRL, Rockville, NY, USA) 50 mL과 antibiotic-antimycotic (Gibco BRL, Rockville, NY USA) 5 mL을 섞은 후 세포배양액으로 37℃와 5% CO2조건이 유지되는 CO2 배양기(Forma, USA)에서 배양하였다. 3일마다 배지를 교환하였으며, 20세대 이내의 세포들로 실험에 사용하였다.
Acetonitrile (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, USA) methanol (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, USA), dimethyl sulfoxide (Merck, Mumbai, India), 중금속 이온은 Li+, Na+, K+, Rb+, Cs+, Mg2+, Ca2+, Sr2+, Ba2+, Cu2+, Cd2+, Hg2+, Zn2+를 metal perchloride (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, USA)을 사용하였으며, Hg2+는 metal chloride (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, USA)을 사용하였다.
본 연구에서 사용한 FS는 50 µM 이였는데 이와 비교해 보면 아주 적은 농도로도 Zn2+을 검출 할 수 있었다.
용액의 혼합 과정은 30분 이상 진행되었고, 형광 스펙트럼의 경우 들뜸 파장을 355 nm로 하여 3.0 slit으로 모든 시료를 측정하였고, 방출파장은 513 nm로 측정하였다. 연합상수인 Ka값은 Enzfitter (Elsevier-Biosoft, Cambridge, United Kingdom)의 프로그램에 의해 결정되었다.
적정실험에서의 중금속들의 원액(stock 용액)은 acetonitrile 에 metal perchlorate를 이용하여 1 mM로 제조 하였으며. UV/Vis와 형광의 정량실험은 acetonitrile/H2O (9:1) 비율로 만든 용액으로 FS 10 µM, 20 µM, 50 µM 과 금속이온 염화염의 적은 농도를 조제하여 실험하였다.
이론/모형
바이오센서가 세포에 미치는 독성능을 알아보기 위해 MTT assay방법을 사용하였다. 지수 성장기의 LLC-MK2 세포주를 트립신 처리 후 105/mL이 되게 배지로 희석한 후 96 plate 에 well당 100 µL씩 처리하며 대조군으로 FS를 녹일때 사용된 용매인 acetonitrile/H2O (9:1) 비율로 만든 용액와 배지를 같은 농도로 처리하였다.
성능/효과
그 이유는 메탈로치오나인과 같이 Zn2+가 Hg2+의 독성능으로부터 보호와 Hg2+의 분포를 제어하는 기능을 가졌기 때문이다.27 그리고 FS만이 처리한 군에서도 80%이상의 아주 좋은 생존능을 보였다. 이 결과는 FS를 인체에 미치는 영향을 미루어 볼 수 있고 무해함이 입증되었다.
FS 100 µM만을 처리한 것의 세포생존능은 83%이상의 생존능을 보였으며, FS 25 µM과 Zn2+20µM, Hg2+ 20 µM 를 처리한 세포는 Zn2+, Hg2+의 농도 1.25 µM 농도에서 50%정도의 세포생존능을 보였다.
FS 100 µM을 처리하고 계단희석을 한 결과에서는 95%이상의 세포생존능을 보였다.
3는 농도가 증가할수록 형광의 세기가 감소되고 완전히 형광이 사라진 것으로 나타났다. Fig. 3 insert는 Hg2+를 0.4당량까지 추가시켜서 측정한 결과 0.05당량에서도 90%이상 형광이 감소하였고 0.1당량에서 부터는 평행한 형광의 세기가 나타났다. 이 결과에 따르면 FS는 Hg2+에 매우 감도가 높고 선택성이 높은 센서인 것으로 나타났다.
Zn2+ 80 µM를 처리하고 계단희석을 한 후 하룻동안 배양된 Hela 세포주에서의 세포독성능은 80 µM에서도 53%이상의 세포생존능을 보였다.
1은 형광센서 FS (20 µM)를 acetenitril과 물을 1:1로 혼합한 용액에 Na+, Li+, K+, Cs+, Rb+, Sr2+, Ba2+, Cu2+, Mg2+, Ca2+, Cd2+, Hg2+ and Zn2+와 같은 다양한 금속이온들을 200 µM 혼합하여 흡수파장 스펙트럼을 관찰하였다. 그 결과, 수은과 아연은 450 nm 에서 최대흡수파장을 나타냈고 다른 금속이온들은 410 nm에서 최대흡수파장을 나타냈다.
4는 Hg2+ 이온에서만 형광의 비가 급격히 감소한 것으로 나타났다. 그러므로 FS투여 후 Hg2+이온이 존재시에 Zn2+를 첨가하면 형광이 Hg2+이온에서만 선택적으로 형광이 감소함을 확인하였다.
그리고 Hg2+ 40 µM 와 FS 50 µM를 혼합하여 계단 희석한 결과는 Hg2+농도로 1.25 µM에서 55%이상의 세포생존능을보였다.
그리고 Hg2+를 10 µM씩 각각 넣어주었더니 전과 후의 형광을 513 nm에서 비교하였더니 형광의 비 차이는 없었으나 모든 금속이온들에서 형광강도가 급격히 감소한 것으로 나타났다.
그리고 Zn2+ 40 µM와 FS 50 µM 를 혼합하여 계단 희석한 결과는 Zn2+농도 40 µM에서 24% 이상의 세포생존능을 보였으나 그 이후 농도부터는 50%에 가까운 세포생존능을 보였다.
본 연구에서 사용된 형광센서인 FS는 513 nm에서 Zn2+만이 다른 금속이온 보다 11배의 형광증가를 보이는 것으로 나왔다. Fig.
27 그리고 FS만이 처리한 군에서도 80%이상의 아주 좋은 생존능을 보였다. 이 결과는 FS를 인체에 미치는 영향을 미루어 볼 수 있고 무해함이 입증되었다.
1당량에서 부터는 평행한 형광의 세기가 나타났다. 이 결과에 따르면 FS는 Hg2+에 매우 감도가 높고 선택성이 높은 센서인 것으로 나타났다.
5당량에서는 평형을 이루었다. 이것은 FS가 Zn2+의 정량분석을 위한 매우 좋은 실험방법이고 Zn2+의 지시제로 감도가 높은 것을 확인 할 수 있었다. 일반적으로 수은중독이라 함은 혈액에서는 1.
후속연구
그리고 한가지의 센서로 Zn2+와 Hg2+을 검출이 가능하고 살아있는 세포 내에서 검출을 보여주었다. 그래서 앞으로 임상적 적용을 위해 생물학적 적용의 첫 단계인 살아 있는 세포 내에서 검출뿐만 아니라 동물실험을 통한 더 많은 실험이 필요하다고 사료된다. 감사의 글.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
화학센서는 어떠한 기술인가?
화학센서는 분석물과 감응물질과의 화학적 반응을 통해 분석물을 선택적으로 인지하고 이를 통하여 특정물질을 실시간으로 분석할 수 있는 기술이다. 화학센서를 통해 기본적으로 분자간의 선택적 상호인식작용을 이용하여 질병의 원인이 되는 화학물질에 대한 화학센서의 개발은 질병진단 및 치료의 수단으로 쓰일 수 있다.
파괴법으로 산을 이용해 중금속 성분을 용해시킨 후 유도결합 플라즈마 질량분석이나 원자흡광광도계을 이용하여 분석하는 것의 단점을 극복할 수 있는 방안은 무엇인가?
10 이런 검사법은 여러 가지 중금속이온을 동시에 검출하는 장점은 있으나 장비의 가격이 비싸고 복잡한 전처리 과정과 오염에도 노출되어있는 것이 단점이며, 가장 큰 단점은 살아있는 생명체의 모니터링을 할 수 없는 것이다. 그러나 형광센서를 이용하여 중금속을 검출한다면 다양한 시료에서 검출과 복잡한 전 처리과정과 고가의 장비가 필요 없으며, 높은 선택성과 10-9 몰 농도까지 측정 할 수 있는 뛰어난 감도로 신속히 검출 할 수 있는 장점이 있다. 무엇보다도 살아있는 생명체의 모니터링이 가능하다는 것이다.
높은 이온선택성과 감도를 가진 유기형광 화학센서가 중금속 검출에 용이한 이유는 무엇인가?
11-13 이온 수용체에 형광물질이 접목된 fluoroionophore는 상당수 알려져 있으며, 금속 이온과의 착물형성의 결과로 나타나는 형광 스펙트럼은 photo-induced electron transfer (PET)14,15/charge transfer (PCT),16 metal-toligand charge transfer (MLCT)17,18/energy transfer,19 inter-/intramolecular excited state proton transfer (ESPT),20 fluorescence resonance energy transfer (FRET)21 그리고 excimer/exciplex 형성22과 같은 다양한 메커니즘을 통해 일어나며 그에 따른 분자의 행동에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 높은 이온선택성과 감도를 가진 유기형광 화학센서는 세포 내 침투가 가능하여 인체내의 중금속이온의 국소적 노출 및 인체장기의 축적 시 중금속 검출에 용이하다.
참고문헌 (33)
Silva, A. P.; Gunaratne, H. Q.; Gunnlaugsson, T.; Huxley, A. J.; McCoy, C. P.; Rademacher, J. T. Chem. Rev. 1997, 97, 1515.
Gutsche, C. D. Calixarenes; Royal Society of Chemistry: Cambridge,
Anthony, S. Harrison's principles of internal medicine, eds.;
Food and Drug Administration. Office of Inquiry and Consumer Information. 5600 Fisher Lane, Room 12-A-40, Rockville, MD 20857(301) 827-4420. http://www .fda.gov/fdahomepage.html.
National Institutes of Health. National Institute of Environmental Health Sciences Clearinghouse. EnviroHealth, 2605 Meridian Parkway, Suite 115, Durham, NC 27713. (919) 361-9408.
James, K. Y.; Jiang, Y.; Saari, J. T. J. Nutr. Bio. 2007, 18, 714.
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