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문제 정의
- Resveratrol에 의해 anti-apoptotic 인자인 Bcl-2 및 Bid 단백질의 발현은 감소하였으나, pro-apoptotic 인자인 Bax 단백질 발현은 변화가 없었다. 따라서 본 연구는 resveratrol이 RC-58T/h/SA#4세포에서 caspase 의존형 미토콘드리아 경로에 의해 유도되며, resveratrol은 전립선암 치료제로서 사용 가능성을 시사한다.
- 따라서 본 연구에서는 resveratrol을 전립선 암 예방 치료제로 사용하기 위한 기초 자료를 제공하기 위하여 resveratrol에 의한 RC-58T/h/SA#4 인체 전립선 암세포의 사멸 및 그 기전에 대하여 조사하였다.
- 본 연구에서는 resveratrol을 전립선 암 치료제로의 활용 가능성을 조사하기 위하여 primary 인체 전립선 암세포에 대한 resveratrol의 성장억제 효과 및 그 기전에 대하여 조사하였다. Resveratrol은 RC-58T/h/SA#4 세포에서 농도 및 시간에 의존적으로 세포의 증식을 억제하였으며, IC50 값은 암세포인 RC-58T/h/SA#4, LNCaP, PC-3에서는 각각 245, 320, 340 μM, 전립선 정상세포인 RWPE-1에서는 982 μM로 나타나 정상세포에서보다는 암세포에서 그 독성이 크게 나타났다.
- 본 연구에서는 resveratrol이 RC-58T/h/SA#4 세포의 apoptosis 유도 경로를 확인하기 위하여 Western blot를 통하여 apoptosis를 조절하는 단백질 발현 양상을 조사하였다. Fig.
- 본 연구에서는 resveratrol이 caspase 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 initator caspase에 해당하는 caspase-8, -9와 effector caspase인 capase-3의 활성을 조사하였다.
제안 방법
- 반응이 종료된 dish에서 회수한 세포를 PBS로 3회 세척 후 상등액을 제거한 세포에 lysis buffer(NET buffer, Proteinase K, 20% SDS)를 첨가하여 50℃에서 4시간 동안 반응시킨 후 phenol buffer를 이용하여 DNA를 추출하였다. 2% agarose gel에서 전기영동 하여 DNA ladder를 확인하였다.
- Monolayer로 배양한 세포주를 0.25% trypsin-EDTA 용액으로 처리하여 single cell로 만든 후 최종 농도가 1×106 cells/mL가 되도록 희석하여 6 well plate에 분주한 후 24시간 배양한 후 resveratrol을 50, 100, 300 및 500 μM 농도로 처리하여 24시간 반응시켰다.
- Monolayer로 자란 전립선 암세포주를 0.25% trypsinEDTA용액으로 처리하여 single cell로 만든 후 최종농도가 1×105 cells/mL가 되도록 희석하여 24 well plate에 분주한다음 37℃, 5% CO2 incubator(HERA cell 150, Heraeus, Hanau, Germany)에서 24시간 동안 배양한 후, resveratrol를 50, 100, 300 및 500 μM 농도로 첨가하여 24, 48 및 72시간 반응시켜 암세포 증식 정도를 SRB(sulforhodamine B, Sigma Chemical Co.) 및 cell counting 방법에 의하여 측정하였다(16)
- RC-58T/h/SA#4 세포를 1×106 cells/mL 밀도로 분주한다음 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 후 resveratrol을 100, 300 μM 농도를 처리하여 24시간 배양하였다.
- Resveratrol 처리에 의하여 apoptosis가 유도된 세포의 빈도를 확인하기 위하여 flow cytometry 분석을 실시하였다. Monolayer로 배양한 세포주를 0.
- Resveratrol에 의한 전립선 암세포증식 억제효과가 apoptosis에 의한 것인 지를 확인하기 위하여 Hoechst 332580염색을 통한 핵 관찰, 세포주기 중 sub-G1 함량 및 DNA 절편을 관찰하였다. Fig.
- Resveratrol에 의한 전립선암세포(RC-58T/h/SA#4)의 사멸이 caspase에 의해 의존하여 일어나는 지를 확인하기 위해 RC-58T/h/SA#4의 최종 농도가 1×105 cells/mL가 되도록 희석하여 24 well에 첨가한 후 24시간 배양하였다.
- cells/mL가 되도록 희석하여 24 well에 첨가한 후 24시간 배양하였다. Resveratrol을 처리하기 전에 caspase-family inhibitor(zVAD-fmk)를 처리하고 2시간 후에 resveratrol를 농도별로 첨가하여 24시간 반응 후 trypan blue 염색을 통하여 측정하였다(19).
- Resveratrol의 IC50의 활성이 가장 높은 RC-58T/h/SA#4세포의 증식에 미치는 영향을 조사하기 위하여 50, 100, 300 및 500 μM 농도로 첨가하여 24, 48 및 72시간 동안 반응 후 암세포 증식을 측정한 결과는 Fig. 1과 같다.
- SRB 정량 분석을 하기 전에 대조군과 실험군의 암세포 모양 변화를 200 배율의 위상차 현미경으로 관찰하고 사진을 촬영하였다.
- 암세포를 PBS(phosphate buffered saline)로 2회 세척한 후 70% 에탄올을 첨가하고 4℃에서 하루 동안 방치하였다. 고정된 암세포를 PBS로 세척하고 RNase(0.1 mg/mL)를 첨가하여 37℃ 30분 반응시킨 후 1 mg/mL의 PI(propidium iodide) 용액으로 30분간 염색한 후 Flow cytometer(EPICS XL, Backman Coulter, California, USA)를 이용하여 분석하였다(16).
- 또한 resveratrol 처리에 의한 apoptosis 유도가 caspase 활성과 관련성이 있는 지를 재확인하기 위하여 caspase inhibitor, z-VAD-fmk를 처리하여 cell counting 방법을 통하여 암세포 성장 억제효과를 조사하였다(Fig. 4). 그 결과 resveratrol 처리 전 z-VAD-fmk(10 μM)를 2시간 전 처리한 군은 resveratrol을 단독으로 처리한 군보다 살아 있는 세포의 밀도가 증가하였다.
- 반응이 종료된 dish에서 회수한 세포를 PBS로 3회 세척 후 상등액을 제거한 세포에 50 μL lysis buffer를 첨가하여 용해하고, 각각의 caspase 기질과 함께 37℃에서 2시간 간격으로 incubation하였다. 반응 종료 후 96 well plate용 microplate reader로 405 nm에서 흡광도를 측정하여 활성 정도를 확인하였다.
- incubator에서 24시간 배양한 후 resveratrol을 100, 300 μM 농도를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양이 종료된 well에서 회수한 세포를 PBS로 3회 세척하고 Hoechest 332580을 첨가하여 실온에서 20분 염색한 후 형광현미경으로 관찰하였다(17)
- 세포 용해액과 2×sample buffer를 동량으로 섞어 65℃에서 5분간 끓인 후 12% sodium dodesyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 시행하였다.
- 전립선 암세포의 증식에 미치는 resveratrol의 영향을 정량적으로 측정하기 위하여 LNCaP, PC-3 및 RC-58T/h/ SA/#4의 3종의 전립선 암세포를 대상으로 IC50 값을 측정하였다. 이들 전립선 암세포의 IC50 값의 범위는 245 μM에서 340 μM이었으며, 특히 RC-58T/h/SA#4 암세포에서 IC50 값이 250 μM으로 가장 높았다.
대상 데이터
- incubator에서 계대배양하면서 실험에 사용하였다. Resveratrol(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)은 구입하여 DMSO로 용해하여 본 연구에 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 인체 전립선암세포주인 LNcaP, PC-3 및 DU145는 한국세포주은행(KCLB)에서 분양 받았으며, primary 인체 전립선 암세포인 RC-58T/h/SA#4 및 RWPE1 정상세포는 Center for Prostate Disease Reserch(CPDR, Washington, DC, USA)로부터 분양 받아 10% FBS(fetal bovine serum)를 첨가한 DMEM(Gibco, NY, USA) 배지를 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 계대배양하면서 실험에 사용하였다. Resveratrol(Sigma Chemical Co.
데이터처리
- Significant differences were compared with the control at *p<0.05 by Student’s t-test.
- Significant differences were compared with the control at *p<0.05 using the Student's t-test.
- 대조군과 실험군간의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student's t-test를 이용하여, p value가 0.05 미만일 때 통계적으로 유의성이 있다고 판단하였다.
- 실험결과는 평균 표준편차로 표시하였으며, 각 실험군을대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 대조군과 실험군간의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student's t-test를 이용하여, p value가 0.
이론/모형
- Caspase의 활성은 Colorimetric assay kit(BioVison, CA, USA, 색도 분석법)로 제조사의 방법에 따라 측정하였다. 즉, monolayer로 배양한 전립선 암세포주를 0.
- Resveratrol에 의한 DNA 분절이 일어나는지 알아보기 위하여 Wan 등(18)의 방법에 따라 RC-58T/h/SA#4 세포를 10 mm dish에 5×106 cells/10 mL로 분주하고 resveratrol을 300, 500 μM 농도로 처리한 후 2시간 배양하였다.
성능/효과
- 또한 resveratrol에 의해 유도된 세포 사멸은 핵 응축, sub-G1 함량 증가 및 DNA 분절 현상이 나타나 apoptosis를 유도함을 알 수 있었다. Resveatrol은 caspase-8, -9 및 effector casapse-3 활성을 농도 의존적으로 증가시켰으며, caspase 저해제인 z-VAD-fmk로 caspase의 처리 시 resveratrol에 의한 apoptosis 유도 현상이 유의적으로 감소되어 resveratrol에 의한 RC-58T/h/SA#4 세포의 apoptosis 유도에 caspase가 중요한 역할을 하고 있음을 확인하였다. Resveratrol에 의해 anti-apoptotic 인자인 Bcl-2 및 Bid 단백질의 발현은 감소하였으나, pro-apoptotic 인자인 Bax 단백질 발현은 변화가 없었다.
- Resveratrol은 RC-58T/h/SA#4 세포에서 농도 및 시간에 의존적으로 세포의 증식을 억제하였으며, IC50 값은 암세포인 RC-58T/h/SA#4, LNCaP, PC-3에서는 각각 245, 320, 340 μM, 전립선 정상세포인 RWPE-1에서는 982 μM로 나타나 정상세포에서보다는 암세포에서 그 독성이 크게 나타났다.
- Resveratrol을 100, 300 μM 농도로 처리하여 24시간 후 위상차 현미경으로 관찰한 결과 암세포의 증식이 감소하였으며, culture plate로부터 분리되어 배양액에 부유한 세포는 일정한 모양을 잃고 크기가 줄어 사멸되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 1C)
- 그 결과 resveratrol 처리 전 z-VAD-fmk(10 μM)를 2시간 전 처리한 군은 resveratrol을 단독으로 처리한 군보다 살아 있는 세포의 밀도가 증가하였다.
- 이들 전립선 암세포의 IC50 값의 범위는 245 μM에서 340 μM이었으며, 특히 RC-58T/h/SA#4 암세포에서 IC50 값이 250 μM으로 가장 높았다. 그러나 전립선 정상세포인 RWPE-1의 저해 농도 IC50 값은 전립선 암세포보다 낮아 resveratrol은 암세포의 성장을 선택으로 억제하는 것을 알 수 있었다(Table 1)
- 한편 Gill 등(21)은 전립선 암세포인 PC-3, DU145에 resveratrol을 50 μM 농도를 24시간 동안 처리하여 Hoechst 염색을 통하여 핵의 관찰한 결과 핵 응축 및 절편이 나타났다고 보고하였다. 따라서 resveratrol에 의한 RC-58T/h/SA#4 전립선 암세포의 사멸은 apoptosis 유도와 연관이 있음을 알 수 있었다.
- 또한 resveratrol에 의해 유도된 apoptosis 정도를 정량적으로 분석하기 위하여 세포주기 중 sub-G1기에 속하는 세포의 함량을 flow cytometry를 이용하여 측정한 결과 resveratrol을 처리하지 않은 대조군의 sub-G1 함량이 약 1.54%였으나, resveratrol 처리 시 sub-G1 변화량이 농도 의존적으로 증가하였으며, 100 μM 농도에서 20% 이상 그 함량이 증가하였다(Fig. 2B) 또한 resveratrol을 100 및 300 μM 농도로 처리 시 DNA 분절 현상이 나타났다(Fig. 2C)
- Resveratrol은 RC-58T/h/SA#4 세포에서 농도 및 시간에 의존적으로 세포의 증식을 억제하였으며, IC50 값은 암세포인 RC-58T/h/SA#4, LNCaP, PC-3에서는 각각 245, 320, 340 μM, 전립선 정상세포인 RWPE-1에서는 982 μM로 나타나 정상세포에서보다는 암세포에서 그 독성이 크게 나타났다. 또한 resveratrol에 의해 유도된 세포 사멸은 핵 응축, sub-G1 함량 증가 및 DNA 분절 현상이 나타나 apoptosis를 유도함을 알 수 있었다. Resveatrol은 caspase-8, -9 및 effector casapse-3 활성을 농도 의존적으로 증가시켰으며, caspase 저해제인 z-VAD-fmk로 caspase의 처리 시 resveratrol에 의한 apoptosis 유도 현상이 유의적으로 감소되어 resveratrol에 의한 RC-58T/h/SA#4 세포의 apoptosis 유도에 caspase가 중요한 역할을 하고 있음을 확인하였다.
- 1A). 또한 trypan blue 염색을 통한 결과에서도 Fig. 1A 결과와 같이 농도 및 시간 의존적으로 암세포의 밀도는 감소하였으며, 성장 억제율은 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1B). Resveratrol을 100, 300 μM 농도로 처리하여 24시간 후 위상차 현미경으로 관찰한 결과 암세포의 증식이 감소하였으며, culture plate로부터 분리되어 배양액에 부유한 세포는 일정한 모양을 잃고 크기가 줄어 사멸되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig.
- Aziz 등(20)은 resveratrol을 LNCaP 전립선 암세포와 HPEC 전립선 정상세포에 1, 2, 5, 25 및 50 μM 농도로 24시간 처리하여 trypan blue exclusion 및 MTT 방법으로 세포 성장 억제효과를 비교 측정한 결과 LNCaP 전립선 암세포는 농도 의존적으로 성장이 억제하였으나, HPEC 세포의 성장에는 영향을 미치지 않았다고 보고하였다. 본 연구 결과를 이전의 연구 결과와 비교하였을 때 resveratrol이 전립선 암세포 성장을 억제하는 농도 차이는 있었으나, 전립선 암세포의 성장을 선택적으로 억제하는 효과는 동일하였다. 따라서 resveratrol은 암세포에만 선택적으로 작용하는 전립선 항암제로서 활용할 수 있을 것으로 생각된다.
- 또한 Park 등(6)은 목향 헥산추출물이 LNCaP 전립선 암세포의 사멸의 Bcl-2 family 단백질과의 연관성을 조사한 결과 pro-apoptotic 단백질 중 Bax 단백질 수준은 변화하지 않았으나, Bak 단백질의 발현은 유의적으로 증가하였다고 보고하였다. 본 연구에서도 resveratrol에 의한 Bcl-2 단백질의 상대적인 발현의 증가가 apoptosis 유도와 어느 정도 관련성이 있음을 알 수 있었다.
- 이전의 연구 결과와 본 연구 결과를 종합해 보면 resveratrol에 의한 전립선 암세포의 apoptosis 유도에 caspase가 매우 중요한 역할을 하고 있음을 시사하고 있다.
- 1과 같다. 즉 resveratrol 처리 농도가 증가할수록 농도 의존적으로 유의적인 세포 증식이 감소하였다. Resveratrol에 의한 세포 증식 감소는 resveratrol 100 μM 농도로 처리 후 24시간부터 나타났으며 시간이 경과함에 따라 세포 증식 감소는 더욱 현저히 나타났다(Fig.
후속연구
- 본 연구 결과를 이전의 연구 결과와 비교하였을 때 resveratrol이 전립선 암세포 성장을 억제하는 농도 차이는 있었으나, 전립선 암세포의 성장을 선택적으로 억제하는 효과는 동일하였다. 따라서 resveratrol은 암세포에만 선택적으로 작용하는 전립선 항암제로서 활용할 수 있을 것으로 생각된다.
- 기존의 전립선 암 연구로 사용된 암세포인 LNCaP, PC-3세포는 다른 조직으로 전이된 세포로 각각 상피 및 척추로 전이된 형태의 세포로 순수한 전립선암세포로 보기는 어렵다(15). 하지만 본 연구에서 사용된 인체 전립선 암세포인 RC-58T/h/SA#4 세포는 전이되기 전 형태의 primary cancer 조직으로부터 분리된 세포로서 앞으로 in vitro에서 전립선암 연구를 위해 새로운 전립선 암세포 배양 모델로서 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.
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